TERAPIA CELULAR: PERSPECTIVAS DE USO EN PACIENTES CANINOS

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1 Sistema de Revisiones en Investigación Veterinaria de San Marcos TERAPIA CELULAR: PERSPECTIVAS DE USO EN PACIENTES CANINOS REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Autor: MV Wilbert Quispe Mayta Universidad Nacional Mayor de San Marcos Facultad de Medicina Veterinaria

2 TABLA DE CONTENIDO 1. PRESENTACIÓN INTRODUCCIÓN CELULAS MADRES PERSPECTIVAS DE LA TERAPIA CELULAR EN LESIONES MEDULARES CONTRADICCIONES EN LA UTILIDAD DE LAS CÉLULAS MADRE CONCLUSIONES LITERATURA CITADA... 12

3 TERAPIA CELULAR: PERSPECTIVAS DE USO EN PACIENTES CANINOS MV Wilbert Quispe Mayta 1. PRESENTACIÓN En la actualidad la terapia celular regenerativa es una herramienta en potencia para el tratamiento de enfermedades degenerativas y adquiridas en diferentes modelos animales, en la presente revisión se fundamenta las bases teóricas consideradas para la aplicación de este tipo de tratamiento, desde la clasificación de las células madre, las principales características observadas, los recursos disponibles para su aislamiento así como su potencial uso como agentes terapéuticos en la regeneración de tejidos dañados con especial énfasis en la regeneración de células neuronales en lesiones de medula espinal. Finalmente trata algunos aspectos sobre lo contraproducente del uso de estas células y su efecto potencial en la generación de cáncer. 2. INTRODUCCIÓN Naturalmente el organismo está diseñado para reparar sus tejidos dañados y renovar los tejidos viejos, este mecanismo está a cargo de células especializadas denominadas células madre o steam cells. Es así que siguiendo este modelo celular, y aprovechando las características de este linaje de células se dio inicio al estudio de la terapia regenerativa celular, que a la actualidad es un tratamiento potencial, evidenciándose en trabajos experimentales sobre patologías degenerativas y adquiridas, como infarto miocárdico, daño hepático y regeneración de heridas. Una de las patologías de importancia en la práctica clínica veterinaria es el ocasionado por

4 lesiones de la medula espinal como resultado generalmente de trauma ya sea endógeno (hernias discales) o exógeno (accidentes traumatológicos), cuyo pronóstico, dependiendo del grado de lesión, generalmente es malo (paraplejía o muerte). En esta revisión presentamos las aplicaciones actuales sobre la regeneración con terapia celular en lesiones medulares, utilizando el perro como modelo experimental y sus perspectivas de uso en la clínica veterinaria. 3. CELULAS MADRES Las células madre o stem cells, son aquellas células indiferenciadas dotadas simultáneamente de la capacidad de auto regeneración y de originar células hijas, que finalmente se convierten a través de la diferenciación, en tipos celulares especializados, las células madre tienen tres propiedades: a) no son células diferenciadas, b) producen células que se pueden diferenciar en diversos linajes y c) tienen capacidad de auto renovación. Muchos de los términos usados para definir una célula madre, obedecen además, al comportamiento de éstas en condiciones in vivo o in vitro, de ahí que existan diversas clasificaciones. De acuerdo al tipo de tejido que originan, existen cuatro tipos de células madre: totipotentes, pluripotentes, multipotentes y unipotentes. El término totipotencial (del latín totus, que significa completo) hace referencia al potencial que tienen estas células de generar un embrión completo (tejido embrionario y extraembrionario). Pluri (del latín plures, que significa muchos o varios) es utilizado para describir las células madre pluripotentes que pueden dar origen a progenitores que forman cualquiera de las tres capas germinales embrionarias: mesodermo, endodermo y ectodermo. Las células madre multipotenciales son aquellas que pueden dar origen a precursores relacionados solamente con una de las tres capas embrionarias; por ejemplo, células madre que dan origen a tejidos derivados exclusivamente del endodermo como tejido pancreático o pulmonar. La última categoría corresponde a las células madre unipotenciales, que corresponden a las células que solo pueden generar células hijas que se diferencian a lo largo de una sola

5 línea celular (Rodríguez, 2005; Riaño et al., 2007; Escobedo-Cousin y Madrigal, 2011). Inicialmente se creyó que el potencial de diferenciación de una célula estaba restringido únicamente a su tejido de origen; sin embargo, desde hace algunos años, diversos estudios demostraron que las células madre de un tejido específico estaban en la capacidad de generar células de un tipo celular especializado diferente al de su origen embrionario, es así que las células madre adultas están en la capacidad de adquirir ciertas características fenotípicas y funcionales como respuesta a los cambios y estímulos del microambiente donde sean implantadas, esta habilidad de cambio actualmente se conoce como fenómeno de plasticidad. Bajo condiciones in vitro es probable que las células madre presenten una morfología diferente y la expresión genética de diversos linajes por la exposición a factores inductores (Riaño et al., 2007); esto explica porque la mayoría de las células madre de un tejido específico que no ha sufrido ningún tipo de agresión o daño son del tipo unipotencial y son las responsables de la fase fisiológica de auto-renovación tisular, donde la cantidad de células perdidas es igual al número de nuevas células. Sin embargo, si el tejido es alterado en su estructura básica a través de un fenómeno lesivo y se requiere de diversos tipos celulares para su reparación, se pueden activar células del tipo pluripotencial para reparar el daño (Rodríguez, 2005). Las células madre se pueden clasificar también de acuerdo a su origen, pueden proceder del embrión o de un organismo adulto, de ahí que se hable de células madre embrionarias y de células madre adulta o somática. Las células madre embrionarias pueden ser obtenidas a partir de las primeras etapas de formación del embrión cuando el óvulo fecundado es una esfera compacta o mórula, éstas son entonces precursores totipotenciales con capacidad de proliferar indefinidamente in vitro. El primer reporte acerca del aislamiento de células madre embrionarias provenientes de blastocistos humanos data de 1994 cuando se determinó que estas células in vitro se diferencian espontáneamente en estructuras multicelulares conocidas como cuerpos embrionarios, que contienen elementos de las tres capas germinales a partir de las cuales se pueden forman varios tipos de células como cardiomiocitos, neuronas y progenitores hematopoyéticos entre otros (Rodríguez, 2005; Riaño et al., 2007).

6 a) Células madre embrionarias Se considera que las células de origen embrionario provenientes de la masa interna del blastocisto y se pueden propagar de manera indefinida. Las células embrionarias están en la capacidad de tomar rutas de diferenciación in vivo hacia linajes celulares de diferentes tejidos (células de las tres capas embrionarias) y algunos linajes bajo condiciones in vitro. Sin embargo, el uso de estas células provenientes de embriones humanos con fines investigativos, y su posible uso en terapia regenerativa es motivo de controversias por consideraciones éticas (Riaño et al., 2007). Las células madre de origen embrionario, como vimos tienen el potencial de generar cualquier tipo de tejido, siendo entonces un atractivo recurso para la terapia de trasplantes, medicina regenerativa e ingeniería de tejidos, sin embargo para poder utilizar este recurso potencial, es necesario ser capaces de controlar la diferenciación embrionaria y directamente el desarrollo de estas células en sus diferentes vías. Es así que las ciencias básicas en el campo del desarrollo embrionario, la diferenciación de células madre e ingeniería de tejidos ofrecen información relevante sobre las principales vías y mecanismos que regulan la diferenciación de células madre, teniéndo avances significativos en el modelado de la gastrulación in vitro y en la inducción eficiente de endodermo, mesodermo, ectodermo y muchos de sus derivados. Estos hallazgos han llevado a la identificación de varias vías el control de la diferenciación de células madre embrionarias en derivados mesodérmicos como mioblastos, células mesenquimales, osteoblastos, condrocitos, adipocitos, así como los derivados hemangioblásticos. El reto actual es demostrar la utilidad funcional de estas células, tanto in vitro como en modelos preclínicos de diferentes procesos degenerativos (Mahmood et al., 2011). Por otro lado, se tiene que las células madre embrionarias para ser clasificadas como tales deberían de expresar los siguientes marcadores de expresión celular: fosfatasa alcalina, NANOG y Oct4, y puedan ser diferenciadas in vitro hacia linajes de endodermo, mesodermo y ectodermo (características típicas de células madre embrionarias humanas y de ratón), su capacidad de diferenciación in vivo, es decir la formación de teratomas en ratones inmunodeficientes o contribución a los animales quiméricos, queda aún por demostrar (Schneider et al., 2008)

7 b) Células madre mesenquimales Las células madre mesenquimales (MSCs) también llamadas células madre estromales, por estar presentes inicialmente en el estroma de la médula ósea, constituyen una población totalmente diferente de las células madre hematopoyéticas, pudiéndose diferenciar en múltiples linajes celulares de origen mesodérmico. Su origen está dado principalmente en las células mononucleares de médula ósea. Inicialmente se aislaron de los aspirados de médula ósea, mediante la propiedad física que poseen de adherirse a superficies plásticas, formando así las conocidas UFC-F (unidades formadoras de colonias fibroblásticas). Sin embargo, la capacidad de adherencia a superficies plásticas por sí sola no es suficiente para la purificación y caracterización de las MSCs (Riaño et al., 2007). Las MSCs, son células madre adultas multipotentes presentes en todos los tejidos, como parte de la población perivascular. Como células multipotentes, pueden diferenciarse en diferentes tejidos derivados del mesodermo como hueso, cartílago y musculo cardiaco; es debido a esto que las MSCs son excelentes candidatas para la terapia celular siendo además fácilmente accesibles, de aislamiento sencillo, biopreservación con una mínima perdida de potencialidad, no mostrar reacciones adversas en trasplantes alergénicos por carecer de expresión HLA-II. Por lo tanto, las MSCs están siendo exploradas en la regeneración de tejidos dañados y tratamiento de la inflamación, así como enfermedades cardiovasculares e infartos de miocardio, lesiones cerebrales y espinales, accidentes cerebrovasculares, diabetes, lesión de cartílagos y huesos, y rechazo de tejidos. Muchas de las aplicaciones y las pruebas clínicas se realizan con MSCs de médula ósea, considerándose este tipo de trasplante seguro, habiéndose probado en muchas pruebas clínicas de enfermedades cardiovasculares, neurológicas y enfermedades inmunológicas con resultados alentadores. Existen además ejemplos de la utilización de MSCs en la reparación de riñones, músculo y pulmones; son también promotoras de angiogénesis, y fueron utilizadas en el tratamiento de lesiones crónicas de piel (Malgieri et al., 2010). Sin embargo debido a que la capacidad de frecuencia y diferenciación de las MSCs decrece con la edad, nuevas alternativas de recurso son necesarias, identificándose también MSCs en el líquido amniótico humano, placenta, así como en

8 tejidos fetales incluyendo médula ósea, hígado, sangre, pulmones y bazo (Malgieri et al., 2010); actualmente se aíslan y utilizan MSCs de sangre venosa de cordón umbilical humano para el tratamiento de lesiones neurológicas en modelos animales experimentales (Erices et al., 2000; Jae- Hoon Lee et al., 2009; Cao y Feng, 2009; Lim et al., 2010), también se han aislado y caracterizado MSCs de sangre venosa de cordón umbilical canino (J.-H. Lim et al., 2007; Seo et al., 2009), equino (Koch et al., 2007) y bovino (Raoufi et al., 2011); otro tejido considerado, por su fácil acceso, para el aislamiento y caracterización de MSCs es el adiposo (Kern et al., 2006; Ryu et al., 2009; Gimble et al., 2010). Debido al considerable potencial de las MSCs se ha generado un marcado incremento de su uso en diferentes disciplinas biomédicas, existiendo diferentes publicaciones donde se reportan diferentes protocolos de aislamiento y cultivo de MSCs, así como diferentes consideraciones para caracterizar a las mismas. Es así que, el Comité de Tejidos y Células Madre Mesenquimales de la Sociedad Internacional para la Terapia Celular propuso una serie de criterios para definir a las MSCs: Primero, deben adherirse al material plástico cuando se mantienen en condiciones de cultivo estándar. Segundo, las MSCs deberían expresar los siguientes marcadores de membrana: CD105, CD73 y CD90, y no expresar CD45, CD34, CD14 o CD11b, CD79 o CD19 y moléculas de superficie HLA-II. Tercero, las MSCs deberían diferenciarse en osteoblastos, adipocitos y condroblastos in vitro (Dominici et al., 2006). c) Células madre de sangre de cordón umbilical El cordón umbilical contiene dos arterias y una vena, que están rodeadas por tejido conectivo mucoide, el cual es llamado Gelatina de Wharton; la sangre del cordón umbilical ha sido usada desde 1988 como un recurso alternativo, esta sangre que lleva la vena umbilical posterior al nacimiento contiene un rico recurso de células madre progenitoras y células madre hematopoyética, obteniéndose resultados exitosos como alternativa de donantes alogénicos en una variedad de desórdenes genéticos, hematológicos, inmunológicos y oncológicos. La sangre fresca así mismo es un recurso de células madre no hematopoyéticas, conteniendo entre otras células madre endoteliales, células madre mesenquimales y células madre somáticas

9 irrestrictas. Existiendo además una diferencia significativa con la sangre periférica en cuanto a la cantidad de células madre y al acceso de la misma, siendo del mismo modo también una mejor opción que el recurso de medula ósea (Malgieri et al., 2010). Una de las principales características encontradas en las MSCs de sangre de vena de cordón umbilical humano es la expresión de marcadores de membrana Oct-4 y Nanog, propias de células embrionarias, lo cual explicaría su potencialidad para la diferenciación en cualquier tipo de tejido, por otro lado su baja inmunogenicidad se debería a la baja tasa de expresión del complejo mayor de histocompatibilidad (escaso para MHC I y nulo para MHC II) lo cual evitaría la proliferación de linfocitos alogénicos (Zhao et al., 2006; Cho et al., 2008). Del mismo modo, recientemente se aislaron MSCs de sangre venosa de cordón umbilical bovino cumpliendo estos con la premisa de diferenciarse en osteocitos, condrocitos y adipocitos, expresando también el marcador Oct-4 (Raoufi et al., 2011). En cuanto al modelo animal canino se reporta que también las MSCs de sangre venosa de cordón umbilical son positivas para marcadores comunes de células mesenquimales CD29, CD44, CD105; expresando también el marcador Oct4 brindándole característica de célula madre embrionaria, no evidenciándose la expresión de marcadores hematopoyéticos de superficie CD14, CD34 y CD45 (Seo et al., 2009). Las células madre de sangre de cordón umbilical humano tienen una alta capacidad de diferenciarse en células nerviosas, siendo estas un recurso promisorio como herramienta para entender el desarrollo y como agente terapéutico en lesiones cerebrales y de médula espinal. El trasplante de MSCs de sangre de cordón umbilical humano dentro de la lesión medular tiene las siguientes funciones: compensación de la desmielinización, eliminación de la inhibición, promover la regeneración axonal, dirección a los axones como blancos apropiados de regeneración y reemplazar a las células perdidas. Es así que se ha demostrado que la administración de estas células en ratas con enfermedad de Parkinson producen un incremento significativo en los niveles de factor neurotrópico derivado de células gliales (GDNF), uno de los factores tróficos más potentes para neuronas dopaminergicas, y factor de crecimiento de fibroblastos,

10 demostrándose así que estas células podrían utilizarse en el tratamiento de desórdenes del sistema nervioso central; por otra parte la administración de estas células se vería también involucrada, mediante la expresión de factores neuroprotectivos como el factor neurotrópico derivado del cerebro (BDNF) y el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), en la reducción eficaz de zonas de infarto, lo cual llevaría a la recuperación temprana de las deficiencias neurológicas después de una lesión (Malgieri et al., 2010) 4. PERSPECTIVAS DE LA TERAPIA CELULAR EN LESIONES MEDULARES La habilidad de cambio y adaptación de las células madre adultas, demuestra la capacidad de generar progenitores celulares apropiados cuando son inoculadas directamente en un tejido u órgano. Las MSCs han sido reconocidas como una alternativa potencial para terapia génica y terapia celular. La perspectiva de estos hallazgos implica el interés de los investigadores para su aplicación en diversas áreas de la medicina animal, como trasplantes, estudio de nuevas sustancias terapéuticas, desarrollo de regeneración de tejidos (Riaño et al., 2007). La ingeniería de los tejidos es un campo emergente de investigación cuyo objetivo es el estudio de la regeneración funcional de tejidos por combinación de células con sus substratos de cultivo. Muchas son las líneas de células madre que se vienen utilizando para este propósito, ya sea del tipo embrionario o adulto; sin embargo, solo algunos tipos específicos de células madre resultan mejor en aplicaciones particulares, entre estos tipos tenemos a las células madre embrionarias humanas, que constituyen un importante recurso en la ingenieria tisular, principalmente por su alta capacidad regenerativa y su alto potencial de proliferación, esto en comparación a las células madre adultas que tienen una limitada capacidad proliferativa y una perdida en la función de diferenciación a lo largo del tiempo en los cultivos in vitro (Mahmood et al., 2011). Actualmente, no hay una cura específica para el tratamiento de la lesión de medula espinal, pero existen numerosos estudios que muestran a las células madre como una alternativa de tratamiento para este tipo de lesión así como otros desordenes, por ejemplo con el uso de

11 células madre autólogas CD34+ se ha demostrado una reducción de los síntomas de diversas enfermedades como leucemia, cardiomiopatías, diabetes, enfermedades autoinmunes, incluyendo la esclerosis múltiple (Geffner et al., 2008). Dado que la lesión de la medula espinal resulta en necrosis y apoptosis de las diferentes células que la componen y que la pérdida de este tejido está relacionada, en parte, a la pérdida de funciones sensoriales y motrices, muchos investigadores están involucrados en tratar de reemplazar este tejido perdido en un esfuerzo por promover su recuperación. Recientemente, ha habido un esfuerzo considerable en el trasplante de células madre, células gliales olfatorias, y células de Schwann en la médula espinal o cerca del sitio de lesión. No obstante que las células madre son una terapia potencial atractiva para el uso en muchas enfermedades, y no sólo de lesión de médula espinal; también existen riesgos potenciales (por ejemplo, la tumorigénesis) por la introducción de estas células en la médula espinal. Ha habido una cantidad significativa de investigaciones tratando varios aspectos de la terapia con células madre en lesiones de médula espinal, hipotetizando que es poco probable que las células madre trasplantadas logren cambiar su fenotipo a la de una neurona funcional. Por el contrario, existen pruebas claras de que el uso de células madre pre-cultivadas y diferenciadas in vitro antes del trasplante podría producir un número suficiente de células neuronales, siendo esto práctico y útil para el objetivo de terapia dirigida en la lesión de medula espinal. Dado el número de diferentes tipos de células madre, se necesita mucha investigación para identificar la seguridad y la eficacia de la terapia celular. A pesar que la evidencia para el uso de la terapia con células madre parece prometedor, especialmente en combinación con otras modalidades, hasta la fecha ningún estudio ha utilizado este enfoque para la lesión de médula espinal en medicina veterinaria (Webb et al., 2010). 5. CONTRADICCIONES EN LA UTILIDAD DE LAS CÉLULAS MADRE Muchas investigaciones han demostrado que las MSCs pueden dirigirse eficientemente hacia el tejido dañado y repararlo por la liberación de citoquinas y factores de crecimiento, alcanzando la homeostasis por

12 reducción de la inflamación local y por la diferenciación en células del mismo tipo del tejido dañado, sin embargo debido a que el microambiente tumoral tiene las mismas características del tejido dañado, la administración de MSCs, especialmente las de origen de medula ósea, se asocia con el crecimiento tumoral. Por otro lado estudios complementarios sobre la movilización de MSCs de medula ósea hacia tumores mesenquimatosos fibroblasticos, indicarían que la movilización se debería al tipo de tejido mesenquimal. Sin embargo la asociación de crecimiento tumoral por administración de MSCs se debería a cuatro factores fundamentales: promoción de la angiogénesis, creación de un microambiente que permita la supervivencia de las células tumorales, por la modulación de la respuesta del sistema inmune contra las células tumorales y por la promoción de metástasis (Galderisi et al., 2010), estas características antes mencionadas servirían por otro lado para la aplicación terapéutica anticancerígena, haciendo que MSCs modificadas genéticamente expresen sustancias como el IFN-, inhibiendo localmente el crecimiento de células tumorales (Yen y Yen, 2008; Galderisi et al., 2010). 6. CONCLUSIONES La caracterización y el uso de células madre, específicamente de células mesenquimales (MSCs), viene desarrollándose con gran velocidad, es así que los recursos para el aislamiento de este tipo de células ya no está limitado a tejidos humanos, sino también a tejidos animales, como por ejemplo cordón umbilical de perro, bovino y equino. De acuerdo con toda la base teórica anteriormente expuesta, podemos concluir que la terapia celular es una herramienta terapéutica potencial para el uso en la medicina clínica veterinaria, hay suficiente sustento para poder iniciar estudios clínicos para enfermedades degenerativas como lesiones medulares, enfermedades pancreáticas y hepáticas, tal y como se viene realizando en otros países donde utilizan al perro como modelo experimental con resultados alentadores. En cuanto a las controversias sobre la pertinencia de utilizar las células madre, que se fundamentaban en la atribución de generar tumores mesenquimales, se vio que esta propiedad no se basa en que la célula madre se transforma en célula tumoral, sino más bien en el efecto paracrino que estas ejercen sobre las células tumorales ya

13 instauradas en el organismo, por otro lado gracias a su alto potencial de migración hacia los tejidos tumorales, el empleo de células madre vislumbra una nueva alternativa terapéutica para el tratamiento del cáncer. 7. LITERATURA CITADA 1. Cao FJ, Feng SQ Human umbilical cord mesenchymal stem cells and the treatment of spinal cord injury. Chinese medical journal, 122(2): Cho PS, Messina DJ, Hirsh EL, Chi N, Goldman SN, Lo DP, Harris IR, Popma SH, Sachs DH, Huang CA Immunogenicity of umbilical cord tissue derived cells. Blood, 111(1): Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, Slaper-Cortenbach I, Marini FC, Krause DS, Deans RJ, Keating A, Prockop DJ, Horwitz EM Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy, 8(4): Erices A, Conget P, Minguell J Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood. British Journal of Haematology, 109(2): Escobedo-Cousin M, Madrigal JA Las células madre y el nicho. Rev Hematol Mex, 12(2): Galderisi U, Giordano A, Paggi MG The bad and the good of mesenchymal stem cells in cancer: Boosters of tumor growth and vehicles for targeted delivery of anticancer agents. World journal of stem cells, 2(1): Geffner LF, Santacruz P, Izurieta M, Flor L, Maldonado B, Auad AH, Montenegro X, Gonzalez R, Silva F Administration of autologous bone marrow stem cells into spinal cord injury patients via multiple routes is safe and improves their quality of life: comprehensive case studies. Cell transplantation, 17(12): Gimble JM, Guilak F, Bunnell BA Clinical and preclinical translation of cell-based therapies using adipose tissue-derived cells. Stem cell research & therapy, 1:19.

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