POR QUÉ TENEMOS QUE ENVEJECER? ENFERMEDADES ASOCIADAS A LA EDAD

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3 POR QUÉ TENEMOS QUE ENVEJECER? ENFERMEDADES ASOCIADAS A LA EDAD Consuelo Boticario Boticario María Cascales Angosto

4 Quedan rigurosamente prohibidas, sin la autorización escrita de los titulares del Copyright, bajo las sanciones establecidas en las leyes, la reproducción total o parcial de esta obra por cualquier medio o procedimiento, comprendidos la reprografía y el tratamiento informático, y la distribución de ejemplares de ella mediante alquiler o préstamo públicos. UNED. Centro de Plasencia Consuelo Boticario Boticario María Cascales Angosto D.L.: CC I.S.B.N.: Imprenta y encuadernación: Artes Gráficas Batanero, S.L. P.E. Mejostilla. C/ Thomas Edison, 16 T

5 Agradecimientos Agradecimientos: Nuestro profundo agradecimiento a las profesoras doctoras Evangelina Palacios Aláiz, y Pilar González González por prestarnos su inestimable ayuda en la revisión y corrección de los manuscritos. También agradecemos de manera muy especial la colaboración prestada por doña Adoración Urrea Salazar, en la preparación de los manuscritos, en la búsqueda de la bibliografía y en la realización del ajuste electrónico de las figuras, etc. 5

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7 Prólogo PRÓLOGO Una vez más, haciéndose eco de los problemas de nuestra sociedad el Centro Asociado de la UNED en Plasencia, publica hoy este libro, sobre un tema de un gran interés científico y de enorme repercusión clínica y social: POR QUÉ TENEMOS QUE ENVEJECER? ENFERMEDADES ASOCIADAS A LA EDAD. En este volumen se recogen una serie de capítulos realizados tomando como base las publicaciones más recientes, donde se muestra la estrecha relación que existe, a nivel molecular y celular, entre dos fenómenos, de tanta trascendencia en la vida humana, como son el envejecer y el cáncer. En la actualidad son muchos los grupos de investigadores que estudian estas interrelaciones y los avances que se están consiguiendo, son de tal magnitud, que hoy casi ningún científico duda que, en un día no muy lejano, se podrán curar muchas de las enfermedades asociadas al envejecimiento, que a su vez, son la mayor causa de la morbilidad y mortalidad en nuestra sociedad. Solo entendiendo las bases moleculares del envejecimiento, se podrán desarrollar medios para retrasar la aparición de enfermedades asociadas al envejecimiento, la mayoría de las cuales están íntimamente conectadas con el cáncer. Los organismos multicelulares exhiben un declinar progresivo e irreversible de las funciones fisiológicas, que es característico de la senectud. Aunque las bases moleculares de este declinar no se conocen aún en su totalidad, los mecanismos hasta ahora propuestos incluyen un incremento en la generación de especies reactivas de oxígeno y una progresiva acumulación de lesiones oxidativas en el DNA, que van a dar lugar a inestabilidad genética y a alteraciones epigenéticas. Todo ello lleva consigo el deterioro oxidativo de macromoléculas críticas, la glicación de proteínas constitutivas y el acortamiento de los telómeros en células replicativas Es evidente que una serie de factores genéticos y ambientales determinan el envejecimiento y la longevidad. La manipulación de estos factores puede alterar la expectativa de vida y el fenotipo senescente. Existe amplia evidencia experimental que demuestra que la mayor resistencia al estrés oxidativo conduce a mayor longevidad. La modificación de los factores ambientales adversos, la restricción dietética y la dieta con alto contenido de antioxidantes, pueden disminuir las situaciones de estrés oxidativo y elevar la longevidad. Además la modulación de la actividad de genes de longevidad, puede ayudar a ampliar la expectativa de vida en los humanos. Finalmente, la 7

8 Prólogo activación de la capacidad reparadora del DNA ha de proporcionar otra estrategia, que unida a las otras, proporcione un medio de prevenir los achaques asociados a la edad avanzada. Cáncer y envejecimiento son padecimientos que aquejan a organismos con tejidos renovables, por eso han surgido genes supresores de tumores que suprimen el desarrollo del cáncer y limitan la longevidad. Una clase de supresores de tumores actúa previniendo el daño genético, mientras que otra inhibe la propagación de las células cancerosas potenciales. Mediante la manipulación de estos genes supresores se trata de conseguir, cómo alargar la vida sin tener el riesgo de contraer cáncer. Se han descrito dos tipos de mecanismos que juegan entre cáncer y envejecimiento: aquellos que al disminuir el daño celular, evitan el cáncer y protegen la longevidad, y aquellos diseñados para prevenir la excesiva proliferación celular, con lo cual se previene del cáncer, pero se limita la longevidad. El equilibrio entre ambos mecanismos ha de asegurar una vida saludable, libre de cáncer y de los achaques de la vejez. Es un hecho reconocido que en el siglo XX, la longevidad media de la población se ha elevado de manera notable, merced a los avances en la salud pública, que han logrado disminuir las enfermedades infecciosas mediante el desarrollo de terapias más avanzadas en el tratamiento a las enfermedades crónicas y las asociadas al envejecimiento. En España el promedio de esperanza de vida se ha elevado desde los 58 hasta los 80 años. En los últimos 30 años, estos logros se han conseguido retrasando la mortalidad del cáncer y de las enfermedades del corazón y cerebro. Aunque se puede argüir que el incremento en la esperanza de vida y en las enfermedades dependientes de la edad son asuntos separados, ya que la mayoría de individuos con 70 y más años disfrutan de una vida sana e independiente, los países desarrollados soportan todavía un alto costo debido a las elevadas necesidades de la población que sufre los trastornos del envejecimiento. Las revistas científicas de más prestigio publican regularmente trabajos con un mensaje recurrente: el envejecimiento es un proceso modificable, que se puede retrasar mediante intervenciones genéticas, farmacológicas o nutricionales. Es, por lo tanto, cuestión de tiempo averiguar la receta perfecta para conseguir vivir más años en buenas condiciones de salud. El futuro próximo nos ha de brindar nuevas formas de terapia regenerativa y preventiva, que proporcionaran mayor calidad de vida a la población de edad avanzada. El reto para este futuro será manipular estos mecanismos para 8

9 Prólogo conseguir una vida larga y saludable, evitando el cáncer y el envejecimiento. Esto no es especulativo, se ha demostrado que fármacos antidiabéticos tienen efectos protectores del cáncer en humanos y elevan la longevidad en ratones. Hay que considerar que la vida es muy difícil modificarla, porque todos los elementos del organismo han sido ajustados de manera estricta a lo largo de la evolución. Envejecimiento y cáncer deben ir de la mano si se quiere manipular la longevidad. No tiene sentido alargar la vida si se desarrolla un cáncer, y viceversa; no interesa estar protegidos del cáncer, si se adelanta el envejecimiento. Hay que tener presente que el cáncer como enfermedad degenerativa, en la mayoría de los casos, es una consecuencia del envejecimiento celular. Todas estas consideraciones nos han llevado a la realización de este volumen, en el cual hemos desarrollado una serie de temas que detallamos a continuación: Bases celulares y moleculares del envejecimiento; Estrés oxidativo; Antioxidantes y envejecimiento; Telómeros; Supresores tumorales; Inmunosenescencia; Envejecimiento y cáncer, dos caras de la misma moneda; Manipulación de la esperanza de vida; Células madre; Restricción calórica y envejecimiento; Epigenética; Osteoporosis y Enfermedad de Alzheimer. Por último, queremos expresar que como participantes comprometidos en la noble y esforzada tarea de escribir y divulgar el conocimiento, aguardamos con impaciencia la aceptación por los lectores interesados, y más aún, si con ello hemos logrado transmitir el mismo entusiasmo que nos ha llevado a realizarla, nuestro esfuerzo habrá merecido la pena. Madrid, Enero 2009 Consuelo Boticario Boticario María Cascales Angosto 9

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11 Índice ÍNDICE Pág. Capítulo 1. Bases celulares y moleculares del envejecimiento Capítulo 2. Estrés oxidativo Capítulo 3. Antioxidantes y envejecimiento Capítulo 4. Telómeros y Telomerasa Capítulo 5. Supresores de tumores y envejecimiento. 147 Capítulo 6. Inmunosenescencia 173 Capítulo 7. Envejecimiento y cáncer: dos caras de la misma moneda 199 Capítulo 8. Manipulación de la esperanza de vida. 225 Capítulo 9. Células madre. 245 Capítulo 10. Restricción calórica y envejecimiento 277 Capítulo 11. Epigenética en el envejecimiento 309 Capítulo 12. Osteoporosis. Mecanismos que regulan el recambio óseo Capítulo 13. Enfermedad de Alzheimer y estrés oxidativo

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13 Capítulo 1 Capítulo 1. BASES CELULARES Y MOLECULARES DEL ENVEJECIMIENTO 1. Introducción 2. Por qué envejecemos? 3. Envejecimiento y oxidación 3.1. Generación de especies reactivas de oxígeno por la mitocondria 3.2. Sistemas de defensa antioxidante 4. Expectativa de vida y longevidad máxima entre las especies 5. Telómeros y telomerasa 6. Envejecimiento, células madre y factores sistémicos medicina regenerativa? 7. Micro RNA (mirna) transducción de señales y medicina preventiva 8. Conclusiones 9. Abreviaturas 10. Bibliografía 1. Introducción El envejecimiento es un proceso biológico de una gran complejidad, que causa alteraciones en la estructura de órganos y tejidos, lo cual va a dar lugar a un declinar en las funciones y a una capacidad disminuida para atender a las demandas del organismo. Una característica del envejecimiento es la menor capacidad de mantener la homeostasis frente a condiciones ambientales adversas. La senectud representa no sólo un problema a nivel clínico y social, sino también una paradoja evolutiva porque se opone a la selección natural. La hipótesis evolutiva propone que el envejecimiento surge como consecuencia de la selección necesaria para mantener los procesos de la reproducción temprana, o como consecuencia de una selección más débil frente aquellos procesos post-reproductores. En la selección frente a la amenaza de la vida, la expresión genética de los mecanismos de defensa y reparación son mucho menos eficientes en la edad avanzada. Así, la muerte es menos adversa para la vida cuando ocurre en la última etapa de la vida del individuo. A pesar de haber sido comprendida la relativa tolerancia al envejecimiento, con respecto a la supervivencia de las especies, su necesidad o incluso conveniencia no ha sido aún demostrada. 13

14 Capítulo 1 2. Por qué envejecemos? Es porque lo llevamos en nuestros genes o porque sufrimos el desgaste del tiempo y de las agresiones externas? Hoy en día los investigadores se decantan por la segunda opción. Un ser vivo es un ente individual y diferenciado que necesita gran cantidad de energía para sobrevivir en un medio ambiente adverso. Los mecanismos implicados en el mantenimiento de la supervivencia se van deteriorando a medida que transcurre la edad. No parece que exista un programa genético que se ponga en marcha a determinada edad para conducirnos a la vejez y la muerte, simplemente nuestros mecanismos genéticos de reparación van perdiendo eficacia con la edad. En los últimos años se han identificado muchos factores ambientales y rutas metabólicas reguladas por genes que contribuyen a retardar o acelerar el envejecimiento. La capacidad oxidativa de las especies reactivas de oxígeno, los daños al DNA por estas mismas especies, por radiaciones o por agentes químicos, la excesiva producción de energía por las mitocondrias, la hiperactividad de la hormona del crecimiento, un aporte excesivo de grasas y carbohidratos, etc., son elementos relacionados con el envejecimiento. Los especialistas en genética están empezando a vislumbrar conexiones entre diferentes mecanismos y han demostrado que existe una familia de genes maestros que rige gran parte de estos procesos, cuya modulación podría conducir a una significativa elevación de la expectativa de vida humana. Una característica común de la vida en los organismos multicelulares es el progresivo declinar en la eficiencia de una serie de procesos fisiológicos, una vez finalizada la fase reproductora de dicho organismo. Para estudiar la naturaleza de la plétora de mecanismos que intervienen y se asocian en el envejecimiento, se han utilizado muchos modelos y estrategias, pero quedan sin respuesta las siguientes preguntas: Por qué los organismos sufren un deterioro fisiológico irreversible en la última parte de sus vidas? Por qué esos mismos organismos pierden su capacidad de restauración y reparación de los tejidos u órganos? La filosofía helenística estaba convencida que el envejecimiento era un truco de la vida para tener más vida. Pasó mucho tiempo hasta que el contenido científico de esta frase antigua llegara a ser descifrable. El deterioro fisiológico del organismo a medida que transcurre la edad presenta una paradoja evolutiva. Si los organismos pueden funcionar bien en la 14

15 Capítulo 1 juventud Por qué no lo hacen igual a la vejez? Se han emitido hipótesis evolutivas y no adaptativas por separado, para considerar el proceso aparentemente universal del envejecimiento. La hipótesis evolutiva predice que la tasa de envejecimiento se eleva y la supervivencia disminuye en proporción directa a como se eleva la tasa de mortalidad extrínseca. También, la tasa de envejecimiento es mayor en aquellos organismos cuya fecundidad no se mantiene elevada después de la madurez reproductora. Las teorías puramente fisiológicas del envejecimiento no predicen ninguna relación entre la mortalidad extrínseca, la fecundidad dependiente de la edad y la tasa de envejecimiento. Además se establece una asociación entre la esperanza de vida y la tasa metabólica, por lo cual los organismos con tasas metabólicas más bajas han de tener mayor expectativa de vida. Es importante anotar que las hipótesis evolutivas no contradicen que los mecanismos próximos, tales como que las lesiones al DNA sean responsables del envejecimiento. Ellas solo predicen que la selección natural ha de actuar sobre estos mecanismos próximos. Por ejemplo, ante una tasa menor de mortalidad extrínseca ha de disminuir la frecuencia de expresión de los genes tardíos que reducen la eficiencia de la reparación del DNA y por consiguiente causan mayor lesión al DNA. Es un hecho demostrado que la evolución de los insectos sociables como las termitas y las abejas, se asocia con un incremento de 100 veces en la longevidad máxima. Tal incremento se debe a teorías evolutivas porque estos insectos viven en colonias fuertemente defendidas de los depredadores y en ellas no existe asociación entre la tasa de mortalidad extrínseca y la esperanza de vida. Otra forma de definir el envejecimiento es la de describir sus consecuencias: (a) casi todas las funciones fisiológicas pierden progresivamente eficacia y vigor; (b) la mayoría de los órganos vitales sufren fenómenos de atrofia o degeneración, especialmente detectable en aquellos que contienen células post-mitóticas, neuronas, células musculares, células hepáticas, etc.; (c) se registra un progresivo aumento de la sensibilidad a traumatismos, infecciones y fármacos, unido a un funcionamiento anormal del sistema inmunitario y (d) aumenta el riesgo a enfermedades degenerativas y cáncer 15

16 Capítulo 1 El envejecimiento es un proceso complejo biológico universal que se detecta a nivel morfológico, bioquímico y funcional, tanto en células aisladas como en órgano entero, que termina con la muerte. Las teorías postuladas sobre el envejecimiento son muchas y tienen su origen en el estudio de los cambios que se suceden o de los cambios que se acumulan a lo largo de la vida. La teoría que ha alcanzado más adeptos entre la comunidad científica por la solidez de sus argumentos y por haber sido ampliamente comprobada, fue propuesta por Harman en 1956, y es la que responsabiliza a los radicales libres de oxígeno de las alteraciones oxidativas típicas de la edad avanzada y de la mayor parte de las alteraciones celulares que ocurren en el envejecimiento. Esta teoría se dirigió, posteriormente, hacia la generación de especies reactivas de oxígeno por la mitocondria y trata de explicar el fenómeno de la senectud por medio del estrés oxidativo. Es decir, el envejecimiento aparece a medida que el organismo acumula lesiones oxidativas Aunque se desconocen las bases moleculares del declinar fisiológico progresivo e irreversible característico de la senectud, se han postulado una serie de mecanismos para explicarlo. Este estos se incluye: el acumulo de lesiones en la molécula del DNA que conllevan a una inestabilidad genómica; alteraciones epigenéticas que conducen a modificaciones en la expresión genética; acortamiento de los telómeros en células replicativas; lesión oxidativa en macromoléculas críticas; y glicación, no enzimática, de proteínas de cadena larga. En el intento de explicar el declinar fisiológico y progresivo de la senectud y para buscar respuesta a la pregunta al inicio de este capítulo por qué envejecemos?, vamos a analizar una rara enfermedad, caracterizada por un envejecimiento prematuro y una enorme propensión al cáncer, que es la enfermedad de Werner. Esta enfermedad ha servido de modelo a un grupo de científicos españoles dirigidos por Manel Esteller, para comprender mejor la relación entre cáncer, genes y envejecimiento. Este síndrome hereditario, produce envejecimiento prematuro y se caracteriza por inestabilidad genómica y una elevada incidencia a padecer tumores. El envejecimiento es 16

17 Capítulo 1 el principal factor de riesgo para el desarrollo de tumores y como hasta hace poco no se conocían bien las razones moleculares de esta relación, era lógico pensar que tenía que existir un gen que previniera el envejecimiento y el cáncer. Este es el gen WRN, un supresor tumoral, que cuando se inactiva por metilación, no solo provoca el síndrome de Werner, sino que tiene un papel destacado en la aparición del cáncer. La pérdida de actividad de este gen por metilación de su zona reguladora, se ha detectado en diversos tipos de tumores, incluyendo blandos y sólidos, y siendo el primer gen supresor tumoral con tan amplia distribución. La función de este gen es proteger a las células de las lesiones, gracias a su actividad helicasa y exonucleasa que promueve la reparación del DNA. Sin embargo, su inactivación provoca el inicio de la fragmentación cromosómica y el desarrollo de la inestabilidad genómica previa al desarrollo tumoral. La reintroducción del gen en una célula deficiente tiene propiedades antitumorales, tanto en cultivos celulares como en modelos murinos, lo que abre una esperanza a la mejora del tratamiento de ciertos tumores, basándose en la comprensión de estas interacciones. Estos estudios están poniendo de manifiesto aspectos epigenéticos del envejecimiento, un campo emergente que promete revelaciones importantes. El grupo de Esteller está actualmente estudiando la significación biológica de las alteraciones epigenéticas que se acumulan en el transcurso de la edad y que tienen importantes repercusiones en la tumorigénesis. 3. Envejecimiento y oxidación La utilización del oxígeno por los organismos aerobios, en condiciones normales, genera metabolitos reactivos de este elemento que pueden ocasionar un estado de estrés oxidativo, en el caso en el que se altere el equilibrio prooxidante/antioxidante de la célula. La intensidad del daño oxidativo se eleva a medida que un organismo envejece y se ha postulado que en ello radica la causa principal de la senectud. En favor de esta hipótesis se alegan las observaciones siguientes: La superexpresión de los enzimas antioxidantes retrasa el daño oxidativo y amplia el período vital. La longevidad de las diferentes especies es inversamente proporcional a la velocidad de generación mitocondrial de especies reactivas de oxígeno La restricción calórica de la ingesta aminora las lesiones oxidativas, 17

18 Capítulo 1 retarda los cambios asociados a la edad y amplia la expectativa de vida. La hipótesis que suscribe que la acumulación de daño oxidativo es la causa principal responsable del envejecimiento, se basa en el hecho de que el oxígeno es potencialmente tóxico y su uso por los organismos aerobios, aunque necesario para su supervivencia inmediata, puede llegar a ser peligroso a lo largo de su existencia. El fenómeno de la toxicidad del oxígeno, referido como la paradoja de la aerobiosis, es inherente a su estructura atómica. El oxígeno molecular es un biradical que tras la adición secuencial de cuatro electrones y cuatro protones en la cadena de transporte electrónico mitocondrial (Figura 1), genera agua. En este proceso, en el que se produce gran cantidad de energía (ATP), pueden también generarse, como subproductos, moléculas parcialmente reducidas con uno, dos y tres electrones. Estas son, el radical superóxido, el peróxido de hidrógeno y el radical hidroxilo, respectivamente, que se denominan especies reactivas de oxígeno (ROS) y causan lesiones oxidativas en las macromoléculas celulares (lípidos, proteínas y DNA). Las lesiones se manifiestan como peroxidación de los lípidos insaturados de las membranas, modificaciones en el DNA (alteración de bases, roturas de las cadenas, intercambios entre las cromatidas hermanas, etc.), cruzamientos entre las proteínas y el DNA, carbonilación proteica y pérdida de los grupos SHO de las proteínas, etc. Figura 1. Generación de especies reactivas de oxígeno por la cadena de transporte electrónico mitocondrial. 18

19 Capítulo 1 En condiciones normales se estima que el 2 % del oxígeno consumido por una célula aerobia se diversifica hacia la generación de especies reactivas. Una célula típica de rata, como el hepatocito, puede sufrir en su DNA unas 10 5 agresiones por día con estas especies. La presencia de los productos resultantes de las interacciones de las especies reactivas con las macromoléculas celulares ha llevado al convencimiento de que las defensas antioxidantes no son totalmente eficientes, que las células se encuentran sometidas a situaciones crónicas de estrés oxidativo y que el envejecimiento es una consecuencia de la acumulación del daño oxidativo. De todo lo anterior se deduce que la hipótesis oxidativa del envejecimiento se basa en el progresivo e irreversible incremento de la lesión oxidativa molecular. La velocidad de generación de las ROS in vivo, es hoy fácil evaluar mediante técnicas de citometría de flujo. Con estos medios experimentales se ha observado en hígado de ratas, que el estado de los pares redox tienden hacia valores más oxidados a medida que transcurre la edad, así como los niveles de peroxidación de lípidos y de oxidación de proteínas. El estrés oxidativo se detecta por el incremento exponencial de la carbonización de las proteínas, pérdida de sus grupos SH, pérdida del glutation, elevación de la concentración de productos que reaccionan con el ácido tiobarbitúrico y pérdida de la actividad catalítica de determinados enzimas. La concentración de 8-hidroxiguanosina, un indicador del daño oxidativo al DNA, se incrementa progresivamente durante el envejecimiento. De tales estudios se deduce que el daño oxidativo molecular es ubicuo, sustancial y se eleva exponencialmente con la edad La situación de estrés oxidativo en el envejecimiento puede estar ligada a tres factores diferentes: elevación del ritmo de generación de especies reactivas de oxígeno; disminución de las defensas oxidativas, y menor eficiencia en la reparación o eliminación de las moléculas lesionadas Generación de especies activas de oxígeno por la mitocondria A medida que transcurre la edad se eleva el ritmo de generación de especies reactivas de oxígeno por la mitocondria, la fuente principal de su producción. La mayor producción de estas especies inflige lesión en la membrana interna de las mitocondrias, lo cual por un mecanismo de retroregulación positiva induce un incremento en la generación de especies reactivas. 19

20 Capítulo 1 El principal productor de radicales de oxígeno en los organismos aerobios es la mitocondria, el orgánulo celular que, en condiciones normales, utiliza aproximadamente el 98% del O 2 que ingresa en la célula reduciéndolo a agua a nivel del citocromo a 3 de la cadena de transporte de electrones. Como se muestra en la Figura 1 una pequeña parte del O 2 incorporado por la mitocondria, sufre una reducción monovalente y genera especies reactivas de oxígeno, tales como el radical superóxido (O 2.- ), el peróxido de hidrógeno (H 2 O 2 ), y radical hidroxilo ( OH), llegando a una producción diaria de 3 x 10 7 O 2.- /mitocondria/día. Por tanto, al ser las mitocondrias la fuente más importante de especies reactivas de oxígeno, es obvio que el DNA mitocondrial se encuentra más expuesto que el DNA nuclear a sufrir lesiones oxidativas severas que pueden conducir a mutaciones y supresiones en su propia cadena. (Figura 2). Las mutaciones y supresiones en el DNA mitocondrial son hoy el punto de mira de muchos gerontólogos, ya que el hecho de que se acumulen con la edad, hace pensar que las mitocondrias juegan un importante papel en las alteraciones propias del envejecimiento. Si las mitocondrias poseen un genoma lesionado ello puede influir en los propios componentes de la cadena de transporte electrónico, disminuyendo su eficacia en el proceso de reducción tetravalente del oxígeno molecular y en la producción del ATP. Por un lado, la menor producción de energía afectaría la función celular, y por otro, la alteración en la cadena de transporte electrónico elevaría la velocidad de generación de las especies reactivas de oxígeno. En este caso, la alteración localizada se agravaría al ocasionar la posterior lesión del DNA mitocondrial. La susceptibilidad del DNA mitocondrial a la agresión oxidativa es mayor que la del DNA nuclear, por encontrarse más cercano a la fuente de especies reactivas de oxígeno y carecer de histonas protectoras. Esto unido a que es más compacto y codifica todo, hace que la hipersensibilidad del DNA mitocondrial se asocie con la inestabilidad genómica que se observa en un número de enfermedades neurodegenerativas. La velocidad de mutación del DNA mitocondrial se ha estimado que es 16 veces superior que la del núcleo. 20

21 Capítulo 1 Figura 2. Expectativa de vida en relación con la generación mitocondrial de ROS (especies reactivas de oxígeno) y lesión al DNA (Barja y Herrero 2000) La lesión oxidativa al DNA mitocondrial en animales viejos se acusa más en cerebro que en otros órganos como el hígado. Esto indica que las mitocondrias del cerebro se encuentran más expuestas a situaciones de estrés oxidativo. Una de las razones que explica en parte la mayor susceptibilidad a la oxidación de las células del cerebro es que los niveles de glutation en este órgano son mucho más bajos que en hígado, lo que puede contribuir a que las neuronas se encuentren más desprotegidas frente e la agresión oxidativa Aunque es la mitocondria la principal responsable de la generación de las especies reactivas de oxígeno, éstas también se producen en otros orgánulos celulares, como los peroxisomas, donde la aminoácido oxidasa, la acil-coa oxidasa y la urato oxidasa generan H 2 O 2, o el retículo endoplásmico, donde el citocromo P-450 cataliza reacciones de monooxigenación con producción de radical superóxido y peróxido de hidrógeno por mecanismos dependientes de NADPH. Tanto el radical superóxido como el peróxido de hidrógeno no poseen una elevada reactividad frente a las macromoléculas, sin embargo, en presencia de ciertos complejos de metales de transición, como el hierro o el cobre pueden reaccionar entre si (reacción de Fenton o Harber-Weiss) y dar lugar al radical hidroxilo (. OH) que posee una elevada reactividad. Otras vías de formación del radical hidroxilo son a través del peroxinitrito, producto de reaccionar el radical superóxido con el óxido nítrico y mediante la acción de radiaciones ionizantes sobre el agua (Figura 3). 21

22 Capítulo 1 La generación de estas sustancias prooxidantes se encuentra controlada mediante mecanismos celulares de defensa antioxidantes, reductores o secuestrantes que se ubican de manera estratégica en los diferentes orgánulos subcelulares. En el caso de que estos mecanismos lleguen a ser insuficientes para contrarrestar la excesiva producción de especies reactivas, se originan alteraciones celulares que conducen al estrés oxidativo, que puede llegar a afectar de manera irreversible la viabilidad celular y la funcionalidad del órgano. Bien conocida es la lesión oxidativa producida sobre el DNA por el OH. Del mismo modo, se originan lesiones oxidativas en los lípidos y en las proteínas. Además, con la edad se producen cambios en la estructura molecular de los enzimas debido a errores en la traducción y en la conformación de su molécula a nivel de racemización de aminoácidos, desaminación, glicosilación, oxidación, etc. A medida que transcurre la edad se incrementan las lesiones oxidativas al DNA (evaluadas por la concentración de 8-hidroxiguanina), disminuyen los niveles de ácidos grasos poliinsaturados, se producen transcripciones anómalas, descienden los complejos I y IV de la cadena de transporte electrónico (complejos codificados por el DNA mitocondrial a diferencia de los II y III codificados por el DNA nuclear) y se produce una pérdida de la producción de energía, con el consiguiente incremento en los niveles de oxidantes al reaccionar los grupos carbonilos de las proteínas oxidadas con grupos amino libres. El papel de la lesión oxidativa a nivel de las proteínas en el envejecimiento celular se hace aparente en las formas inactivas o menos activas de algunos enzimas. Las modificaciones post-traduccionales son en gran parte las responsables de la acumulación de estas proteínas inactivas. La lesión oxidativa se verifica de manera selectiva en ciertas proteínas mitocondriales. Se ha descrito que la aconitasa mitocondrial, un enzima del ciclo tricarboxílico, es un objetivo específico de sufrir la oxidación durante el envejecimiento. Las membranas mitocondriales al ser ricas en ácidos grasos altamente insaturados son muy susceptibles a sufrir peroxidación lipídica. De hecho, en especies más longevas se ha demostrado que poseen una proporción menor de ácidos grasos insaturados de 4 o más dobles enlaces por sustitución del araquidónico por el linoleico, lo cual influye en la funcionalidad de la cadena de transporte de electrones y en la disminución de la producción de radicales libres. Además la velocidad del proceso del envejecimiento puede depender de la sensibilidad de los lípidos mitocondriales para sufrir la oxidación. El 22

23 Capítulo 1 análisis de la fracción de lípidos de las mitocondrias hepáticas de varias especies de mamíferos ha revelado que el número total de dobles enlaces y el índice de peroxidación de los lípidos de las membranas mitocondriales se relacionan inversamente con la longevidad. En el envejecimiento tiene lugar un ciclo vicioso en la mitocondria: el incremento en la lipoperoxidación, unido a la modificación oxidativa de las proteínas, eleva el daño oxidativo y las mutaciones en el DNA mitocondrial; a su vez, los enzimas de la cadena respiratoria que contienen las subunidades proteicas codificadas por el DNA mitocondrial lesionado, elevan la generación de especies reactivas de oxígeno, las cuales agravan el daño oxidativo en la propia mitocondria Sistemas de defensa antioxidante Para mantener la integridad celular, una serie de sistemas de defensa antioxidante, ubicados de manera estratégica en distintos orgánulos subcelulares, actúan concertadamente con aquellos mecanismos responsables de los procesos reparadores de las macromoléculas lesionadas por oxidación (Figura 3). El anión superóxido y el peróxido de hidrógeno se convierten en especies inertes por la acción sucesiva de la superóxido dismutasa (SOD), la catalasa y la glutation peroxidasa (GPX). La superóxido dismutasa cataliza la dismutación del anión superóxido a peróxido de hidrógeno: la catalasa reacciona con el peróxido de hidrógeno y genera agua y la glutation peroxidasa cataliza la oxidación del glutation reducido a glutation oxidado a expensas del H 2 O 2 o de peróxidos orgánicos. La eficiente funcionalidad de estos mecanismos defensivos necesita la actividad concertada de los enzimas individuales. Así, la superoxido dismutasa, la catalasa y la glutation peroxidasa actúan de manera coordinada en los estados prooxidantes celulares. Para mantener la integridad celular, estos sistemas han de coordinarse con los sistemas celulares responsables de la reparación de las moléculas lesionadas por oxidación. Entre los antioxidantes no enzimáticos de procedendencia endógena el más importante es el glutation reducido (GSH), tripéptido compuesto por γ- glutamilo, cisteína y glicocola. Es el tiol de bajo peso molecular más abundante en la mayoría de células de mamíferos. La concentración intracelular de GSH en hígado en condiciones normales fluctua entre 5 y 10 mm y en el estado redox normal de la célula, menos de un 5% del glutation total existe en su forma oxidada (GSSG). El hígado es el órgano que se caracteriza por su elevada capacidad de sintetizar glutation a través de la vía de la cistationina, cuya misión es generar cisteína a partir de metionina la 23

24 Capítulo 1 dieta. En hígado existen dos reservorios de glutation: el citosólico y el mitocondrial. El glutation citosólico se encuentra sometido a un intenso recambio, mientras que el glutation mitocondrial no. La pérdida de GSH inducida por agentes químicos, favorece la peroxidación lipídica y la lesión celular. El GSH actúa principalmente sobre el H 2 O 2 generado en el curso de la biotransformación de xenobióticos y otras vías y como coenzima de la glutation peroxidasa. También el GSH se utiliza como sustrato por la glutation-s-transferasa para la conjugación y eliminación de xenobióticos. El GSH reacciona también con el radical hidroxilo ( OH), la fuente más importante de lesión debida a radicales libres de oxígeno. El declinar de la concentración de GSH con la edad se debe a un incremento en la tasa de oxidación o a una disminución en el recambio del GSH resultante de mayor utilización/degradación y/o de una menor biosíntesis del GSH. Es importante mantener elevado el cociente GSH/GSSG para prevenir la secuela de acontecimientos que lleva consigo la pérdida de los grupos tiólicos celulares y otras alteraciones como, peroxidación lipídica, alteraciones en la homeostasis del calcio, etc. A este respecto, la continuada generación de GSH, a partir del GSSG, por acción de la glutation reductasa en presencia de equivalentes reductores, en forma de NADPH, es esencial para preservar la integridad celular. La vitamina E es el antioxidante exógeno liposoluble más ampliamente distribuído en la naturaleza, tanto en el reino vegetal como en el animal El α- tocoferol es el isómero mejor conocido y el que posee la actividad antioxidante más potente. Debido a la propiedad lipofílica de la molécula de α-tocoferol, la vitamina E interrumpe la reacción en cadena de los radicales en el medio liposoluble, por ejemplo, en las lipoproteínas plasmáticas. Elevadas concentraciones de α-tocoferol se encuentran en glándulas adrenales, corazón, testículos e hígado. En el interior de la célula, esta vitamina se asocia con membranas ricas en lípidos, como la mitocondria y el retículo endoplásmico, de manera que su acción antioxidante es efectiva ya que evita la lipoperoxidación de las membranas al reaccionar con los radicales peroxilo y alcoxilo. (Ver Capítulo 3, Antioxidantes y envejecimiento) Otra defensa antioxidante muy efectiva, es la restricción calorica de la ingesta, ya que el menor consumo de alimentos va a proporcionar un menor número de electrones, que tienen que ser procesados por la mitocondria a través de la cadena de transporte electrónico. El descenso programado de la 24

25 Capítulo 1 dieta al aminorar la generación de especies reactivas de oxígeno por la mitocondria, se presenta como uno de los medios antioxidantes más efectivos que aseguran una buena salud e incluso prolongan la vida. Existen evidencias que demuestran el efecto de esta restricción sobre animales de experimentación. En todos ellos se ha observado una progresión más lenta del envejecimiento, un retraso en la aparición de los efectos no deseables y un aumento de la esperanza de vida. Es, por tanto, la lesión oxidativa que se acumula en las macromoleculas a lo largo de la vida, la responsable de una gran parte de los efectos adversos de la senectud. En hepatocitos de ratas senescentes la tasa de generación de ROS es más elevada que en los de ratas jóvenes, de tal manera que las defensas antioxidantes se encuentran en situación de no poder hacer frente a ellas, lo que conduce al estrés oxidativo. En un estudio previo en nuestro laboratorio se ha descrito que el retraso en la reparación o una reparación incompleta de las macromoléculas oxidadas de los hepatocitos de las ratas viejas, es la causa de la menor respuesta proliferativa post-necrótica en esas células. Esta menor respuesta retrasa la regeneración hepatocelular y la restauración de la funcionalidad hepática e incrementa el riesgo de la toxicidad de los fármacos debido a la incompleta restauración de los sistemas encargados de su metabolismo. 4. Expectativa de vida y longevidad máxima entre las especies Hay que distinguir entre longevidad media de la población, expectativa de vida o supervivencia de cada individuo y la longevidad máxima referida a la especie. La longevidad media ha aumentado considerablemente a lo largo de los tiempos (curvas de supervivencia). La longevidad máxima depende de los genes de cada especie, mientras que la expectativa de vida de cada individuo depende también de los factores ambientales. La longevidad máxima no varía y es aquel punto donde caen todas las curvas, y en la especie humana se cifra en 125 años. No hay pruebas de que haya aumentado la longevidad máxima en humanos. El avance cultural ha ampliado la supervivencia, pero no ha desacelerado la intensidad del fenómeno intrínseco del envejecimiento. Esta intensidad es tanto más lenta cuanto más vive un animal. Se define como potencial de energía vital al número de calorías transformadas por Kg de peso corporal durante la vida. Este parámetro es muy variable entre las especies; es mayor en animales de pequeño tamaño 25

26 Capítulo 1 corporal y elevada tasa metabólica. Por otro lado, a igualdad de tamaño corporal existen diferencias muy notables en el potencial de longevidad máxima entre los diferentes vertebrados. Así, la esperanza de vida y la longevidad máxima son mucho mayores en las aves que en los mamíferos. Por ejemplo, si se comparan las palomas con las ratas, con un peso corporal similar, las palomas pueden vivir 35 años, mientras que las ratas sólo 4 años. Diversos estudios del grupo de Barja et al., de la Facultad de Biología de la Universidad Complutense, han investigado estos problemas y han encontrado que el consumo de oxígeno por la mitocondria resulta ser similar en palomas y en ratas, pero la generación de especies reactivas de oxígeno es menor en las palomas. A igual consumo de oxígeno, la paloma genera menos radicales de oxígeno, con lo que su DNA mitocondrial resulta menos lesionado y puede ser reparado más eficazmente (Figura 2). Los estudios comparativos entre especies de vertebrados con muy diferente expectativa de vida, han demostrado que los niveles constitutivos de antioxidantes endógenos se relacionan de manera negativa con dicha expectativa, lo cual indica que a mayor producción de ROS por la mitocondria menor expectativa de vida. Además, el ritmo metabólico basal se relaciona con el envejecimiento y con el período de máxima longevidad. La explicación de este comportamiento diferente entre paloma y rata tienen su base en que en las palomas, a igual consumo de oxígeno, la generación de ROS es menor (Figura 2) y que las membranas mitocondriales de las palomas son menos sensibles a la lipoperoxidación. Lo primero no está claro aún, pero se atribuye a un distinto comportamiento en el funcionamiento de la cadena electrónica mitocondrial. Lo segundo se debe a que los lípidos integrantes de las membranas son menos insaturados en las palomas y esto hace que sean menos sensibles a la lipoperoxidación. En las palomas es más bajo el contenido en ácidos grasos altamente insaturados (docosahexanoico, 22:6n-3 y araquidónico, 20:4n-6). Por tanto, un bajo grado de insaturación lipídica es una característica general de animales longevos homeotermos. También se ha observado que las membranas mitocondriales de las palomas son menos permeables a los protones y que la lesión oxidativa al DNA mitocondrial se relaciona inversamente con el máximo periodo vital. También se ha detectado en aves menor glicosilación en las proteínas y en acumulación de productos terminales de glicosilación avanzada (AGE). 5. Telómeros y telomerasa En la mayoría de las células somáticas de los tejidos normales, la pérdida 26

27 Capítulo 1 de la capacidad replicativa, que conlleva a la senescencia celular, se debe al acortamiento de los telómeros asociado con la ausencia de la actividad telomerasa. Los telómeros y la telomerasa presentan un gran interés a la hora de encontrar explicación, no sólo a los cambios relacionados con el envejecimiento, sino también a los relativos al cáncer. Son numerosas las alteraciones en la expresión genética que afectan a la diferente capacidad de las células para dividirse y que se encuentran implicadas en los mecanismos que conducen, tanto al envejecimiento como al cáncer. Las células somáticas de los mamíferos poseen una limitada capacidad de dividirse en cultivo, debido al acortamiento en los telómeros, la porción terminal de los cromosomas lineales. El acortamiento telomérico origina cambios transcripcionales que conllevan a la silenciación de genes subteloméricos y es causa de la inestabilidad cromosómica de la senescencia. Los telómeros son secuencias de hexanucleótidos (TTAGGG), ubicadas en los extremos de los cromosomas lineales del núcleo, las cuales son esenciales para el mantenimiento de la estabilidad cromosómica. La telomerasa es una ribonucleoproteína denominada transferasa telómero-terminal, requerida para la síntesis de la repetición telomérica, cuya porción RNA se utiliza como molde para añadir, mediante retrotranscripción, secuencias teloméricas de novo a los extremos de los telómeros. La telomerasa se expresa sólo en células germinales y en células transformadas. La pérdida progresiva de los extremos teloméricos de los cromosomas durante el envejecimiento, puede inducir señales antiproliferativas que conduzcan a un estado de senescencia celular o replicativa. La replicación de los telómeros presenta un dilema especial denominado problema de la replicación terminal, ya que en la división celular, los telómeros de las células somáticas normales no pueden replicarse en su totalidad por el complejo DNA polimerasa y esto se debe a la diferencia en la replicación de las dos cadenas del DNA, la conductora y la rezagada. Para resolver este problema la mayoría de las células eucariotas utilizan la telomerasa, enzima que alarga los extremos 3 de los cromosomas que se van a replicar. (Ver Capítulo 4, Telomeros y Telomerasa) Entre las diferentes alteraciónes típicas del envejecimiento, que conducen a la inestabilidad genética, el acortamiento de los telómeros representa uno de los cambios estructurales más importantes. Se ha detectado una disminución en la longitud de los telómeros en células procedentes de individuos de edad elevada y en cultivos celulares senescentes, lo que indica que el acortamiento telomérico se considera un marcador del envejecimiento. 27

28 Capítulo 1 El interés por los telómeros relativo a los procesos de senescencia e inmortalidad se basa en que el envejecimiento supone la pérdida de la capacidad replicativa celular, y la inmortalidad la ganancia de un potencial replicativo ilimitado. La importancia de la relación entre envejecimiento e inmortalidad se encuentra reforzada por el hecho que una elevada proporción de células tumorales expresan actividad telomerasa, mientras que la mayor parte de células somáticas normales muestran una ausencia casi total de esta actividad. De acuerdo con la teoría evolutiva del soma desechable, los mecanismos antienvejecimiento y los anticáncer han adaptado sus respectivas fuerzas a la expectativa de vida natural de cada especie y de esta manera estos mecanismos aseguran que la mayoría de los individuos estarán libres de cáncer y de envejecimiento en tanto en cuanto sean útiles o beneficiosos para sus especies. Si comparamos mamíferos de corta expectativa de vida, tal como los ratones y los de larga vida como los humanos, está claro que los humanos tienen una protección frente al cáncer y unos mecanismos antienvejecimiento más rigurosos que los ratones. Por tanto, es importante destacar que unos y otros mecanismos han evolucionado en paralelo y se acomodan a la expectativa de vida natural de las especies. Sin embargo, la evolución de la protección al cáncer y al envejecimiento tiene raíces más profundas que la simple adaptación en paralelo de los dos procesos independientes. Recientes investigaciones revelan la existencia de mecanismos que proporcionan simultáneamente resistencia al cáncer y resistencia al envejecimiento, y de otros mecanismos que proporcionan protección contra el cáncer, pero favorecen el envejecimiento. Los primeros actúan en común sobre la generación y acumulación de lesión celular. La lesión celular es el origen, tanto del envejecimiento como del cáncer. Por lo tanto, aquellos mecanismos que previenen la lesión celular proporcionan protección frente al cáncer y frente al envejecimiento. Entre estos mecanismos están los que mejoran la eficiencia del consumo de energía, disminuyendo la generación de ROS, consideradas la fuente principal de daño endógeno, y la proteína p53, el principal sensor del daño al DNA, que desencadena las respuestas de defensa y reparación. Existen evidencias experimentales que indican que aquellos mecanismos o intervenciones que disminuyen la generación de ROS y promueven la actividad de p53 proporcionan protección frente al cáncer y al envejecimiento. Sin embargo, 28

29 Capítulo 1 se han descubierto mecanismos que ejercen efectos opuestos sobre el envejecimiento y el cáncer, evitando específicamente el cáncer, pero promoviendo el envejecimiento. Estos mecanismos incluyen el acortamiento de los telómeros y la desrrepresión del locus INK4a/ARF, cuyo propósito es prevenir la proliferación celular excesiva, lo cual supone una protección frente al cáncer, mientras que limitan la regeneración a largo plazo y la longevidad. 6. Envejecimiento, células madre y factores sistémicos. Medicina regenerativa? Los numerosos estudios que se llevan a cabo en la actualidad en células madre han proporcionado suficientes argumentos que muestran un futuro prometedor en tratamientos para paliar o evitar los efectos adversos del envejecimiento. Estos tratamientos pueden ser de gran utilidad y eficacia para la reparación de tejidos lesionados, el tratamiento de enfermedades degenerativas y en general para prevenir la disminución de las funciones de la edad avanzada. Es importante investigar si el envejecimiento es la causa o la consecuencia de las alteraciones en las células madre. En mamíferos, las células madre residen en muchos tejidos adultos donde producen continuamente nuevas células en los que tienen un elevado recambio (sangre, piel e intestino), o sirven como reservorio para el reemplazo celular gradual y reparación, en aquellos que poseen células con recambio más bajo (hígado cerebro y músculo). Es un hecho reconocido que la funcionalidad de las células madre, como la de otras células, decrece con la edad, pero hay que conocer hasta que grado los trastornos de la edad afectan la función reparadora y renovadora de las células madre. (Ver Capítulo 9, Células madre) La menor capacidad regeneradora y renovadora de las células madre en la mayoría de los tejidos, debida al envejecimiento, se debe a una combinación de cambios, que son los que van a impedir que dichas células ejerzan su función y participen en el mantenimiento y reparación de los tejidos. En el músculo esquelético adulto, donde las células madre residentes, denominadas células satélite, son capaces de regenerar de manera rápida y efectiva el tejido muscular en respuesta a cualquier lesión, existe una progresiva y ostensible pérdida del potencial regenerativo en animales a medida que transcurre la edad. La activación de las células satélite y la determinación del destino celular se encuentran controlados por una vía 29

30 Capítulo 1 señalizadora, la vía NOTCH cuya actividad se desencadena mediante la unión con su ligando Delta, cuya expresión se inicia de manera rápida en respuesta a cualquier lesión. En músculo de animales viejos la expresión del factor Delta está notablemente disminuida, lo cual va a afectar en gran manera al funcionamiento de la vía señalizadora NOTCH y con ello al potencial regenerativo de las células satélites. Experimentos de Convoy y Rando han demostrado, que si se induce indirectamente la actividad de la vía NOTCH se puede restaurar la capacidad regenerativa de las células satélite. Esta inducción se ha conseguido mediante la exposición de las células satélite de ratones viejos a suero de ratones jóvenes, bien in vivo por emparejamiento parabiótico heterocrónico (circulación compartida), de un ratón viejo con un ratón joven, o in vitro, mediante la adición de suero de ratones jóvenes al medio de cultivo de células de ratón viejo. De esta manera se ha observado que algún componente del suero de animales jóvenes activa la vía señalizadora NOTCH y con ello la respuesta proliferativa de las células satélite y se consigue un rejuvenecimiento del animal viejo o de las células en cultivo procedentes de animales viejos, a expensas del plasma de ratones jóvenes. Estos resultados han llevado a la conclusión que el potencial regenerativo persiste en las células satélite, las cuales a pesar del envejecimiento no han perdido su capacidad de participar en el mantenimiento y reparación del tejido muscular, capacidad que recuperan al contacto con factores séricos presentes en el animal joven y que se han ido perdiendo por efecto del envejecimiento. Por tanto, el que las células madre de animales muy viejos sean capaces ejercer su misión de mantenimiento y reparación de los tejidos de animales viejos y mantengan su capacidad regeneradora intrínseca, lo proporciona un medio ambiente óptimo. Así, se ha demostrado que la capacidad regeneradora intrínseca de las células madre musculares puede ser restaurada forzando la activación de la vía señalizadora NOTCH. Otros experimentos han puesto de manifiesto, que el descenso en la renovación del tejido muscular con la edad se asocia con un incremento en fibrosis tisular y esto se debe a que las células madre musculares o células satélite de animales viejos, tienden a transformarse en linaje fibrogénico. Basándose en esta observación Brack et al., han observado que este cambio está mediado por factores en el ambiente sistémico de los propios animales viejos y se asocia con la activación de la vía señalizadora Wnt, activación que puede ser suprimida por inhibidores de Wnt. Además, componentes del suero de los animales viejos, que se unen a los receptores de WNT, la familia de proteínas Frizzled, pueden ser la causa de la mayor de la señalización de 30