UNIVERSIDAD SIMÓN BOLÍVAR DECANATO DE ESTUDIOS PROFESIONALES COORDINACIÓN DE BIOLOGÍA

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1 UNIVERSIDAD SIMÓN BOLÍVAR DECANATO DE ESTUDIOS PROFESIONALES COORDINACIÓN DE BIOLOGÍA IMPLANTE DE CÉLULAS MADRE MESENQUIMALES PARA LA REGENERACIÓN DE LESIONES CUTÁNEAS Por: Br. Ariana Eloisa Foinquinos Marin PROYECTO DE GRADO Presentado ante la Ilustre Universidad Simón Bolívar como requisito parcial para optar al título de Licenciado en Biología Sartenejas, Julio de 2012

2 UNIVERSIDAD SIMÓN BOLÍVAR DECANATO DE ESTUDIOS PROFESIONALES COORDINACIÓN DE BIOLOGÍA IMPLANTE DE CÉLULAS MADRE MESENQUIMALES PARA LA REGENERACIÓN DE LESIONES CUTÁNEAS Por: Br. Ariana Eloisa Foinquinos Marin Realizado con la asesoría de: Dr. Jose Cardier (IVIC) Dra. Karem Noris (USB) PROYECTO DE GRADO Presentado ante la Ilustre Universidad Simón Bolívar como requisito parcial para optar al título de Licenciado en Biología Sartenejas, Julio de 2012

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4 RESUMEN ANALÍTICO Las células madre mesenquimales (CMM) son células multipotentes que debido a su gran capacidad de proliferación y diferenciación han sido consideradas para su uso en medicina regenerativa. Numerosos estudios a nivel experimental han demostrado la capacidad de las CMM de inducir regeneración de diversos tejidos. Por otro lado es bien conocido que para lograr una terapia de regeneración efectiva, las matrices que sirven como soporte de crecimiento para implantar estas células en los sitios de lesión juegan un papel importante. En el presente trabajo se propuso evaluar la capacidad de distintas matrices biológicas como vehículos para el implante de CMM de médula ósea humana, así como el potencial de estas células para inducir la regeneración de lesiones cutáneas en un modelo múrido. Para ello, CMM obtenidas de medula ósea humana fueron caracterizadas fenotípicamente y cultivadas sobre distintas matrices para determinar cuál debía ser utilizada para el implante de estas células en modelos in vivo. Finalmente, para evaluar la efectividad del implante de las CMM crecidas sobre membranas de colágeno, se utilizó un modelo experimental de regeneración de lesiones cutáneas en ratones C57BL6. La caracterización de las células utilizadas mediante citometría de flujo confirmó la expresión de marcadores de superficie asociados a CMM y los estudios funcionales demostraron que cultivadas en medios de diferenciación se lograron diferenciar a osteoblastos, condrocitos y adipocitos. Por otro lado, las membranas de colágeno mostraron ser un buen soporte para el cultivo de CMM, y su posterior implante produjo un incremento en el tejido de granulación y fibroplasia, influyendo así en la regeneración de heridas en ratón. En conjunto, estas pruebas preclínicas constituyen la base para el posible uso de esta tecnología en medicina regenerativa de piel. PALABRAS CLAVES: Regeneración, piel, células madre mesenquimales, membrana de colágeno. iii

5 DEDICATORIA A mis queridos padres iv

6 AGRADECIMIENTOS A Dios, por concederme la fuerza y la perseverancia necesarias para llegar hasta lo que hoy soy. A mis padres, por darme su ejemplo de constancia, honestidad, de amor al trabajo y al estudio. Además por brindarme la oportunidad de recibir una educación integral y apoyarme en esta etapa tan importante de mi vida. A toda mi familia, por apoyarme y estimularme en todos los proyectos que he emprendido. A la Universidad Simón Bolívar, mi casa de estudio, por abrirme las puertas a una educación de calidad y estimular en mi la búsqueda del bien común. Al Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas, por brindarme la oportunidad de realizar una investigación de calidad. A mi tutor, el Dr José Cardier (IVIC), por sus horas de dedicación, por compartir sus valiosos conocimientos, por orientarme para que este trabajo se hiciera realidad y sobre todo por la confianza que depositó en mi en todo momento. A mi cotutora, la Dra Karem Noris (USB), por sus cualidades pedagógicas y humanas, su paciencia y por brindarme sus conocimientos y apoyo incondicional para la realización de este proyecto. A los investigadores del IVIC, especialmente a: Dr Romano, Carlos Ayala, Olga Wittig, Dylana Díaz, Ma Elena Márquez, Jahely Fuenmayor, Mayela Mendt, Ingrid Silva, por la orientación y apoyo que me brindaron durante mi estadía en el laboratorio. Así como también v

7 a todo el personal del Laboratorio de Patología Celular y Molecular del IVIC por toda la amabilidad que siempre me mostraron. A todos mis profesores de la USB, en especial a los de la carrera de Lic. en Biología, quienes han contribuido a mi formación académica y científica. A Jesús Ramón Páez, quien con su ejemplo y dedicación despertó en mi el interés por la ciencia y la investigación. A la Sra Ángela de Braca, quien con su aporte fue factor importante en la ejecución de este proyecto. A todo el personal del Departamento de Anatomía Patológica del Hospital Militar por su valiosa colaboración, en especial a la Dra Mariela Zamora. Al personal del Departamento de Patología del Urológico San Román, en especial al Dr. Rubén Parra por su ayuda determinante en el análisis histológico de las muestras. A mis amigos y compañeros, por estar siempre pendientes y proporcionarme su apoyo durante este proceso. A todos los que de una u otra manera han brindado su ayuda y orientación para que esta tesis se hiciera realidad. vi

8 ÍNDICE GENERAL RESUMEN ANALÍTICO... iii DEDICATORIA... iv AGRADECIMIENTOS... v ÍNDICE GENERAL... vii ÍNDICE DE FIGURAS... ix ÍNDICE DE TABLAS... x LISTADO DE ABREVIATURAS... xi INTRODUCCIÓN... 1 Objetivo General... 2 Objetivos específicos... 2 CAPÍTULO I: MARCO TEÓRICO LA PIEL Procesos involucrados en la reparación de piel CÉLULAS MADRE MESENQUIMALES Fenotipo de las CMM Distribución y Fuentes de CMM Funciones de las CMM MATRICES BIOLÓGICAS PARA EL CULTIVO DE CMM CAPÍTULO II: MARCO METODOLÓGICO DISEÑO EXPERIMENTAL PARA CULTIVO CELULAR Obtención de CMM Caracterización de las CMM por Citometría de Flujo Viabilidad Celular y Protocolo de Marcaje Cultivo de CMM en medios de diferenciación Cultivo de CMM sobre distintas Matrices biológicas MODELO IN VIVO DE REGENERACIÓN DE PIEL vii

9 Modelo animal Protocolo para el procedimiento quirúrgico: Anestesia Procedimiento quirúrgico Post-Operatorio Evaluación de las heridas: EVALUACIÓN HISTOLÓGICA Inclusión y coloración de las muestras Análisis de las muestras ANÁLISIS ESTADÍSCOS CAPÍTULO III: RESULTADOS CARACTERIZACIÓN DE LAS CMM EVALUACIÓN DE LAS DISTINTAS MATRICES MODELO IN VIVO DE REGENERACIÓN DE PIEL Evaluación de la regeneración de piel Evaluación histológica de las heridas de piel de ratón CAPÍTULO IV: DISCUSIÓN CONCLUSIONES RECOMENDACIONES REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS viii

10 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Estructura de la piel... 5 Figura 2. Esquema de las fases de la reparación de heridas de piel... 8 Figura 3. Efectos paracrinos de las CMM cultivadas Figura 4. Modelo in vivo de reparación de heridas cutáneas en ratones Figura 5. Morfología de las CMM en cultivo Figura 6. Caracterización de CMM mediante citometría de flujo Figura 7. Caracterización de las CMM por diferenciación celular Figura 8. Cultivo de CMM sobre diferentes matrices Figura 9. Tinción May Grundwald/Giemsa de CMM en membrana de colágeno y placa de cultivo Figura 10. Diferentes sistemas evaluados como potencial modelo múridos de estudio, utilizando ratones C57BL Figura 11. Evolución de la regeneración de herida de piel en ratones Figura 12. Histología de piel normal de ratón Figura 13. Histología de herida en piel con implante de membrana de colágeno Figura 14. Histología de herida en piel tratada con implante de membrana de colágeno/cmm Figura 15. Evaluación de la regeneración de herida de piel en ratones ix

11 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Marcadores para la identificación fenotípica de CMM Tabla 2. Anticuerpos monoclonales para la caracterización de CMM. Marcadores positivos (CD90, CD 166, CD49b, CD73, CD29) y negativos (CD34, CD14, CD45, CD31 y KDR).. 18 Tabla 3. Evaluación histológica de regeneración de heridas de piel x

12 LISTADO DE ABREVIATURAS CM: células madre CME: células madre embrionaria CMM: células madre mesenquimales CMH: células madre hematopoyéticas MC-CMM: medio condicionado de células madre mesenquimales IL- : interleuquina TNF: factor de necrosis tumoral PDGF: factor de crecimiento derivado de plaqueta EGF: factor de crecimiento epidérmico TGF: factor de crecimiento transformante FGF: factor de crecimiento de fibroblastos VEGF: factor de crecimiento vascular endotelial SCF: factor de células madre FACS: citometría de flujo MC: membrana de colágeno xi

13 INTRODUCCIÓN Investigaciones en el área de medicina regenerativa han sugerido que el uso de células madre (CM) podría constituir una alternativa terapéutica para lograr la regeneración de órganos y tejidos comprometidos. Debido a este potencial uso, investigaciones que involucran la utilización de células madre mesenquimales (CMM) han tenido un enorme auge en los últimos años. Las CMM, son células multipotentes que tienen capacidad limitada de auto-renovarse y de diferenciarse in vitro e in vivo en distintos linajes celulares. A diferencia de otras CM, las CMM son de fácil obtención, poseen una baja inmunogenicidad, y su utilizacion plantea pocas controversias éticas, lo que hace que estas células tengan un gran potencial en el área de medicina regenerativa (Hocking y Gibran 2010, Ben-Ami y col 2011, Si y col 2011). Uno de los posibles empleos clínicos de las CMM es su utilización en la reparación y regeneración de lesiones de piel. La reparación de heridas en piel es un proceso complejo que requiere de la participación coordinada de una serie de eventos que incluyen inflamación, reepitelización, angiogénesis, fibroproliferación y síntesis de matriz celular. Cuando el proceso de reparación de una herida de piel ocurre de manera anormal, puede resultar en heridas crónicas que no cicatrizan o en cicatrices hipertróficas, lo que constituye uno de los mayores problemas de salud pública. (Hocking y Gibran 2010). Las patologías asociadas a alteraciones o fallas en el proceso de regeneración o reparación de piel representan un problema en un gran número de pacientes debido a la falta de terapias efectivas y confiables que restablezcan totalmente la funcionalidad del tejido. Debido a esto, es necesaria la búsqueda de nuevas estrategias como el implante de CMM que puedan constituir una alternativa terapéutica para este tipo de patologías cutáneas presentes en gran parte de la población mundial.

14 2 Hoy en día existen numerosas evidencias del gran potencial que tienen las CMM en la regeneración de piel. Diversos autores sugieren que CMM aplicadas a heridas de ratones diabéticos o normales promueven mucho más rápido el cierre de las lesiones y además incrementan la reepitelización, formación de tejido de granulación y la angiogénesis (Wu y col 2010). Por otro lado, es bien conocido que el método de implante de estas células en el lugar de la lesión juega un papel importante en la eficacia de estas terapias para la regeneración de piel. Diversas matrices biológicas de colágeno o fibrina han sido usadas para crecer e implantar CMM en tejidos. Recientes investigaciones se basan en el estudio de las propiedades de los principales componentes de la matriz extracelular, como el colágeno y fibrina, con la finalidad de desarrollar matrices óptimas que permitan el implante de CMM en áreas lesionadas (Wu y col 2010). El hecho de contar con matrices que garanticen la viabilidad, proliferación y mantenimiento de la capacidad de diferenciación de las CMM constituye uno de los retos más importantes en medicina regenerativa para la aplicación de estas células. Estos estudios son de suma importancia ya que permiten evaluar el posible uso de esta tecnología en pacientes con lesiones de piel agudas o crónicas que afectan su salud y calidad de vida. En este orden de ideas, se plantearon los siguientes objetivos: Objetivo General Evaluar la capacidad de distintas matrices biológicas como vehículos para el implante de CMM de médula ósea humana, así como el potencial de estas células para inducir la regeneración de lesiones cutáneas en un modelo múrido. Objetivos específicos - Caracterizar las CMM mediante estudios de citometría de flujo y evaluar su potencial de diferenciación hacia los linajes osteocítico, adipogénico y condrocítico.

15 3 - Evaluar cualitativamente la capacidad de distintas matrices biológicas (membranas de colágeno, gel de colágeno, membrana amniótica y microperlas de colágeno) como vehículos para el implante de CMM de médula ósea humana en modelos in vivo. - Evaluar la capacidad de regeneración de los implantes de CMM, mediante la evaluación histológica de las heridas de piel de ratón a los 12 días del tratamiento.

16 CAPÍTULO I MARCO TEÓRICO 1.1. LA PIEL La piel es el órgano más extenso y multifuncional de nuestro cuerpo. Esta no solo constituye una barrera pasiva a la pérdida de fluido y lesiones mecánicas, sino también protege contra agentes patógenos del ambiente. Su grosor puede variar según la región donde se encuentre, de manera que en los parpados mide 0.1 mm y en la planta de los pies mide 2 mm. La piel está constituida por una capa superficial o epidermis, que se adhiere a la capa más interna o dermis a través de la membrana basal. Por debajo de la dermis, la piel está constituida por tejido conectivo y tejido graso (Powell 2006, Kumar y col 2010). Desde la epidermis algunas estructuras denominadas anexos como los folículos pilosos, glándulas sudoríparas y glándulas sebáceas, descienden hasta dermis subyacente. Esta proyección de la capa epidérmica y la dermis superficial subyacente demuestra la maduración progresiva de las células basales en células epiteliales escamosas queratinizadas del estrato córneo. Los queratinocitos son células importantes que se encargan de la producción de algunas citoquinas y factores de crecimiento, de queratina y de vitamina D. Otras células como melanocitos dendríticos (que contienen melanina), células de Merkel, células de Langerhans y células nerviosas también están presentes en la piel. La dermis subyacente también contiene vasos sanguíneos, fibroblastos (que producen proteínas de matriz extracelular tales como colágeno, elastina y fibronectina), mastocitos y células dendríticas, potencialmente importantes en la inmunidad cutánea y la reparación. En la Figura 1 se presenta un esquema de las estructuras de la piel (Powell 2006, Kumar y col 2010).

17 5 Figura 1. Estructura de la piel: (e) Epidermis, (d) dermis, (h) folículos pilosos, (g) glándulas sudoríparas, (s) glándulas sebáceas, (b) células basales, (sc) células epiteliales escamosas queratinizadas del estrato córneo, (m) melanocitos dendríticos, (lc) células de Langerhans, (v) vasos sanguíneos, (f) fibroblastos, (mc) mastocitos perivasculares y dendrocitos (dc) (Tomado de Kumar y col 2010) Procesos involucrados en la reparación de piel Al perderse la integridad y continuidad de la piel, debido a alguna lesión o enfermedad, ocurren una serie de procesos complejos para su reparación. El proceso de reparación de una herida se inicia inmediatamente después de ocurrida la lesión y comprende tres fases: la inflamación, la proliferación y la maduración (Figura 2) (Kondo e Ishida 2010). La inflamación es una respuesta de defensa innata de los organismos a cualquier tipo de lesión. Este proceso por lo general conlleva a la reparación de tejidos y a la restauración de sus funciones. La respuesta inflamatoria incluye la presencia de plasma sanguíneo, células circulantes, vasos sanguíneos y constituyentes extracelulares y celulares del tejido conectivo. Esta respuesta inflamatoria se puede dividir a su vez en una fase aguda o temprana que es de poca duración (minutos, algunas horas, pocos días) y se caracteriza por una exudación de fluido y proteínas de plasma y la migración de neutrófilos al sitio de herida; por otro lado la fase crónica, que puede perdurar semanas, se caracteriza por la infiltración de macrófagos y linfocitos (Enoch y Leaper 2007, Li y col 2007, Benavides 2008, Kumar y col 2010).

18 6 El proceso inflamatorio agudo consta de un proceso vascular y otro celular. El vascular incluye la alteración del diámetro de los vasos sanguíneos y cambios estructurales en la microvasculatura, y el celular implica la llegada y participación de leucocitos al área lesionada. Los leucocitos, en especial los neutrófilos, tienen una función importante en la migración al área comprometida por la lesión, eliminación de partículas extrañas y remoción del tejido dañado. En el sitio de la herida, se secretan una gran cantidad de moléculas asociadas al proceso inflamatorio agudo y ocurre la fagocitosis. Es importante destacar que durante el proceso inflamatorio agudo se puede desencadenar la cascada de coagulación y agregación plaquetaria. Las plaquetas juegan un papel fundamental en la iniciación de la reparación de un tejido, al liberar factores de crecimiento y quimiotácticos importantes en la cascada de reparación de lesiones (Enoch y Leaper 2007, Li y col 2007, Benavides 2008, Kumar y col 2010). A diferencia de la inflamación aguda, la crónica se caracteriza por ser de larga duración y por la infiltración de células mononucleares como macrófagos, linfocitos y células plasmáticas al sitio de lesión. Los macrófagos juegan un papel fundamental en la producción y secreción de factores de crecimiento y citoquinas que inician el proceso de proliferación celular (proliferación de fibroblastos, deposición de colágeno y angiogénesis). Entre ellos encontramos interleuquina 1 (IL-1), factor de necrosis tumoral (TNF, por sus siglas en ingles: Tumour necrosis factor ), interleuquina 8 (IL-8) y factores de crecimiento como el factor de crecimiento derivado de plaqueta (PDGF, por sus siglas en ingles: Platelet-derived growth factor ), factor de crecimiento epidérmico (EGF, por sus siglas en ingles: epidermal growth factor ), factor de crecimiento transformante β (TGF- β, por sus siglas en ingles: Transforming growth factor-β ) y factor de crecimiento de fibroblastos (FGF, por sus siglas en ingles: Fibroblast growth factor ) (Enoch y Leaper 2007, Li y col 2007, Kumar y col 2010). En el caso de daños en la piel, y producto del proceso inflamatorio, es de suma importancia que el tejido dañado sea reparado mediante: 1) proliferación celular que dará lugar a los procesos de granulación, reepitelización y fibroplasia y 2) mediante el proceso de remodelación del tejido y deposición de colágeno. La fase de proliferación celular (en el proceso de reparación de la piel) comienza alrededor del día 3 de la lesión y dura entre 2 a 3 semanas. Esta fase se caracteriza por la formación de nuevos vasos sanguíneos

19 7 (angiogénesis), por la migración de fibroblastos y la reepitelización del sitio de la herida. La angiogénesis o neovascularización ocurre debido a la migración y proliferación de células endoteliales hacia el sitio de la herida, y posteriormente la organización de estas células en vasos capilares nuevos (Enoch y Leaper 2007, Li y col 2007, Kumar y col 2010). Este proceso es regulado fundamentalmente por el Factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF, por sus siglas en ingles: Vascular endothelial growth factor ) y las angiopoyetinas (Ang) los cuales son secretados principalmente por las células madre mesenquimales o estromales. Otros factores como PDGF y TGF-β también están implicados en la activación del proceso de angiogénesis. Otros estudios demuestran que la hipoxia cumple un papel fundamental en el proceso de regeneración ya que regula factores de crecimiento como el VEGF (Williamson y Harding 2004, Lee y col 2009, Kumar y col 2010). La formación de tejido de granulación (que es un indicativo de la reparación de la lesión) comienza aproximadamente entre el día 3 y 5 después de la lesión y presenta un aspecto rosado, suave y granular en la superficie de la herida. Este tejido se caracteriza histológicamente por la presencia de fibroblastos y nuevos vasos sanguíneos. Algunos estudios han demostrado que el VEGF no solo promueve angiogénesis, sino también es el responsable de la permeabilidad vascular, lo cual ocasiona una gran deposición de proteínas plasmáticas como fibronectina y fibrinógeno en la matriz extracelular, proporcionando un ambiente provisional para el crecimiento de fibroblastos al sitio de la lesión (Kumar y col 2010). La migración de fibroblastos ocurre hacia el cuarto día y está modulada por una serie de factores tales como PDGF, TGF-β, EGF y FGF y citoquinas como IL-1 y TNFα. La fuente de estos factores son las plaquetas y otras células inflamatorias como los macrófagos. Una vez en el sitio de herida, los fibroblastos producen proteínas de matriz como colágeno y proteoglicanos que son esenciales para la maduración y remodelación del tejido (Enoch y Leaper 2007, Benavides 2008, Kumar y col 2010). A pocas horas de producida la lesión se liberan, a nivel local, factores (EGF, TGF-β y FGF) que estimulan la migración y proliferación de células epiteliales, con lo cual se da inicio al proceso de reepitelización. Es así como alrededor de las primeras 12 horas, se puede observar una actividad mitótica en las células epiteliales basales de los bordes de las heridas. Luego estas células migran a través de la matriz provisional y cuando se encuentran estas células, una nueva membrana basal se regenera. El crecimiento y diferenciación posterior de las células epiteliales restablece el epitelio estratificado (Enoch y Leaper 2007, Li y col 2007).

20 8 Como resultado de los procesos descritos anteriormente, ocurre la maduración y remodelación del tejido, caracterizado por la formación de una estructura de colágeno y fibras de elastina, las cuales reemplazan el tejido de granulación. Así mismo en esta fase se sintetizan proteoglicanos y glicoproteínas. El producto final de todo este proceso es la cicatrización del tejido. La formación de colágeno durante la transición desde la granulación del tejido hasta la formación de la cicatriz depende de la síntesis continua y catabolismo del colágeno. La degradación del colágeno en la herida es controlada por metaloproteínas secretadas por los macrófagos, por las células epidérmicas y fibroblastos (Kondo e Ishida 2010). Figura 2. Esquema de las fases de la reparación de heridas de piel: Fase de inflamación, proliferación celular y maduración (Tomado de Kondo e Ishida 2010). En algunos casos la reparación de una herida ocurre de una manera anormal, dando lugar a un proceso de reparación irregular de las estructuras de la piel, pudiendo resultar en heridas crónicas que no se cicatrizan o en heridas que forman cicatrices hipertróficas. Las terapias actuales para tratar heridas crónicas no son suficientemente efectivas y por lo general no se

21 9 logra conseguir la regeneración efectiva de la piel. Sin embargo, en el caso de heridas de piel, se ha reportado que el implante de células madre mesenquimales (CMM) puede tener un impacto importante en todas las fases de la reparación arriba mencionadas incluyendo la inflamación, reepitelización, granulación, angiogénesis y en la remodelación del tejido, con lo cual se puede generar el proceso de reparación y regeneración de la piel (Hocking y Gibran 2010) CÉLULAS MADRE MESENQUIMALES Las células madre (CM) son células indiferenciadas que tiene la capacidad de auto renovación y diferenciación en una gran diversidad de linajes celulares. En general se pueden clasificar como células madre embrionarias (CME) y células madre adultas. De acuerdo a la capacidad de diferenciación las CM pueden clasificarse en totipotente, pluripotente y multipotente. La CME totipotente es el zigoto capaz de originar un individuo completo y las pluripotentes son las que se obtienen del blastocisto que son capaces de formar las tres capas germinales. Por otro lado, las células madre que se encuentran en tejidos y órganos totalmente desarrollados, las células madre adultas u órgano específicas, son células multipotentes capaces de diferenciarse en distintos linajes celulares. Ejemplos de células madre adultas son las células madre hematopoyéticas (CMH) y las células madre mesenquimales (CMM) (Salem y Thiemermann 2009). Las CMM, también denominadas células estromales, son células multipotentes, procedentes de la capa germinal mesodérmica, que tienen la capacidad de auto-renovación limitada y diferenciación, in vitro e in vivo, en distintos linajes celulares tales como adipocitos, osteoblastos, condrocitos y mioblastos (Salem y Thiemermann 2009, Hocking y Gibran 2010, Ben-Ami y col 2011) Fenotipo de las CMM Las investigaciones con CMM se remontan a los años 1970, cuando se describió un tipo de célula no hematopoyética, presente en la medula ósea de diferentes especies que puede formar

22 10 colonias del tipo de fibroblastos in vitro y adherirse al plástico de frascos de cultivo. Actualmente existe un gran debate en cuanto a cómo hacer referencia a este tipo de células, definiéndose como células estromales o CMM. La Sociedad Internacional para Terapia Celular (ISCT) ha tratado de resolver este dilema proponiendo tres criterios mínimos para definirlas (Meirelles y col 2009, Hocking y Gibran 2010): a) Adherencia al plástico de frascos de cultivo. b) Expresión de los marcadores de superficie CD (por sus siglas en ingles cluster of differentiation ): CD105, CD73 y CD90 y ausencia de expresión de marcadores hematopoyéticos CD45, CD34, CD14, CD11b, CD79a, CD19 (Tabla 1). c) Capacidad para diferenciarse en osteoblastos, adipocitos y condrocitos bajo diferentes condiciones de cultivos. Tabla 1. Marcadores para la identificación fenotípica de CMM (Tomado de Salem y Thiemermann 2009) Distribución y Fuentes de CMM Las CMM fueron aisladas por primera vez de medula ósea, sin embargo se encuentra en casi todos los órganos y tejidos incluyendo el adiposo, periostio, membrana sinovial, líquido sinovial, los músculos, dermis, dientes, el hueso trabecular, el cartílago articular y sangre del

23 cordón umbilical. Hasta la fecha, la medula ósea, el tejido adiposo y la sangre del cordón umbilical han sido consideradas como las principales fuentes de CMM (Si y col 2011) Funciones de las CMM Las CMM tienen distintas funciones dependiendo del tejido u órgano en el que se encuentre. Estas células son mejor conocidas por ser el nicho hematopoyético en la médula ósea de los huesos. Así, las CMM de la médula ósea proporcionan el microambiente adecuado para las células hematopoyéticas, regulando la auto-renovación, proliferación y diferenciación de las CMH (Chen y col 2008, Meirelles y col 2009). Ha sido reportado que las CMM juegan un papel importante en la respuesta a ciertas enfermedades y lesiones en distintos tejidos. Algunos estudios sugieren que la capacidad de las CMM de secretar factores solubles que alteran el microambiente de un tejido, sobrepasan a la capacidad de diferenciación en el proceso de reparación de tejidos. Entre estos factores se encuentran factores de crecimiento como TGF, VEGF, PDGF, interleuquinas como IL-1, IL- 3, IL-6, IL-7, IL-11 y factores de células madre (SCF, por sus siglas en inglés stem cell factor ), y diferentes quimioatrayentes (Figura 3) (Chen y col 2008, Meirelles y col 2009). Gracias a estos factores, las CMM cumplen efecto inmunomodulador ya que suprimen muchas de las funciones de los linfocitos T, B y NK (por sus siglas en ingles natural killer ) y afectan la actividad de las células dendríticas. Además cumplen un efecto quimioatrayente y angiogénico ya que los factores que secretan pueden modular funciones de la respuesta inmunitaria y migración celular (Chen y col 2008). En la Figura 3 se presentan algunos de los factores producidos por las CMM y los efectos que estos cumplen.

24 12 Figura 3. Efectos paracrinos de las CMM cultivadas: Aunque el número de moléculas conocidas para mediar la acción paracrina de las CMM aumenta cada día, hay varios factores que han demostrado ser secretados por las CMM cultivadas. El efecto inmunomodulador de las CMM consiste en la inhibición de la proliferación de linfocitos T CD8 + y CD4 + y células natural killer (NK), la supresión de la producción de inmunoglobulinas por las células plasmáticas, la inhibición de la maduración de las células dendríticas (DC) y la estimulación de la proliferación de las T reguladoras células. Además, las CMM estimulan la angiogénesis local, por la secreción de moléculas de la matriz extracelular como VEGF, bfgf e IL-6, y también estimulan la mitosis de las células progenitoras o células madre de tejidos específicos por la secreción de SCF, M -CSF y angiopoyetina-1. Finalmente, un grupo de al menos 15 quimiocinas producidas por las CMM pueden provocar la migración de leucocitos al área lesionada, lo cual es importante en el mantenimiento del tejido normal (Tomado de Meirelles y col 2009). Las CMM, a diferencia de las CME y otras células madre órgano especificas como las CMH o células madre neuronales, tienen algunas ventajas como: ser de fácil obtención, tener pocas controversias éticas y poseer una baja inmunogenicidad (bajo riesgo de inmuno rechazo). Es importante resaltar que gracias a todas estas capacidades (diferenciación en distintos tejidos, capacidad imnunomoduladora, quimioatrayente, y al hecho de ser poco inmunogénicas), las CMM podrían tener un gran potencial en el área de medicina regenerativa. Además ellas tienen un alto potencial de proliferación in vitro y pueden ser fácilmente manipuladas para su diferenciación antes de un trasplante (Pountosa y col 2007, Si y col 2011).

25 13 Hoy en día existen numerosas evidencias del gran potencial que tienen las CMM en la reparación y regeneración de tejidos. En el caso de la piel, se ha demostrado que CMM aplicadas a heridas de ratones diabéticos o normales promueven mucho más rápido el cierre de las lesiones y además incrementan la reepitelización, formación de tejido de granulación y la angiogénesis (Wu y col 2010). Aunque se sabe que los tratamientos con CMM aceleran el proceso de reparación y regeneración de lesiones cutáneas, aun no está claro el o los mecanismos mediante el cuales ocurre, por lo que existen controversias al respecto. Hasta el momento hay datos que sugieren que los mecanismos responsables de los beneficios terapéuticos de las CMM pueden ser tanto la diferenciación de estas células, como también los efectos paracrinos de los factores solubles producidos por las CMM (Smith y col 2009, Hocking y Gibran 2010). Algunos autores han reportado que las CMM pueden diferenciarse a distintos tipos de células involucradas en la regeneración de lesiones como células endoteliales, pericitos, queratinocitos. Sin embargo, aunque estos autores lograron comprobar que las CMM logran permanecer en las heridas en los primeros días y diferenciarse en distintos linajes, datos actuales sugieren que la contribución de la diferenciación de las CMM es limitada debido a que el injerto y supervivencia de las CMM en el sitio de la herida no es el óptimo. Algunos estudios señalan que solo un pequeño porcentaje de las células que originalmente se implantan son capaces de permanecer en el sitio bajo condiciones óptimas, y de ese porcentaje que sí permanece, pocas se diferencian a tejido funcional. Nuevas evidencias sugieren que los beneficios terapéuticos de las CMM se pueden explicar con mecanismos alternativos (Falanga y col 2007, Wu y col 2007, Sasaki y col 2008, Parekkadan y col 2010). Debido a esto, se propone que la señalización paracrina (a través de moléculas que solo afectan a células diana en su proximidad) es el principal mecanismo responsable de los beneficios de las CMM en las respuestas a las lesiones durante los procesos de inflamación, angiogénesis y fibroproliferación. Esta hipótesis es apoyada por las observaciones que el medio condicionado de CMM (medio que contiene los factores segregados por las CMM en cultivo) también propicia la reparación de tejidos. Se pudiese sugerir entonces que los principales beneficios terapéuticos de las CMM se basan en su contenido molecular (Hocking y Gibran 2010, Kumar y col 2010, Parekkadan y col 2010, Wu y col 2010).

26 1.3. MATRICES BIOLÓGICAS PARA EL CULTIVO DE CMM 14 Optimizar el protocolo de implante en terapias de regeneración de tejido es esencial para su eficacia. Algunos de los métodos reportados para colocar CMM en el sitio de la lesión incluyen tanto inyecciones como implantes tópicos, utilizando una gran variedad de vehículos que incluyen matrigel, gel de colágeno, polímeros de fibrina, membrana amniótica, entre otros. Algunos estudios demuestran que un método eficiente para colocar CMM es a través de spray de fibrina. Sin embargo una de las matrices más usadas son las fabricadas a base colágeno (Hocking y Gibran 2010). El colágeno es el material más comúnmente utilizado para el cultivo de células. Es una proteína estructural que compone gran parte de los organismos vivos (humano o animal). El colágeno es esencial para crear la estructura física de los cuerpos y como parte de la matriz extracelular sirve de soporte para el re-arreglo de las células (Itoh y col 2001, KOKEN.CO 2005). En particular, los cultivos se realizan a menudo sobre esponjas de colágeno, geles de colágeno, laminas de colágeno, entre otros. Recientemente han surgido estudios en los que se utilizan membranas de atelocolágeno como soporte para el implante de estas células (Itoh y col 2001). El atelocolágeno es un colágeno solubilizado por proteasas que mantiene las mismas propiedades físicas del colágeno natural. Sin embargo el atelocolágeno no presenta telopéptidos responsables de la inmunogenicidad (baja) presente en el colágeno, por esta razón la antigenicidad del atelocolágeno es aun más baja que el colágeno normal (KOKEN.CO 2005). Las membranas de atelocolágeno han resultado ser matrices óptimas para el cultivo de células debido a las siguientes razones (KOKEN.CO 2005): -Son desarrolladas con colágeno bovino dérmico tipo I, altamente purificado para estudios de cultivos de tejido.

27 15 -Gracias a que la membrana es completamente permeable a moléculas pequeñas, los cultivos celulares pueden absorber nutrientes, excretar desechos metabólicos y liberar productos bioquímicos a través de la membrana. El sistema por lo tanto permite el mantenimiento a largo plazo de las células similar a un sistema in vivo. -Este sistema es particularmente útil para la diferenciación celular y los estudios de ingeniería de tejido que involucren el mantenimiento de órganos artificiales como piel, páncreas y otros. El hecho de contar con matrices artificiales, obtenidas de biomateriales, que garanticen la viabilidad, proliferación y mantenimiento de la capacidad de diferenciación de las CMM constituye uno de los retos más importantes para la aplicación de estas células en medicina regenerativa.

28 CAPÍTULO II MARCO METODOLÓGICO Toda la fase experimental fue realizada en el Laboratorio de Patología Celular y Molecular del Centro de Medicina Experimental del Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC) DISEÑO EXPERIMENTAL PARA CULTIVO CELULAR Esta sección contiene la metodología de los experimentos in vitro realizados con la finalidad de caracterizar las CMM de médula ósea humana y evaluar la capacidad de distintas matrices para favorecer el implante de CMM en modelos in vivo Obtención de CMM Las CMM fueron obtenidas a partir de células mononucleares de un aspirado de médula ósea de la cresta ilíaca de un paciente identificado como 003 (en tratamiento por razones traumatológicas) de la Unidad de Terapia Celular del IVIC. Todos estos procedimientos fueron realizados previa aprobación de Comisiones de Bioética Institucionales y del consentimiento informado del paciente Caracterización de las CMM por Citometría de Flujo La citometría de flujo es una técnica utilizada para la inmunofenotipificación de una gran variedad de células, incluyendo células de sangre periférica y de médula ósea. Esta técnica mide características ópticas y fluorescentes de una sola célula (o cualquier otra partícula), sus propiedades físicas como tamaño (representado por el ángulo de dispersión frontal de la luz) y

29 la complejidad interna (representada por el ángulo derecho de dispersión de la luz) (Brown y Wittwer 2000). 17 Para medir distintas componentes de una partícula o célula se utilizan sondas fluorescentes. Los anticuerpos que están conjugados a tinciones fluorescentes pueden unirse a proteínas específicas en la membrana celular o adentro de la célula. Cuando las células marcadas con estos anticuerpos pasan por una fuente de luz, las moléculas fluorescentes se excitan a un estado superior de energía. Cuando regresan a su estado no excitado, los fluorocromos emiten una energía ligera hacia longitudes de onda mayores. La utilización de múltiples fluorocromos, con longitudes de onda de excitación similares y diferentes longitudes de emisión (o colores), permite medir distintas propiedades celulares al mismo tiempo). Algunos flourocromos mas utilizados son ficoeritrina (PE) de color anaranjado emisión 576nm y fluoresceína (FITC) de color verde (emisión máxima 520nm) que absorben a 490nm (Brown y Wittwer 2000). Dentro de un citómetro de flujo, las células en suspensión son sacadas a una corriente o flujo creada por una envoltura de líquido isotónico que crea un flujo laminar y luego un haz de luz monocromática, por lo general de un láser, intercepta a las células. La luz emitida se recoge a través de la óptica que dirige la luz a una serie de filtros y espejos dicroicos que aíslan las bandas de longitud de onda en particular. Las señales de luz son detectadas por los tubos fotomultiplicadores y digitalizadas para el análisis en computadora. La información se presenta en histogramas o dot plots de dos dimensiones (Brown y Wittwer 2000) Viabilidad Celular y Protocolo de Marcaje Con la finalidad de caracterizar fenotípicamente las células obtenidas del paciente 003 por citometría de flujo, se procedió a descongelar un vial de CMM en el pasaje 3 y sembrarlas en un frasco de cultivo T75 con 15 ml de medio α MEM Chang. Cuando los cultivos alcanzaron una confluencia celular mayor o igual al 80%, se retiró el medio del frasco de cultivo y se realizaron lavados con Buffer Fosfato Salino (PBS, por sus siglas en inglés: Phosphate Buffer Saline ). Posteriormente se agregaron 4 ml de Tripsina-EDTA (0,5 g/l de tripsina, 0,2 g/l EDTA Na/L) por 5 minutos a 37 C. Transcurrido el tiempo, se colectaron las células y se centrifugaron a 1300 rpm por 7 minutos. Se realizaron dos lavados con PBS y

30 18 luego de la última centrifugación se resuspendieron las células en medio de cultivo para realizar la determinación de la viabilidad celular con Azul de Tripano. El Azul de Tripano es un colorante utilizado para el contaje de células. Este colorante traspasa la membrana de las células muertas tiñiéndolas de azul, mientras que las células vivas se observan refringentes. El contaje celular se realizó en cámara de Neubauer y el número de células se determinó mediante la siguiente fórmula: N células/ml = n total de células x factor de dilución x 10 4 Para la preparación de los viales de citometría se utilizaron 2 x 10 4 células por vial. El volumen de células correspondientes se diluyó en PBS. Se les colocó 1,5 µl de anticuerpo a cada vial (Tabla 2). Tabla 2. Anticuerpos monoclonales para la caracterización de CMM. Marcadores positivos (CD90, CD 166, CD49b, CD73, CD29) y negativos (CD34, CD14, CD45, CD31 y KDR). Numero Anticuerpo Fluorocromo 1 Auto IgG 2a/ IgG1 FITC/PE 3 CD34/CD14 FITC/PE 4 CD45/CD166 FITC/PE 5 CD49b/CD90 FITC/PE 6 CD73 PE 7 CD29 PE 8 CD31/KDR FITC/PE Los viales se incubaron durante 40 min en frio y oscuridad (nevera 4 C). Luego se les añadió 1ml de PBS y se centrifugaron por 5 min a 1500 rpm. Se descartó el sobrenadante y se les colocó aprox. 300µl de PBS-albumina sérica bovina 0,1% a cada vial. Se corrieron eventos por vial en el Citómetro de Flujo (FACSCalibur, Becton-Dickinson). Para el análisis de los datos se realizaron tanto histogramas como dot plots en el programa CellQuest Cultivo de CMM en medios de diferenciación Luego de obtener y caracterizar las CMM mediante citometría de flujo, se procedió a expandir y diferenciar estas células en distintos medios de cultivo celular: medio basal

31 αmem Chang para expansión de CMM y medios de diferenciación osteogénico (Gibco ), condrogénico (Gibco ) y adipogénico (Gibco ). 19 Para esto se sembraron 5x10 3 CMM en medio basal por duplicado para cada condición a ensayar y se expandieron hasta que alcanzaron una confluencia mayor o igual al 50%. Posteriormente se retiró el medio basal de los pozos y se colocaron 500 µl de cada uno de los distintos medios de diferenciación, y se mantuvieron los pozos control cultivados con medio basal (medio αmem Chang). Luego de transcurridas 4 semanas con los diferentes tratamientos, todos los pozos sembrados se fijaron con paraformaldehido al 4% se tiñeron con las siguientes coloraciones: CMM en medio Osteogénico: coloración Rojo de Alizarina (tiñe núcleos de mineralización de color rojo o naranja). CMM en medio Condrogénico: coloración Azul Alciano (tiñe proteoglicanos de la matriz extracelular de los condrocitos de color azul). CMM en medio Adipogénico: coloración Oil Red (tiñe las vacuolas lipídicas de color rojo) Cultivo de CMM sobre distintas Matrices biológicas Para evaluar el efecto de las CMM sobre el modelo animal a estudiar, se evaluaron 4 diferentes tipos de matrices sobre las cuales se cultivaron 3x10 5 células. Las matrices fueron: membrana de colágeno comercial, Atelo Cell (ATC) (CM-6 KOKEN, Japón), membrana amniótica humana conservada en glicerol (preparada en el Laboratorio de Patología Celular y Molecular, IVIC, en fecha 02/02/2009), microperlas de colágeno comerciales (Atelo Cell KOKEN, Bovine dermis 100~400 µm) y gel de colágeno comercial (Atelo Cell IPC-50 KOKEN, Bovine dermis 5mg/ml). Todas las matrices se mantuvieron en cultivo 37 C y 5% CO 2, hasta que las células alcanzaron un grado de confluencia igual o mayor a 80%. Como las matrices evaluadas debían mostrar una excelente adhesión y proliferación celular, y además ser adecuadas para llevar a cabo los estudios in vivo, se seleccionó la membrana de colágeno, siendo esta la que presentaba estas condiciones. También se realizaron tinciones

32 May-Grundwald/Giemsa (Pittenger y col 1999) para realizar observaciones de las células en las membranas MODELO IN VIVO DE REGENERACIÓN DE PIEL La capacidad de las CMM cultivadas sobre membranas de colágeno de inducir regeneración de piel fue evaluada en un modelo experimental de regeneración de lesiones cutáneas en ratones C57BL6 normales. Previamente se realizó una estandarización para determinar qué modelo era el adecuado para nuestro estudio (ver Capítulo III Resultados, sección 3.3), y se determinó que el sistema adecuado es el que se describe a continuación: Modelo animal Se utilizaron ratones C57BL6, machos, de 7 semanas de nacidos, provenientes del Bioterio Central del IVIC Protocolo para el procedimiento quirúrgico: Anestesia Se procedió a anestesiar cada ratón con una mezcla de Ketamax /Sedanxil. La dosis de anestesia aplicada varió en función de los pesos de los individuos utilizados, cuyos cálculos se realizaron de la siguiente manera: Ketamax : Ketamina (50 mg/ml). Dosis: 150 mg/ Kg. Kx ratón = X Kg 150 mg 1 ml 1 Kg 50 mg Siendo Kx ratón la dosis de Ketamina aplicada por ratón y X el peso del ejemplar.

33 21 Sedanxil : Xilacina (20mg/ml)- Dosis: 10 mg/ Kg. Sx ratón = Z Kg 10 mg 1 ml 1 Kg 20 mg Donde Sx ratón se refiere a la dosis de Xilacina aplicada por ratón y Z es el peso del ejemplar. Para preparar 1ml de anestesia para 10 ratones: 570 µl de Ketamina µl de Xilacina µl de solución salina= 1 ml de anestesia Procedimiento quirúrgico Luego de anestesiados, los ratones fueron rasurados en la parte dorsal con una afeitadora eléctrica y depilados con crema Veet (crema depilatoria corporal). Se lavó el sitio depilado con suficiente agua y alcohol (Figura 4A). Se procedió a realizar una lesión de 2x2cm en el dorso de cada animal. Se removió epidermis, dermis y subcutáneo con una tijera quirúrgica. Para evitar que las heridas de los ratones cerraran por contracción, se suturaron los bordes de las heridas a la fascia muscular con 4 puntos para asegurar la posición (Culiton 5-0, aguja C16-16mm. Suturas Hirsch. Suturas estériles no absorbibles USP Nylon negro monofilamento 45cm. Distribuidora Medisuty) (Yang y col 2011) (Figura 4B). Para cubrir las heridas se colocó un apósito Tegaderm (Nexcare Tegaderm 3M. Apósito transparente estéril, libre de látex, impermeable) adherido a la piel con un adhesivo permanente (Galiano y col 2004, Yang y col 2011) (Figura 4C). Las condiciones de cada grupo evaluado fueron las siguientes: 1) Control (n=3): apósito Tegaderm 2) Control membrana de colágeno (n=3): MC + Tegaderm 3) Experimental (n=3): MC/CMM + Tegaderm

34 A B C 22 Figura 4. Modelo in vivo de regeneración de heridas cutáneas en ratones Post-Operatorio Los ratones se mantuvieron en el laboratorio con calefacción en jaulas individuales hasta que se despertaron. Luego se trasladaron al bioterio del Centro de Medicina experimental del IVIC con suministros de agua y comida ad libitum. Se les colocó vía intraperitoneal analgésico Dipirona durante tres días seguidos post-operación Evaluación de las heridas: Se observaron las heridas de los ratones diariamente durante 12 días para hacerles seguimiento. Al final de este periodo, se realizó un registro fotográfico de las heridas antes de retirar los tratamientos para las evaluaciones posteriores EVALUACIÓN HISTOLÓGICA Una vez sacrificados los animales por dislocación cervical, se realizaron cortes con un bisturí del área de lesión y de piel normal para la evaluación histológica.

35 Las muestras se conservaron en 4% paraformaldehido a 4 C. Luego se realizaron las histologías de cada tejido para evaluar la regeneración de los mismos Inclusión y coloración de las muestras Los cortes histológicos se realizaron en el Departamento de Anatomía Patológica del Hospital Militar en Caracas. Las muestras permanecieron durante una noche en un procesador de tejido (Citadel 1000 ) en el cual pasan por un tratamiento de formol, alcohol, xilol y parafina. Las muestras se sacaron de las cajetas de inclusión y se incluyeron en un molde con parafina (máquina Histocentre 2 ). Se dejaron enfriar hasta que quedó el bloque de parafina con la muestra. Luego con un micrótomo de deslizamiento (Leica ) se realizaron los cortes transversales de las muestras, se colocaron en un baño de flotación con gelatina y luego se transfirieron a las láminas portaobjeto. Las láminas se colocaron en la estufa. Luego de 20 minutos en la estufa, las láminas se colocaron en una batería de xiloles y alcoholes: Se desparafinaron en 3 cambios de xiloles, luego se transfirieron a alcohol para eliminar restos de agua y deshidratarlas. Se lavaron con agua corriente. Se colocaron en Hematoxilina por 5 min. Se lavaron de nuevo y se colocaron en Carbonato de litio. Luego se lavaron nuevamente con agua, luego alcohol y finalmente se colocaron en Eosina Floxina diluida en alcohol para eliminar exceso de colorante. Por último se colocaron en xilol Análisis de las muestras Las muestras fueron observadas al microscopio óptico convencional por dos patólogos para evaluar la presencia de células inflamatorias (polimorfonucleares), posible tejido de granulación (vasos sanguíneos y fibroblastos), reepitelización y fibroplasia ANÁLISIS ESTADÍSCOS Se realizó una prueba t de student en el programa R para determinar si los resultados obtenidos fueron estadísticamente significativos (p<0,05).

36 CAPÍTULO III RESULTADOS Las CMM usadas en este trabajo fueron obtenidas a partir de médula ósea de pacientes del Hospital Universitario de Caracas, previa aprobación por el Comité de Bioética de esta institución y del consentimiento firmado por el paciente. En cada pasaje celular fueron congeladas una fracción de estas células a -70ºC. En este proyecto se usaron CMM obtenidas del tercer pasaje celular CARACTERIZACIÓN DE LAS CMM Al observar la morfología de las CMM en cultivo y caracterizarlas mediante citometría de flujo se obtuvieron los siguientes resultados: Figura 5. Morfología de las CMM en cultivo con medio basal (100X).

37 En la Figura 5 se puede observar la morfología fibroblastoide característica de las CMM adherentes cultivadas en medio basal. 25 El análisis citométrico mostró que las células obtenidas expresaban marcadores de superficie asociados a CMM. En la Figura 6 se puede observar la expresión de los marcadores CD166, CD49b, CD90, CD73 y CD29 típicos de CMM. Así mismo se observa la ausencia de expresión de marcadores hematopoyéticos (CD34, CD14, CD45) y endoteliales (CD31 y KDR). A B Figura 6. Caracterización de CMM mediante citometría de flujo. A) Expresión de marcadores de CMM: CD90, CD 166, CD49b, CD73, CD29. B) Ausencia de marcadores de células hematopoyéticas (CD34, CD14 y CD45) y endoteliales (CD31 y KDR).

38 26 Al tratar estas células con cada uno de los medios de diferenciación se evidenció que podían diferenciarse hacia los linajes esperados. En la Figura 7 se puede observar que las células, luego de las tinciones especifica, confirman la presencia de núcleos de mineralización para el linaje osteogénico (Figura 7A), vacuolas lipídicas en las células tratadas con medio adipogénico (Figura 7B) y finalmente se observan algunas células que presentan la tinción alcian blue, característica de condrocitos (Figura 7C). A Medio Osteogénico Medio Basal B Medio Adipogénico Medio Basal C Medio Condrogénico Medio Basal Figura 7. Caracterización de las CMM por diferenciación celular. A) CMM tratadas con medio osteogénico (100X). B) CMM tratadas con medio adipogénico (100X). C) CMM tratadas con medio condrogénico (tratamiento 400X y control 200X).