La investigación científica, tecnológica y social en la uas (profapi 2009)

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2 La investigación científica, tecnológica y social en la uas (profapi 2009)

3 Los contenidos de la presente publicación son resultado de los proyectos apoyados por el Programa de Fomento y Apoyo a Proyectos de Investigación Primera edición: junio de 2013 D. R. Universidad Autónoma de Sinaloa Ángel Flores s/n, Centro, Culiacán, (Sinaloa) Dirección de Editorial isbn: Prohibida la reproducción total o parcial de la presente publicación, por cualquier medio, sin la previa autorización de los propietarios de los derechos reservados. Editado y hecho en México

4 La investigación científica, tecnológica y social en la uas (profapi 2009) Físico-Matemáticas e Ingenierías Ciencias Químicas, Biológicas y de la Salud Universidad Autónoma de Sinaloa

5 Estudio inmunobiológico de la infección por Gnathostoma en Didelphis virginiana como propagador de la gnathostonosis humana, en Sinaloa, México Edith Hilario Torres Montoya, Sergio Sánchez Gonzales, José Gpe. Rendón Maldonado, Sylvia Paz Díaz Camacho, María de la Cruz Otero Facultad de Ciencias Químico-Biológicas Escuela de Biología Introducción Existen alrededor de 12 especies pertenecientes al género Gnathostoma, aunque no todas infectan al ser humano (Daengsvan, 1981; Miyazaki, 1991). Inicialmente G. spinigerum fue considerado como la especie causal de esta enfermedad hasta que en estudios posteriores se reportaron casos de seres humanos parasitados por G. hispidum, G. doloresi, G. nipponicum y G. binucleatum (Miyazaki, 1991). A finales de los 80 s Nawa et al., y Ogata et al., describieron los primeros casos humanos causados por G. doloresi (Nawa et al., 1989; Ogata et al., 1988). Por otro lado, desde la aparición de los primeros casos clínicos, se describieron distintas especies del género Gnathostoma, como Gnathostoma turgidum, descrita por Stossich en 1902 como parásito de Didelphis azare; 23 años después, Travassos en 1925 la identificó en Brasil alojada en el estómago de Didelphis aurita y en 1931 Dickmans la señaló como parásito de Didelphis virginia, en Lousiana, eua. Chardler en 1932 describió a Gnathostoma didelphis como parásito de Didelphis marsupialis en Texas, eua, la cual fue sinonimizada con D. turgidum por Miyazaki en 1960, al comparar el material con ambas especies, con la que se amplió la distribución de esta última; en México, Caballero y Caballero en 1958 identificaron tres parásitos adultos en tlacuache (Didelphis virginiana) capturado en Jaltenango, Chiapas (Díaz Camacho et al., 1998; Álvarez y Hurtado, 2007). 511

6 512 Ciencias Químicas, Biológicas y de la Salud A pesar de los avances que se han desarrollado respecto al ciclo de vida de Gnathostoma, se desconoce con exactitud el ciclo biológico del parásito endémico en la región del noroeste de México, situación aun más delicada ya que a más de 3 décadas del registro de los primeros casos de esta enfermedad en América, aún existe controversia sobre la especie del parásito endémica en el país, ya que se han descrito casos de la infección en humanos causados por G. binucleatum; sin embargo, diversos estudios que abordan la morfología del parásito y mediante pruebas moleculares, reportan la identificación de otras especies de Gnathostoma en hospederos intermediarios, paraténicos y definitivos infectados con G. binucleatum, G. lamothei y G. turgidum; por lo que el reconocimiento del ciclo de vida, la especie responsable de la zoonosis en la región y su relación con la infección en el humano aún son desconocidas o bien no del todo entendidas. Desde hace varios años se han estudiado diversos hospederos tanto intermediarios como paraténicos y mediante estudios morfológicos y moleculares se ha identificado a Gnathostoma binucleatum como la especie endémica en el noroeste de México, lo cual coincide con otros estudios realizados en el país (Díaz Camacho et al., 1998); sin embargo, esta especie solo se identifica en la forma larvaria; en tanto, se ha determinado que todos los gusanos adultos aislados de hospederos definitivos como Didelphis virginiana pertenecen a la especie Gnathostoma turgidum. Este hallazgo dificulta el entendimiento del ciclo de vida completo del parásito y la relación con la infección en el humano, por lo que es importante identificar la especie presente en Sinaloa, así como los distintos hospederos intermediarios y paraténicos que participan en el ciclo vital. Recientemente Nawa et al. (2008) (Nawa et al., 2009) al analizar la prevalencia de Gnathostoma en tlacuaches (D. virginiana) en el curso de un año reconocieron que la aparición de esta parasitosis coincidía con un ciclo anual en estos animales por lo que se formularon las siguientes preguntas científicas para los eventos de temporalidad con ausencia de gusanos adultos en tlacuaches: es el sistema inmune el responsable de la salud de los animales?, los organismos portadores se dispersan en el ambiente en respuesta a la disponibilidad de agua y alimento? los tlacuaches infectados no logran superar la infección y mueren? Este proyecto contribuirá al entendimiento del ciclo vital de la especie de Gnathostoma de interés zoonótico para Sinaloa y la ra-

7 Estudio Inmunobiológico de la Infección por Gnathostoma zón por la cual solo G. turgidum se desarrolla hasta su fase adulta en D. virginiana, lo que sugiere la participación del sistema inmune del marsupial. Materiales y métodos A) Captura de peces infectados con L3A de Gnathostoma Los peces serán capturados en la misma región de los hospederos naturales utilizando una atarraya con luz de malla de 2.5 cm. Los organismos recolectados se identificarán por especie y género. Cada uno de los organismos serán pesados e identificados con un número de registro, posteriormente se diseccionarán obteniendo secciones delgadas de tejido muscular. El tejido muscular recuperado será macerado y colocado entre dos placas de vidrio de 1 cm de espesor por 10 y 15 cm de ancho y largo respectivamente; la masa de tejido será observada cuidadosamente a contra luz mediante una fuente luminosa de 100 Watts para buscar larvas del parásito que serán aislados y colocados en solución salina isotónica y almacenadas a 4 C hasta su uso. B) Infección experimental G. binucleatum. 12 tlacuaches, mantenidos en cautiverio, serán infectados por vía oral con trozos de carne de pescado infectada con larvas L3A de G. binucleatum. La infección experimental será monitoreada dos veces por mes utilizando los métodos coproparasitoscópicos de Faust y Ritchie con el fin de determinar el tiempo de desarrollo del parásito en su fase adulta. Se llevará un registro de los cambios o alteraciones que pudiesen aparecer en los organismos infectados. G. turgidum. La infección de tlacuaches con larvas L3A de G. turgidum implicará el aislamiento y purificación de los huevos de G. turgidum. Estos huevos serán purificados mediante gradientes de sacarosa, a partir de parásitos hembra adultos aislados de tlacuaches infectados de manera natural y serán empleados para infectar

8 514 Ciencias Químicas, Biológicas y de la Salud copépodos del género Eucyclops cultivados previamente in vitro en nuestro laboratorio. Estos copépodos infectados servirán de alimento para los peces de la especie Dormitator latifrons. Estas larvas L3A serán empleadas para infectar a los tlacuaches, mismos que al igual que en la infección con G. binucleatum, serán sacrificados en los mismos tiempos para monitorear la localización de las larvas, realizar el análisis histoquímico del tejido y para establecer el desarrollo del parásito al estado adulto. C) Análisis coproparasitoscópicos 1. Métodos de concentración de heces con sulfato de zinc (Faust) y por sedimentación (Ritchie) Se preparará una suspensión de material fecal recolectada de los animales en experimentación dos veces por mes con el fin de determinar el desarrollo del parásito adulto, por lo que se emplearán los métodos de concentración de heces de Faust y Ritchie. D) Estudio histoquímico Los animales serán sacrificados mediante dosis elevadas de fenobarbital administrado por vía intravenosa, según el peso de cada animal. El hígado, tejido muscular, esófago y estómago serán extirpados de los animales y serán incubados 24 horas en una solución fijadora de Karnowsky. Posteriormente el tejido será deshidratado e incluido en parafina para realizar los cortes histológicos para el estudio histoquímico. Los cortes de 4 μm de espesor serán teñidos con azul alciano y safranina para identificar las poblaciones celulares en las lesiones causadas por el parásito. Para identificar mastocitos en las muestras del tracto gastrointestinal se emplearán anticuerpos anti-mmcp-1 (Moredum Scientific Ltd.) y para la identificación de células goblet en el tejido intestinal se empleará el marcador de lectinas hpa-biotinilada o fluoresceinada. Mediante el empleo de anticuerpos reportados en la literatura en modelos de marsupiales, se determinará la presencia de péptidos conservados que presentan reacción cruzada

9 Estudio Inmunobiológico de la Infección por Gnathostoma con antígenos relacionados a hla-dr (mhc clase II) y marcadores de células T y B (anti-cd3, -mb-1, -B29, -IgA, HLA-DR) (7). Resultados y discusión A finales de 2009, a partir de 100 peces de la especie Dormitator latifrons, recolectados en el sur del estado, se obtuvieron 200 L3A de G. binucleatum, mediante la técnica de transluminacion. Las larvas se cuantificaron y se mantuvieron dentro del tejido muscular en refrigeración. Para la infección experimental con L3A de Gnathostoma binucleatum se capturaron 10 tlacuaches procedentes de área libre, negativos a esta parasitosis. A cada organismo se le brindaron trozos de pescado (D. latifrons) con 20 L3A de Gnathostoma. Los cambios observados postinfección incluyen un cuadro agudo de emesis pasados tres minutos del consumo, mismo que se mantuvo por espacio de 2 a 3 minutos. Es probable que la emesis haya sido provocada por la acción de las larvas en la parte alta del tubo digestivo, ya que se registraron signos de malestar orofaringeo en los tlacuaches. Posterior al cuadro agudo de vómito, los animales mantuvieron un comportamiento normal. Cuatro de los organismos parasitados murieron por complicaciones postinfección de manera natural en los siguientes 5 meses. A la necropsia el común denominador en ellos fue la presencia de lesiones inflamatorias a nivel de músculo esquelético y tegumentario sin que hubiese un patrón de aparición de dichas lesiones, lo cual sugiere un tipo de afección típica para hospederos accidentales. Los tejidos con presencia de alteraciones patológicas fueron fijados para su análisis histológico. La ausencia de Gnathostoma en esófago y estómago, sumado a la presencia de lesiones músculo-tegumentarias y la ausencia de huevos compatibles con Gnathostoma en el monitoreo de heces quincenal, indica que Gnathostoma binucleatum no utiliza como hospedero definitivo a D. virginiana. En el establecimiento del ciclo biológico in vitro para G. turgidum se ha logrado estandarizar el cultivo de copépodos recolectados en el mismo sitio de donde proceden los peces infectados, estos se alimentan cada 48 h utilizando levadura comercial y fertilizando con

10 516 Ciencias Químicas, Biológicas y de la Salud triple 17 cada 20 días. Así mismo se cuenta con un organismo portador de G. turgidum en cautiverio. La búsqueda de otros hospederos de Gnathostoma incluyen la revisión de 2 tractos digestivos de Lince, Linx rufus, atropellados en la periferia de Culiacán, mismos que han resultado negativos. De igual manera ha incluido 3 mapaches (Procyon lotor) del sur del estado, mismos que han resultado negativos. Por otra parte, a partir de la revisión de 65 ranas (Rana sp) se ha recuperado hasta el momento una larva de Gnathostoma; esta se someterá a un análisis molecular para identificar la especie. El análisis histoquímico se encuentra en curso. Conclusiones Didelphis virginiana se comporta como hospedero accidental o paraténico de Gnathostoma binucleatum. La respuesta defensiva de los tlacuaches implica respuestas de emesis aguda durante la invasión de las larvas y una respuesta inflamatoria migratoria posterior. Se aporta como hospederos intermediario para Gnathostoma a la especie Rana sp., cuya especie está por determinarse. Agradecemos el apoyo económico recibido por parte del Programa de Fomento y Apoyo a Proyectos de Investigación durante la convocatoria 2009.

11 Bibliografía Daengsvang, S. (1981). «A Monograph on the Genus Gnathostoma and Gnathostomiasis in Thailand», en American Society of Tropical Medicine and Hygiene; vol. 30, núm. 4, p Miyazaki, I. (1991). An Illustrated Book of Helminthic Zoonoses. International Medical Foundation of Japan, Fukuoka; p Díaz Camacho, S. P., M. Zazueta Ramos, E. Ponce Torrecillas, I. Osuna Ramírez, R. Castro Velázquez, A. Flores Gaxiola, J. Baquera Heredia, K. Willms, H. Akahane, K. Ogata y Y. Nawa (1998). «Clinical Manifestations and Immunodiagnosis of Gnathostomiasis in Culiacán, México», en Am J Trop Med Hyg, 59(6), pp Álvarez Guerrero, C. y F. Alba Hurtado (2007). «Estuarine Fish and Turtles as Intermediate and Paratenic Hosts of Gnathostoma binucleatum in Nayarit, México», en Parasitol Res, 102(1), pp Nawa, Y, J. Imai, K. Ogata y K. Otsuka. (1989). «The First Record of a Confirmed Human Case of Gnathostoma doloresi Infection», en J Parasitol, 75(1): Ogata, K., J. Imai y Y. Nawa (1988). «Three Confirmed and Five Suspected Human Case of Gnathostoma doloresi Infection Found in Miyazaki Prefecture, Kyushu. Jpn» en J Parasitol, 37: Coutinho H. B., H. F. Sewell, P. Tighe, G. King, J. C. Nogueira, T. I. Robalinho, V. B. Coutinho, V. M. Cavalcanti (1994). «Immunocytochemical study of the ontogeny of the marsupial Didelphis albiventris immune system», en J Anath, 185: Díaz Camacho, S. P., K. Willms, J. G. Rendón Maldonado, M. D. de la Cruz Otero, F. Delgado Vargas, L. Robert Guerrero, S. Antuna Bizarro, V. León Règagnon y Y. Nawa (2008). «Discovery of an Endemic Area of Gnathostoma turgidum Infection Among Opossums Didelphis virginiana in México», en J Parasitol, 6:1. Nawa, Y., S. P. Díaz Camacho, M. de la Cruz, M. L. Zazueta Ramos, A. Bojórquez Contreras, J. Sicairos Félix, S. Campista León, E. H. Torres Montoya, S. Sánchez, R. Guzmán Loreto y F. Delgado Vargas (2009). «Is Gnathostoma turgidum an Anual Parasite of 517

12 518 Bibliografía Opossums? Drastic Seasonal Changes of Infection in Didelphis virginiana in México», en Journal of Parasitology, vol. 95, núm. 4, pp