Anti-HBsAg. Imuno-Elisa

Transcripción

1 BIBLIOGRAFIA/ BIBLIOGRAPHY/ BIBLIOGRAFÍA 1. Lee, W.M.: Hepatitis B Viral Infection. N Engl J Med, 337 (24): , Vyas, G.N. and Yen, T.S.B.: Hepatitis B Vírus: Biology, Pathogenesis, Epidemiology, Clinical Description, and Diagnosis. In: Spencer, S. editor. Viral Hepatitis Diagnosis, Therapy, and Prevention. Human Press: 35-63, Fagan, E.A. and Harrison, T.J.: Hepatitis B (HBV) and Hepatitis D (HDV, delta) Viruses. In Viral Hepatitis. BIOS, United Kingdom, , Dufour D.R 4.., Lott, J.A., Nolte, F.S., Gretch, D.R., Koff, R.S., Seeff, L.B.: Diagnosis and monitoring of hepatic injury. I. Performance characteristics of laboratory tests. Clin Chem, 46(12): , Turgeon, M.L.: Viral Hepatitis. Immunology & Sorology In Laboratory Medicine, 3rd Ed., Mosby: , Zhang, B.H., Yang, B.H., and Tang, Z.Y.: Randomized controlled trial of screening for hepatocellular carcinoma. J Cancer Res Clin Oncol, 130(7): , Centers for Disease Control and Prevention (CDC), Screening for chronic hepatitis B among Asian/Pacific Islander populations--new York City, MMWR Morb Mortal Wkly Rep, 55(18): , 20b. 8. Lok, A.S., McMahon, B.J.: Chronic hepatitis B. Hepatology, 45:507, MS Imuno-Elisa Anti-HBsAg Kit para determinação qualitativa de Anticorpos Anti-Antígeno de Superfície da Hepatite B no soro ou plasma humano, por enzimaimunoensaio (ELISA). Kit for the qualitative detection of Hepatitis B Surface Antibody (HBsAb) in human serum or plasma, by Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Kit para determinación cualitativa de Anticuerpos Anti-Antígeno de Superficie de la Hepatitis B en suero o plasma humano, por enzimainmunoensayo (ELISA). R E F R E F E - 96 determinações / determinations / determinaciones E determinações / determinations / determinaciones WAMA Diagnóstica Rua Aldo Germano Klein, CEAT CEP São Carlos - SP - Brasi Fone / Fax SAC Edição I: Rev. 09/2012

2 01 18 PORTUGUÊS IMPORTÂNCIA CLÍNICA O vírus da hepatite B (HBV) pertence à família Hepadnaviridae, que compreende uma série de vírus hepatotrópicos. Ele apresenta uma estrutura externa ou superficial (antígeno de superfície - HBsAg) e outra interna denominada centro ou core (HBcAg). Há também uma fração antigênica, oriunda da parte central, denominada antígeno e (). No soro de pacientes infectados podem-se observar duas formas: uma partícula completa (partícula de Dane) com 42 nm de diâmetro e nucleocapsídeo de 27 nm, que é indicativa de replicação viral, cujo marcador é a presença do, e partículas esféricas ou tubulares de 22 nm de diâmetro, constituídas apenas pelo envelope viral. O principal antígeno do envelope é o HBsAg, enquanto no core são encontrados o HBcAg e o. Há quatro principais subtipos sorológicos de HBsAg: adw, ayw, adr e ayr. A resolução de qualquer infecção pelo HBV, ocasionada por qualquer sorotipo, culmina com a produção de anti-hbsag contra o epítopo a presente em todos os sorotipos. O HBsAg é o primeiro marcador sorológico a positivar em infecção por HBV. A presença de HBsAg freqüentemente antecede o início dos sintomas e das anormalidades bioquímicas hepáticas por 6-8 semanas. Em pacientes que se curam, o HBsAg desaparece do soro em semanas após o início dos sintomas ou do aumento das concentrações das aminotransferases. A persistência de HBsAg positivo por mais de 6 meses é geralmente indicativo de infecção crônica, podendo evoluir para cirrose ou carcinoma hepatocelular. O surgimento do anti-hbsag e conseqüente desaparecimento do HBsAg confere imunidade ao indivíduo, fato esse em que se baseia a vacinação para a hepatite B através da utilização de HBsAg purificado para o desenvolvimento do anti-hbsag. Entre o desaparecimento do HBsAg e o aparecimento do anti-hbsag há um período onde não se encontram o marcador antígeno de superfície da hepatite B e seu correspondente anticorpo, o qual é conhecido como janela imunológica, provavelmente devido à presença de imunocomplexos HBsAg anti-hbsag. Nesta fase sorológica ou quando a concentração de HBsAg não atinge níveis mínimos de detecção do teste, a detecção do HBcAg-IgM torna-se o marcador isolado de infecção aguda do vírus da hepatite B. 7. Dejar que los reactivos adquieran la temperatura ambiente (20 25 ºC) antes de iniciar los tests 8. Los reactivos deben ser homogeneizados suavemente por inversión y cubiertos de forma inmediata después de su uso. 9. No dejar que los pocillos de la microplaca se sequen durante el ensayo. 10. Evitar pipetear repetidamente los reactivos en stock, pues esto puede causar contaminación Las muestras que serán testeadas y los sueros controles deben ser utilizados al mismo tiempo para mantener las mismas condiciones del test. 12. No usar reactivos después de la fecha de validez. 13. Descartar el material conforme a las reglamentaciones locales. 14. Seguir las Buenas Prácticas de Laboratorio (BPL) en la conservación, manipulación y descarte de los materiales. MARCADOR HBsAg Anti-HBsAg Anti-HBcAg Total Anti-HBcAg IgM Anti- HEPATITIS B Interpretación de los Marcadores SIGNIFICADO Es el primer marcador que aparece en la hepatitis B. Disminuis dentro de 6 meses. Su presencia durante más de 6 meses indica hepatitis crónica. Su presencia indica inmunidad al VHB. Presente después de la desaparición de HBsAg. Está presente sólo en los individuos vacunados. Su presencia significa una infección reciente o pasada por VHB. Necesidad de otros marcadores para caracterizar la etapa de la enfermedad. Indica infección reciente. Se puede encontrar en hasta 32 semanas después de la infección. Se trata de un marcador de la replicación viral. Su presencia indica infectividad alta. En las cepas mutadas pre-core (que no producen la proteína "e") pueden estar ausentes, aunque la replicación viral a continuar, y en consecuencia su alta infectividad. Indica el final de la fase de replicación viral. Aparece después de la desaparición de. O Imuno-ELISA Anti-HBsAg da WAMA é um teste imunoenzimático, tipo sanduiche, que utiliza proteínas recombinantes da região do envelope viral do HBV, epítopos ad e ay, para detectar a presença de anticorpos anti-hbsag no soro ou plasma humano, com a finalidade de determinar concentração de anticorpos anti- HBsAg para monitorar a recuperação de pacientes com infecção pelo vírus da hepatite B ou como indicador de resposta imune ao uso de vacina para hepatite B. PRINCÍPIO DO MÉTODO As cavidades da placa de microtitulação são cobertas com antígeno HBsAg (fase sólida). Amostras de soro ou plasma contendo anticorpos anti-hbsag são adicionadas às cavidades juntamente com um conjugado HBsAg marcado com peroxidase. Após a incubação, haverá a formação de um complexo antígeno-anticorpo-antígeno representado pelo conjugado HBsAg marcado com peroxidase, pelo anticorpo anti-hbsag da amostra e pelo antígeno HBsAg ligado à cavidade da microplaca. O material não ligado é removido por lavagem. Um substrato (TMB + peróxido de hidrogênio) é adicionado, o qual desenvolverá cor azul nas cavidades onde a enzima peroxidase estiver presente, indicando a presença do anticorpo anti-hbsag. A adição de uma solução stop ácida para bloqueio da reação enzimática mudará a cor da solução para amarela. A absorbância é então medida a 450 nm. A concentração do anticorpo anti-hbsag é diretamente proporcional a intensidade da cor da reação. APRESENTAÇÃO DO KIT R E F E - 96 determinações 1. Microplaca com cavidades cobertas com antígeno HBsAg (12 tiras removíveis com 8 cavidades cada) 2. Solução de lavagem - 20 x concentrada (1 x 30 ml) 3. Conjugado HBsAg marcado com peroxidase (1 x 6,5 ml) 4. Substrato Cromógeno Solução A (Peróxido de Hidrogênio) (1 x 7,0 ml) 5. Substrato Cromógeno Solução B (TMB) (1 x 7,0 ml) 6. Solução Stop (1 x 7,0 ml) 7. Soro Controle Negativo (1 x 1 ml) 8. Soro Controle Positivo (1 x 1 ml) 9. Instruções para uso HEPATITIS B Interpretación de los Resultados Serológicos** Interpretación HbsAg Anti-HBsAg Anti-HBcAg Total Anti-HBcAg IgM Anti- No Inmune (-) (-) (-) (-) (-) (-) Infección Reciente (+) (-) (+) (+) (+) (-) Inicio Convalecencia Inmune - Reciente Infección Pasada Inmune - Infección Pasada Inmune - Infección Pasada Inmune Uso de Vacuna (-) (-) (+) (+) (-) (-) (-) (+) (+) (-) (-) (+) (-) (+) (+) (-) (-) (-) (-) (-)* (+) (-) (-) (-) (-) (+) (-) (-) (-) (-) * El anti-hbsag puede ser indetectable por las pruebas serológicas de infección previa después de mucho tiempo. ** Perfiles serológicos atípicos se pueden encontrar en el curso de la infección por VHB. TÉRMINO DE GARANTÍA WAMA Diagnóstica garantiza el cambio de este conjunto diagnóstico, siempre y cuando esté dentro del plazo de validez y sea comprobado por su asesor técnico que no hubo fallas en la ejecución, manejo y conservación de este producto. WAMA y sus distribuidores no se responsabilizan por fallas en el kit bajo estas condiciones.

3 17 02 En un estudio de 304 muestras de suero y plasma obtenidas de un laboratorio de referencia, de los cuales 94 eran positivos y 210 negativos se determinó la sensibilidad y la especificidad de lo kit Imuno-ELISA anti- HBsAg da WAMA. Sensibilidad = Verdaderos Positivos / (Verdaderos Positivos + Falsos Negativos) x 100 Especificidad = Verdaderos Negativos / (Verdaderos Negativos + Falsos Positivos) x 100 Verdaderos Positivos RESULTADO 94 Falsos Verdaderos Falsos Sensibilidad Especificidade Positivos Negativos Negativos ,55 ESPECIFICIDAD ANALÍTICA No se observó reacción cruzada con sueros de pacientes infectados por el virus de la hepatitis A, vírus de la hepatitis C, HIV, citomegalovírus y Treponema pallidum. Durante las pruebas, no hay efecto "Hook" en las concentraciones elevadas de anticuerpos se observaron ni interferencia de factor reumatoide hasta la concentración 2000 U/ml fue verificado. Las características de rendimiento de la prueba no es afectada por las altas concentraciones de bilirrubina y hemoglobina. PRECISIÓN DEL TEST a. Precisión Intraensayo La precisión intra-ensayo se determinó mediante el ensayo de 2 muestras de suero positivos, una alta y replica bajo, en 6 replicas. Número de Veces Promedia de las Desviación Muestras Positivas Alta Baja Absorbancias 2,492 0,3 Estándar 2,97% 0,72% b. Precisión Interensayo La precisión inter-ensayo se determinó analizando 1 muestra de suero positivos y una muestra de suero negativa para seis carreras diferentes. Muestras Positivas Positivo Negativo Número de Veces Promedia de las Absorbancias 2,243 Desviación Estándar 0,083 3,73% 2,82% LIMITACIONES DE USO ŸLa prueba Imuno-ELISA Anti-HBsAg de WAMA fue desarrollado para obtener la más alta sensibilidad y especificidad. ŸResultados repetidamente reactivos siempre se deben interpretar con información clínica del paciente y los resultados de otras pruebas de laboratorio. ŸEjemplos de reactivos que se convierten en no reactivo al repetir la prueba debe considerarse no reactivo. ŸDebido a la alta sensibilidad de la ELISA, los resultados falsos positivos pueden ocurrir debido a diversas razones, muchos de los cuales están relacionados, pero no se limitan a paso de lavado inadecuado. ŸLa prevalencia de la enfermedad en la población evaluada afectará el valor predictivo de la prueba. PRECAUCIONES Y ADVERTENCIAS 1. Los reactivos deben conservarse entre 2 8 ºC. 2. La fecha de validez corresponde al último día del mes señalado en la etiqueta de los frascos y de la caja del kit 3. Se debe evitar exponer los reactivos a temperaturas elevadas, así como directamente al sol. 4. No congele cualquier reactivo, pues esto causará deterioro irreversible. 5. Lo Imuno-ELISA Anti-HBsAg de WAMA contiene material de origen humano, que se pusieron a prueba con resultados negativos para anticuerpos anti-hiv I e II, antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) (excepto el Suero Control Positivo) y anti-h. Debido a que ninguna prueba puede ofrecer completa seguridad, a falta de éstos y otros agentes infecciosos, se recomienda para el tratamiento de todos los reactivos como materiales potencialmente infecciosos, y tener el mismo cuidado en la eliminación de estos materiales. 6. No utilizar reactivos o microplacas de lotes diferentes. R E F E determinações 1. Microplacas com cavidades cobertas com antígeno HBsAg (24 tiras removíveis com 8 cavidades cada) 2. Solução de lavagem - 20 x concentrada (2 x 30 ml) 3. Conjugado HBsAg marcado com peroxidase (2 x 6,5 ml) 4. Substrato Cromógeno Solução A (Peróxido de Hidrogênio) (2 x 7,0 ml) 5. Substrato Cromógeno Solução B (TMB) (2 x 7,0 ml) 6. Solução stop (2 x 7,0 ml) 7. Soro Controle Negativo (2 x 1,0 ml) 8. Soro Controle Positivo (2 x 1,0 ml) 9. Instruções para uso PREPARAÇÃO E ESTABILIDADE DOS REAGENTES ŸMICROPLACA (1): Retirar do envelope a quantidade de tiras que serão usadas e deixá-las atingir a temperatura ambiente (20-25 ºC). As tiras que não forem utilizadas devem retornar ao envelope laminado, com dissecante, e mantidas entre 2-8 ºC. ŸTAMPÃO DE LAVAGEM 20 x concentrado (2): tampão salino-fosfato (PBS), ph 7,4, contendo Tween 20 como detergente. Diluir o volume do concentrado completando para 570 ml com água destilada ou deionizada. Se houver presença de cristais no tampão concentrado, eles devem ser dissolvidos a 37 ºC antes da diluição. Durante cada ciclo de lavagem, cada cavidade deve ser completada com aproximadamente 350µl do tampão diluído. Deixar atingir a temperatura ambiente (20-25 ºC) antes de usar. ŸCONJUGADO HBsAg MARCADA COM PEROXIDASE (3): pronto para uso. Estável entre 2-8 ºC até a data do vencimento impressa na etiqueta do frasco. Não congelar. Deixar atingir a temperatura ambiente (20-25 ºC) antes de usar. ŸSUBSTRATO CROMÓGENO SOLUÇÃO A (PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO URÉIA) (4): estabilizado e pronto para uso. Estável entre 2-8 C até a data de vencimento impressa na etiqueta do frasco. Não congelar. Deixar atingir a temperatura ambiente (20-25 ºC) antes de usar. ŸSUBSTRATO CROMÓGENO SOLUÇÃO B (TMB) (5): solução estabilizada de tetrametilbenzidina. Pronta para uso. Estável entre 2-8 ºC até a data de vencimento impressa na etiqueta do frasco. Não congelar. Deixar atingir a temperatura ambiente (20-25 ºC) antes de usar. O TMB é não mutagênico e não carcinogênico. ŸSOLUÇÃO STOP (6): pronta para uso. Contém ácido sulfúrico (H2SO4) 1,0 M. Manusear com cuidado. É corrosivo. Em caso de contato com a pele lavar abundantemente em água corrente. Deixar atingir a temperatura ambiente (20-25 ºC) antes de usar. Estável até a data do vencimento impressa no etiqueta do frasco. ŸSORO CONTROLE NEGATIVO (7): soro humano negativo para Anti-HBsAg. Pronto para uso. Usar puro, ou seja, não diluído. Estável entre 2-8 ºC até a data do vencimento impressa na etiqueta do frasco. Contém ProClin 300 a 0,05% como conservante. ŸSORO CONTROLE POSITIVO (8): soro humano positivo para Anti-HBsAg. Pronto para uso. Usar puro, ou seja, não diluído. Estável entre 2-8 ºC até a data do vencimento impressa na etiqueta do frasco. Contém ProClin 300 a 0,05% como conservante. Obs.: O kit mantém o mesmo desempenho após a primeira utilização, e é estável até a data de validade descrita no rótulo, desde que mantido na temperatura indicada (2-8ºC). AMOSTRAS Usar amostra de soro ou plasma livre de hemólise, lipemia e contaminação. A amostra pode ser conservada em geladeira entre 2-8 ºC por 48 horas. Para longo tempo, devem ser mantidas no freezer a -20 ºC. Amostras congeladas devem ser homogeneizadas antes do teste. Evitar formação de espuma. Evitar repetidos congelamentos e descongelamentos, pois isto pode causar falsos resultados. Não usar amostras inativadas. MATERIAL NECESSÁRIO, MAS NÃO FORNECIDO ŸMicropipeta (50 µl) e ponteiras. ŸÁgua destilada ou deionizada para diluição do tampão de lavagem. ŸAgitador de microplaca. ŸIncubador com temperatura de 37 ºC.

4 03 16 ŸLeitora de microplaca com filtro de 450 nm. ŸLavadora de Microplaca ŸPapel absorvente. ŸRecipiente para descarte de material. PROCEDIMENTO IMPORTANTE: Medidas de absorbância bicromática usando um filtro de referência com comprimento de onda de 630 nm é recomendado quando disponível. Nesta condição, o uso do blank deve ser desconsiderado, uma vez que ele somente deve ser usado quando utilizado um único filtro de 450 nm. 1. De acordo com o plano estabelecido de distribuição na placa, usar 3 cavidades para o soro controle negativo (7) e 2 cavidades para o soro controle positivo (8). Usar 1 cavidade para o blank, o qual conterá somente 50 µl do substrato cromógeno Solução A (4) e 50 µl do substrato cromógeno Solução B (5). 2. Dispensar 50 µl dos soros controles positivo e negativo (sem diluir) conforme o estabelecido no item 1. Dispensar 50 µl das amostras nas outras cavidades a serem testadas. Usar ponteiras individuais para cada pipetagem, evitando com isso contaminação. 3. Dispensar 50 µl do conjugado (3) em todas as cavidades, exceto no blank. 4. Homogeneizar levemente, batendo com os dedos nas bordas da placa ou por vibração mecânica (agitador de placa) por 30 segundos. 5. Cobrir a placa com folha adesiva e incubar a 37 ºC por 60 minutos. 6. Descartar o conteúdo da placa dentro de um recipiente contendo solução desinfetante, tendo o cuidado de evitar contaminação entre as cavidades. 7. Lavar a placa 5 vezes com a solução de lavagem diluída (2) (ver Preparação e Estabilidade dos Reativos). Aspirar o conteúdo da microplaca, dispensar 350 µl de solução de lavagem diluída (2) em cada cavidade, aguardar 30 segundos e esvaziar o conteúdo das cavidades. Repetir 4 vezes este procedimento (total de 5 ciclos). Recomenda-se o uso de uma lavadora de microplaca manual ou automática. ATENÇÃO: O correto procedimento de lavagem é fundamental para uma boa performance do ensaio. 8. Após a última lavagem, inverter a placa e batê-la sobre papel absorvente para remover todo o líquido residual. 9. Dispensar 50 µl do substrato cromógeno Solução A (4) e 50 µl do substrato cromógeno Solução B (5) em cada cavidade da microplaca, inclusive no blank. Haverá o desenvolvimento de cor azul onde a enzima peroxidase estiver presente. Homogeneizar levemente, batendo com os dedos nas bordas da placa ou por agitação mecânica (agitador de placa) por 30 segundos. 10. Incubar a 37 C por 15 minutos, protegendo da luz. 11. Bloquear a reação dispensando 50 µl da solução stop (6) em cada cavidade da microplaca, inclusive no blank. A cor da solução mudará para amarela. Homogeneizar levemente, batendo com os dedos nas bordas da placa ou por agitação mecânica (agitador de placa) por 30 segundos. 12. Ler a absorbância (D.O.) em um leitor de microplaca com filtro de 450 nm, contra o blank do substrato, dentro de 5 minutos. NOTA: Medidas de absorbância bicromática usando um filtro de referência com comprimento de onda de 630 nm é recomendado quando disponível. IMPORTANTE: O procedimento de lavagem é crítico para o desempenho do teste. Lavagens insuficientes resultarão leituras pouco precisas ou absorbâncias falsamente elevadas. A realização dos testes em duplicata, embora não obrigatória, é recomendada. O tempo levado para pipetagem das amostras e controles não deve exceder 30 minutos. RESUMO DO PROCEDIMENTO 1. Pipetar 50 µl da amostra, controle negativo (7) (3 cavidades) e controle positivo (8) (2 cavidades) na microplaca. 2. Pipetar 50 µl do conjugado (3) em cada cavidade da placa, exceto blank. 3. Homogeneizar por 30 segundos e Incubar a 37 ºC por 60 minutos. 4. Descartar o conteúdo da placa e lavar 5 vezes com solução de lavagem (2) 5. Descartar completamente o conteúdo da última lavagem, removendo todo o líquido residual. 6. Pipetar 50 µl do substrato cromógeno Solução A (4) e 50 µl do substrato cromógeno Solução B (5) em cada cavidade da placa, inclusive no blank (deverá conter somente estes reativos). A cor da solução fica azul onde houver peroxidase. cada pocillo de la microplaca, inclusive el blank (debese contener solamiente estes reactivos). El color de la solución se volverá azul donde sea detectada la presencia de peroxidasa. 7. Homogeneizar por 30 segundos e Incubar en la oscuridad a 37 C por 15 minutos. 8. Pipetear 50μl de la Solución Stop (6) en cada pocillo de la microplaca. El color de la solución se volverá amarillo. 9. Homogeneizar por 30 segundos. 10. Leer la D.O. en un lector de microplacas con filtro de 450 nm, contra el blank, o en duplo comprimiento de onda (450/630nm), dentro de 5 minutos. A B C D E F G H EJEMPLO DE ESQUEMA DE DISTRIBUICIÓN EN LA MICROPLACA 1 Blank Neg. Coltrol Neg. Control Neg. Control Pos. Control Pos. Control A1 A2 2 A3 A4 A5 A6 A CÁLCULOS DE LOS RESULTADOS Determinar para cada test y sueros controles la densidad óptica (D.O.), cuyo valor final se obtiene restando de la lectura de la D.O. el valor del blank. Si dupla longitud de onda dual se utiliza, lo "blanco" se omite, y por lo tanto las lecturas de D.Os. se utilizan sin sustracción. Si más de una placa que se utiliza debe ser considerado por separado para el cálculo y la interpretación de los resultados. Determinar el valor del Cut-off: Cut-off = promedio de la D.O. de los Controles Negativos x 2,1 Atención: Si el valor promedio de la D.O. de los controles negativos es inferior a 0,05, se debe considerar como 0,05. Si el valor es superior a 0,05 debe ser considerado el valor de la D.O. medida, respectando lo criterio de validación del test. Ejemplo: Valor promedio de los Controles Negativos = 0,03 Entonces, CUT-off = 0,05 x 2,1 = 0,105 VALIDACIÓN DEL TEST: El test es válido si: ŸLa D.O. del "blank", que contiene solamiente los Sustrato Cromógeno A y B y Solución Stop, debe ser inferior a 0,080 a 450 nm. ŸLo valor de la D.O. de los controles negativos deben ser inferior a 0,100 a 450/630 nm o a 450 nm después de sustraer el "blank". ŸLo valor de la D.O. de los controles positivos deben ser igual o mayor a 0,800 a 450/630 nm o a 450 nm después de sustraer el "blank". INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS Dividir lo valor de D.O. de la muestra de paciente por lo valor de Cut-off. Lo test es considerado: REACTIVO : valor igual o mayor que 1,1. DUDOSO (Borderline) : valor está entre 0,9 y 1,1. NO REACTIVO : valor menor que 0,9. ADVERTENCIA: ES SIEMPRE RECOMIENDADO REPETER LO TEST EN LAS MUESTRAS REACTIVAS. SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD DE LO TEST SENSIBILIDAD ANALÍTICA Lo Imuno-ELISA Anti-HBsAg (Qualitativo) tiene sensibilidad de 5 mui/ml.

5 15 04 ŸIncubadora con una temperatura de 37 º C ŸLector de micro placa con filtro de 450 nm ŸLavador de microplaca. ŸPapel absorbente. ŸRecipiente para descarte de material. PROCEDIMIENTO IMPORTANTE: Mediciones de absorbancia bicromático utilizando un filtro de referencia con longitud de onda de 630 nm filtro se recomienda cuando disponible. En esta condición, el uso de "blanco" debe ser descartado, ya que solo se utilizan cuando se utiliza un solo filtro de 450 nm. 1. De acuerdo con el plan establecido de distribución en la placa, usar 3 pocillos para el suero control negativo (7) y 2 pocillos para el suero control positivo (8). Usar 1 pocillo para el blank, el cual contendrá solamente 50μl delsustrato cromógeno Solución A (4) y 50μl del sustrato cromógeno Solución B (5). 2. Dispensar 50μl de los sueros controles positivo y negativo (sin diluir) conforme a lo establecido en el ítem 1. Dispensar 50μl de las muestras en los otros pocillos que serán testeados. Usar puntas de pipeta individuales para cada pipeteado, evitando la contaminación. 3. Dispensar 50μl del conjugado (3) en todos los pocillos, excepto el blank. 4. Homogeneizar suavemente, tamborileando con los dedos sobre los bordes de la placa o por vibración mecánica (agitador de placa) por 30 segundos. 5. Cubrir la placa con papel adhesivo e incubar a 37 ºC por 60 minutos. 6. Descartar el contenido de la placa en un recipiente con solución desinfectante, teniendo cuidado de evitar la contaminación entre pocillos. 7. Lavar la placa 5 vezes con la solución de lavado diluida (2) (ver Preparación y Estabilidad de los Reactivos). Aspirar el contenido de la microplaca, dispensar 350μl de solución de lavado diluida (2) en cada pocillo, esperar 30 segundos y vaciar el contenido de los pocillos. Repetir 4 veces este procedimiento (total de 5 ciclos). Se recomienda utilizar un lavador de microplacas automático o manual. ADVERTENCIA: Es fundamental, para un buen desempeño del ensayo, que los procedimientos de lavado sean adecuados. 8. Después del último lavado, invertir la placa y golpearla sobre papel absorbente para eliminar cualquier residuo líquido. 9. Dispensar 50μl del sustrato cromógeno Solución A (4) y 50μl del sustrato cromógeno Solución B (5) en cada pocillo de la microplaca, inclusive el blank. Aparecerá un color azul donde esté presente la enzima peroxidasa. Homogeneizar suavemente, tamborileando con los dedos sobre los bordes de la placa o por vibración mecánica (agitador de placa) por 30 segundos. 10. Incubar a 37 C por 15 minutos, protegerlo de la luz. 11. Bloquear la reacción dispensando 50μl de la solución Stop (6) en cada pocillo de la microplaca, inclusive el blank. La solución se tornará amarilla. Homogeneizar suavemente, tamborileando con los dedos sobre los bordes de la placa o por vibración mecánica (agitador de placa) por 30 segundos. 12. Leer la absorbancia (D.O.) en un lector de microplacas con un filtro de 450 nm, contra el blank del sustrato, en un plazo de 5 minutos. NOTA: Mediciones de absorbancia bicromático utilizando un filtro de referencia con longitud de onda de 630 nm filtro se recomienda cuando disponible. IMPORTANTE: El procedimiento de lavado es fundamental para el desempeño del test. Un mal lavado dará lugar a lecturas inexactas o absorbancias falsamente elevadas. Se recomienda la realización de los tests por duplicado, aunque no sea obligatorio. El pipeteo de las muestras y los controles no debe exceder 30 minutos. RESUMEN DEL PROCEDIMIENTO 1. Pipetear 50μl de la muestra, control negativo (7) (3 pocillos) y control positivo (8) (2 pocillos) en la microplaca. 2. Pipetear 50μl del conjugado (3) en cada pocillo de la placa, excepto el blank.. 3. Mezclar durante 30 segundos y se incuban a 37 C durante 60 minutos. 4. Descartar el contenido de la placa y lavar 6 veces con tampón de lavado (2) 5. Descartar completamente el contenido del último lavado, eliminando todo el residuo líquido. 6. Dispensar 50μl del sustrato cromógeno Solución A (4) y 50μl del sustrato cromógeno Solución B (5) en 7. Homogeneizar por 30 segundos e Incubar no escuro a 37 C por 15 minutos. 8. Pipetar 50 µl da solução stop (6) em cada cavidade da microplaca. A cor da solução ficará amarela. 9. Homogeneizar por 30 segundos. Ler a D.O. em um leitor de microplaca com filtro de 450 nm contra o blank, ou um duplo comprimento de onda (450/630nm), dentro de 5 minutos. A B C D E F G H EXEMPLO DE ESQUEMA DE DISTRIBUIÇÃO NA MICROPLACA 1 Blank Controle Neg. Controle Neg. Controle Neg. Controle Pos. Controle Pos. A1 A2 2 A3 A4 A5 A6 A CÁLCULOS DOS RESULTADOS Determinar para cada teste e soros controles a densidade óptica (D.O.), cujo valor final é obtido subtraindo da leitura da D.O. do blank. Se duplo comprimento de onda é usado o blank é omitido e, portanto, as leituras das D.Os. são usadas sem subtração. Se mais do que uma microplaca for utilizada elas devem ser consideradas separadamente para cálculos e interpretação dos resultados. Determinar o valor do Cut-off: Cut-off = média da D.O. dos Controles Negativos x 2,1 Atenção: Se o valor médio da D.O. dos controles negativos é menor do que 0,05, ele deve ser considerado como 0,05. Se o valor é maior que 0,05 deve ser considerado o valor da D.O. medida, respeitando o critério de validação do teste. Exemplo: Valor Médio dos Controles Negativos = 0,03 Então, CUT-off = 0,05 x 2,1 = 0,105 VALIDAÇÃO DO TESTE: O teste é válido se: A D.O. do blank, que contém somente Substrato Cromógeno A e B e Solução Stop, deve ser menor do que 0,080 a 450 nm. O valor da D.O. dos controles negativos deve ser menor do que 0,100 a 450/630 nm ou a 450 nm após subtrair o blank. O valor da D.O. dos controles positivos deve ser igual ou maior do que 0,800 a 450/630 nm ou a 450 nm após subtrair o blank. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS Dividir o valor da D.O. da amostra do paciente pelo valor do Cut-off. O teste é considerado: REAGENTE : se valor igual ou maior do que 1,1. DUVIDOSO (Borderline) : se valor entre 0,9 e 1,1. NÃO REAGENTE : se valor menor do que 0,9. ATENÇÃO: É SEMPRE RECOMENDADO REPETIR O TESTE NAS AMOSTRAS REAGENTES. SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE DO TESTE SENSIBILIDADE ANALÍTICA O Imuno-ELISA Anti-HBsAg (Qualitativo) tem sensibilidade de 5 mui/ml.

6 05 14 Em um estudo realizado com 304 amostras de soro e plasma obtidas de um Laboratório de referência, das quais 94 eram positivas e 210 negativas foram determinadas a sensibilidade e especificidade do kit Imuno- ELISA anti-hbsag da WAMA. Sensibilidade = Verdadeiros Positivos / (Verdadeiros Positivos + Falsos Negativos) x 100 Especificidade = Verdadeiros Negativos / (Verdadeiros Negativos + Falsos Positivos) x 100 Verdadeiros Falsos Verdadeiros Falsos Sensibilidade Especificidade Positivos Positivos Negativos Negativos RESULTADO ,55 ESPECIFICADADE ANALÍTICA Não foi observada reação cruzada em soros de pacientes infectados por vírus da hepatite A, vírus da hepatite C, HIV, citomegalovírus e Treponema pallidum. Durante os testes realizados, nenhum efeito Hook para altas concentrações de anticorpos foi observado nem interferência com fator reumatoide até a concentração de 2000 UI/mL foi verificada. A performance característica do teste não é afetada por concentrações elevadas de bilirrubina e hemoglobina. PRECISÃO DO TESTE a. Precisão Intra-Ensaio A precisão intra-ensaio foi determinada ensaiando 2 amostras de soros positivos, uma alta e outra baixa, em replicatas. Amostras Positivas Alta Baixa Número de Vezes Média das Absorbâncias 2,492 0,3 Desvio Padrão 2,97% 0,72% b. Precisão Inter-Ensaio A precisão inter-ensaio foi determinada ensaiando 1 amostra de soros positivos e 1 amostra de soro negativo em 6 diferentes corridas. Amostras Positivas Alta Baixa Número de Vezes Média das Absorbâncias 2,243 Desvio Padrão 0,083 3,73% 2,82% LIMITAÇÕES DE USO ŸO teste Imuno-ELISA Anti-HBsAg da WAMA foi desenvolvido para se obter a mais alta sensibilidade e especificidade. ŸResultados repetidamente reagentes devem ser sempre interpretados com as informações clínicas do paciente e com os resultados de outros testes laboratoriais. Ÿ Amostras reagentes que se tornam não reagentes quando retestadas devem ser consideradas não reagentes. ŸDevido à alta sensibilidade dos testes ELISA, falsos resultados positivos podem ocorrer devido à várias razões, muitas das quais estão relacionadas, mas não limitadas, à inadequada etapa de lavagem. ŸA prevalência da doença na população avaliada afetará o valor preditivo do teste. PRECAUÇÕES E ADVERTÊNCIAS 1. Os reagentes devem ser conservados entre 2 8 ºC. 2. A data de validade corresponde ao último dia do mês assinalado nos rótulos dos frascos e da caixa do kit. 3. Deve ser evitado expor os reagentes a temperaturas elevadas, bem como diretamente ao sol. 4. Não congelar nenhum reagente, pois isto causará deterioração irreversível. 5. O Imuno-ELISA Anti-HBsAg da WAMA contém materiais de origem humana, os quais foram testados, com resultados negativos para anticorpos anti-hiv I e II, antígeno de superfície da hepatite B (HBsAg) (exceto o Soro Controle Positivo) e anti-h. Porém, como nenhum método diagnóstico oferece completa segurança, na ausência destes e de outros agentes infecciosos, recomenda-se tratar todos os reagentes como materiais potencialmente infecciosos, bem como ter o mesmo cuidado no descarte destes materiais. 6. Não utilizar reagentes ou microplacas de lotes diferentes. 7. Deixar os reagentes adquirir a temperatura ambiente (20 25 ºC) antes de iniciar os testes. 8. Suero Control Positivo (1 x 1 ml) 9. Instrucciones de uso R E F E determinaciones 1. Microplacas con pocillos recubiertos con antígeno HBsAg (24 tiras extraíbles, con 8 pocillos c/u). 2. Solución de lavado - 20 x concentrada (2 x 30 ml) 3. Conjugado HBsAg marcado con peroxidasa (2 x 6,5 ml). 4. Sustrato Cromógeno Solución A (Peróxido de Hidrógeno) (2 x 7,0 ml) 5. Sustrato Cromógeno Solución B (TMB) (2 x 7,0 ml) 6. Solución Stop (2 x 7,0 ml) 7. Suero Control Negativo (2 x 1,0 ml) 8. Suero Control Positivo (2 x 1,0 ml) 9. Instrucciones de uso PREPARACIÓN Y ESTABILIDAD DE LOS REACTIVOS ŸMICRO PLACA (1): Retirar del envelope la cantidad de tiras que se utilizarán y dejar que alcancen la temperatura ambiente (20-25 ºC). Las tiras que no se utilicen deben regresar al sobre laminado, con disecante, y deben mantenerse entre 2-8 ºC. ŸSOLUCIÓN DE LAVADO 20 X concentrado (2): tampón fosfato salino (PBS), ph 7,4, conteniendo Tween 20 como detergente. Diluir el volumen del concentrado completando 570 ml con agua destilada o desionizada. Si hay cristales en el tampón concentrado, deben disolverse a 37 C antes de la dilución.. Durante cada ciclo de lavado, se debe completar cada pocillo con aproximadamente 350 µl del tampón. Dejar que alcance la temperatura ambiente (20-25 ºC) antes de usar ŸCONJUGADO HBsAg MARCADO CON PEROXIDASA (3): listo para usar. Estable entre 2-8 ºC hasta la fecha de vencimiento impresa en la etiqueta del frasco. No congelar. Dejar que alcance la temperatura ambiente (20-25 ºC) antes de usar ŸSUBSTRATO CROMÓGENO SOLUCIÓN A (PERÓXIDO DE HIDRÓGÊNO UREIA) (4): estabilizado y listo para usar Estable entre 2-8 ºC hasta la fecha de vencimiento impresa en la etiqueta del frasco. No congelar. Dejar que alcance la temperatura ambiente (20-25 ºC) antes de usar ŸSUSTRATO CROMÓGENO SOLUCIÓN B (TMB) (5): solución estabilizada de tetrametilbenzidina Listo para usar. Estable entre 2-8 ºC hasta la fecha de vencimiento impresa en la etiqueta del frasco. No congelar. Dejar que alcance la temperatura ambiente (20-25 ºC) antes de usar La TMB no es ni mutagénica ni carcinogénica. ŸSOLUCIÓN STOP (6): listo para usar. Contiene ácido sulfúrico (H2SO4) 1,0 M. Manipular con cuidado. Es corrosivo. En caso de contacto con la piel lavar abundantemente en agua corriente. Dejar que alcance la temperatura ambiente (20-25 ºC) antes de usar Estable hasta la fecha de vencimiento impresa en la etiqueta del frasco. ŸSUERO CONTROL NEGATIVO (7): suero humano negativo para Anti-HBsAg. Listo para usar. Usar puro, en otras palabras, no diluido. Estable entre 2-8 ºC hasta la fecha de vencimiento impresa en la etiqueta del frasco. Contiene Proclin 300 a 0,05% como conservante. ŸSUERO CONTROLE POSITIVO (8): suero humano positivo para Anti-HBsAg. Listo para usar. Usar puro, en otras palabras, no diluido. Estable entre 2-8 ºC hasta la fecha de vencimiento impresa en la etiqueta del frasco. Contiene Proclin 300 a 0,05% como conservante. Nota: El kit mantiene el mismo rendimiento después de la primera utilización, y es estable hasta la fecha de vencimiento descripta en la etiqueta, siempre que se mantenga a la temperatura indicada (2-8ºC). MUESTRAS Usar muestras de suero libres de hemólisis, lipemia y contaminación. Las muestras se pueden conservar en refrigerador, entre 2-8 ºC, por 48 horas. Durante un período mayor, deben guardarse en freezer a -20 ºC. Las muestras congeladas deberán homogeneizarse antes del test. Evite la formación de espuma. Evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación, ya que esto puede producir resultados falsos. No usar muestras inactivadas MATERIAL NECESARIO, NO SUMINISTRADO ŸMicropipeta (50μl) y puntas de pipeta. ŸAgua destilada o desionizada, para dilución de tampón de lavado. ŸAgitador de microplaca.

7 13 R E F ESPAÑOL IMPORTANCIA CLÍNICA El virus de la hepatitis B (HBV) pertenece a la familia Hepadnaviridae, que incluye una serie de virus hepatotrópicos. Cuenta con una estructura externa o superficial (antígeno de superficie - HBsAg) y otra interna denominada centro o core (HBcAg). También hay una fracción antigénica, oriunda de la parte central, denominada antígeno e (). En sueros de pacientes infectados se pueden observar dos formas: una partícula completa (partícula de Dane) con 42 nm de diámetro y nucleocápside de 27 nm, indicativo de la replicación viral, cuyo marcador es la presencia del, y partículas esféricas o tubulares de 22 nm de diámetro, constituidas sólo por la envoltura viral. El principal antígeno de la envoltura es el HBsAg, mientras que en el core se encuentran el HBcAg y el. Existen cuatro principales subtipos serológicos de HBsAg: adw, ayw, adr y ayr. La resolución de cualquier infección por el HBV, ocasionada por cualquier serotipo, culmina con la producción de anti-hbsag contra elepítopo a presente en todos los serotipos. El HBsAg es el primero marcador serológico a tornar positivo en una infección por VHB. La presencia de El HBsAg frecuentemente precede a la aparición de los síntomas y alteraciones bioquímicas del hígado durante 6-8 semanas. En los pacientes que se curan, el HBsAg desaparece del suero semanas después de la aparición de los síntomas o aumento de las concentraciones de aminotransferasas. La persistencia de el HBsAg positivo por más de 6 meses es generalmente indicativo de una infección crónica, puede progresar a cirrosis o carcinoma hepatocelular. El aumento de anti-hbsag y la consiguiente desaparición de HBsAg confiere inmunidad al individuo, hecho en que se basa la vacunación contra la hepatitis B, por medio de la utilización de HBsAg purificado para el desarrollo del anti-hbsag. Entre la desaparición del HBsAg y la aparición del anti-hbsag hay un período donde no se encuentra el marcador antígeno de superficie de la hepatitis B y su correspondiente anticuerpo; conocido como ventana inmunológica, probablemente debido a la presencia de inmunocomplejos HBsAg anti-hbsag. En esta fase serológica o cuando la concentración de HBsAg no alcanza los niveles mínimos de detección del test, la detección del HBcAg-IgM se convierte en un marcador aislado de la infección aguda del virus de la hepatitis B. El Imuno-ELISA Anti-HBsAg da WAMA es un test inmunoenzimático, tipo sanduiche, que utiliza proteínas recombinantes de la región de la envoltura viral del HBV, epítopos ad e ay, para detectar la presencia deanticuerpos anti-hbsag en suero o plasma humano, con la finalidad de determinar la concentración de anticuerpos anti-hbsag para monitorear la recuperación de pacientes con infección por el virus de la hepatitis B o como indicador de respuesta inmune a la utilización de la vacuna para la hepatitis B. PRINCIPIO DEL MÉTODO Los pocillos de la placa de microtitulación se recubren con antígeno HBsAg (fase sólida). Muestras de suero o plasma que contienen anticuerpos anti-hbsag se añaden a los pocillos junto con un conjugado HBsAg marcado con peroxidasa. Después de la incubación, se formará un complejo antígeno-anticuerpo-antígeno representado por el conjugado HBsAg marcado con peroxidasa, por el anticuerpo anti-hbsag de la muestra y por el antígeno HBsAg ligado al pocillo de la microplaca. El material no ligado se elimina mediante lavado. Un substrato (TMB + peróxido de hidrogênio) es adicionado, el cual revelará un color azul en los pocillos donde la enzima peroxidasa esté presente, indicando la existencia del anticuerpo anti-hbsag. La adición de una solución stop ácida para bloquear la reacción enzimática le dará un color amarillo a la solución. Entonces, la absorbancia se mide a 450 nm. La concentración del anticuerpo anti-hbsag es directamente proporcional a la intensidad del color de la reacción. PRESENTACIÓN DEL KIT R E F E - 96 determinaciones 1. Microplaca con pocillos recubiertos con antígeno HBsAg (12 tiras extraíbles, con 8 pocillos c/u). 2. Solución de lavado - 20 x concentrada (1 x 30 ml) 3. Conjugado HBsAg marcado con peroxidasa (1 x 6,5 ml). 4. Sustrato Cromógeno Solución A (Peróxido de Hidrógeno) (1 x 7,0 ml) 5. Sustrato Cromógeno Solución B (TMB) (1 x 7,0 ml) 6. Solución Stop (1 x 7,0 ml) 7. Suero Control Negativo (1 x 1 ml) 8. Os reagentes devem ser homogeneizados levemente por inversão e tampados imediatamente após o uso. 9. Não deixar as cavidades da microplaca secar durante o ensaio. 10. Evitar repetidas pipetagens dos reagentes estoques, pois isso pode causar contaminação. 11. As amostras a serem testadas e os soros controles devem ser utilizados ao mesmo tempo para manter as mesmas condições do teste. 12. Não usar reagentes após a data de validade. 13. Descartar o material conforme regulamentações locais. 14. Utilizar a Boas Práticas de Laboratórios (BPLs) na conservação, manuseio e descarte dos materiais. MARCADOR HBsAg Anti-HBsAg Anti-HBcAg Total Anti-HBcAg IgM Anti- HEPATITE B Interpretação dos Marcadores SIGNIFICADO É o primeiro marcador que aparece na hepatite B. Declina em até 6 meses. Sua presença por mais de 6 meses indica hepatite crônica. Sua presença indica imunidade ao HBV. Presente após o desaparecimento do HBsAg. Está presente isoladamente em indivíduos vacinados. Sua presença significa infecção recente ou pregressa pelo HBV. Necessita de outros marcadores para caracterizar a fase da doença. Indica infecção recente. Pode ser encontrado em até 32 semanas após a infecção. É marcador de replicação viral. Sua presença indica alta infecciosidade. Em cepas com mutação pré-core (não produtoras da proteína e ) pode estar ausente, embora a replicação viral continue e, consequentemente, sua alta infecciosidade. Indica o fim da fase de replicação viral. Surge após desaparecimento do. HEPATITE B Interpretação dos Resultados Sorológicos** Interpretação HbsAg Anti-HBsAg Anti-HBcAg Total Anti-HBcAg IgM Anti- Não Imune (-) (-) (-) (-) (-) (-) Infecção Recente (+) (-) (+) (+) (+) (-) Início Convalescência Imune Infecção Passada Recente Imune Infecção Passada Imune Infecção Passada Imune Uso de Vacina (-) (-) (+) (+) (-) (-) (-) (+) (+) (-) (-) (+) (-) (+) (+) (-) (-) (-) (-) (-)* (+) (-) (-) (-) (-) (+) (-) (-) (-) (-) * O anti-hbsag pode estar em níveis indetectáveis pelos testes sorológicos em infecção pregressa após longo tempo. ** Perfis sorológicos atípicos podem ser encontrados no curso da infecção pelo HBV. TERMO DE GARANTIA A WAMA Diagnóstica garante a troca deste conjunto diagnóstico, desde que o mesmo esteja dentro do prazo de validade e que seja comprovado por sua assessoria técnica que não houve falhas na execução, manuseio e conservação deste produto. A WAMA e seus distribuidores não se responsabilizarão por falhas no desempenho do kit sob essas condições.

8 07 12 ENGLISH SUMMARY The Hepatitis B Virus (HBV) belongs to the Hepadnaviridae family, which makes it a hepatotrophic virus. It has an external or superficial structure (surface antigen - HBsAg), and another core (HBcAg). There is also an antigenic fraction, which grows from the core, called e antigen (). In serum of infected patients one can observe two types of structures: a complete particle (Dane's particle), which is 42 nm in diameter and has a nucleocapside of 27 nm, which is an indication of viral replication through the marker, and spherical or tubular particles of 22 nm in diameter, made out of the viral envelope. The main antigen of the envelope is the HBsAg, while in the core is HBcAg and. There are mainly four serological types of HBsAg: adw, ayw, adr e ayr. The resolution of any infection by HBV from any serotype is the production of HBsAb against the a epitope present in all the serotypes. The HBsAg is the first serological marker to become positive in an infection by HBV. The presence of HBsAg frequently precedes the start the symptoms and the hepatic biochemical abnormalities by 6 to 8 weeks. In patients that are cured, the HBsAg disappears from the serum weeks after the onset of the symptoms or increase of the aminostransferase concentration. The presence of positive HBsAg for more than 6 months is usually an indication of chronic infection, which can develop into cirrhosis or hepatocelular carcinoma. The appearance of HBsAb and consequently disappearance of HBsAg grants immunity to the patient, which is the basis for the vaccination against Hepatitis B through the use of purified HBsAg for the development of HBsAb. Between the disappearance of HBsAg and the appearance of HBsAb there is a period where one cannot find the marker for the surface antigen of Hepatitis B and its corresponding antibody, which is known as the immunological window, probably due to the presence of immunocomplexes HBsAg HbsAb. In this serological phase, or whenever the concentration of HBsAg do not reach the minimum detection level of the test, the detection of HBcAg-IgM becomes the sole marker of acute infection of the virus of Hepatitis B. The Imuno-ELISA Anti-HBsAg from WAMA is a imunoenzymatic test, sandwich type, that uses recombinant proteins from the viral envelope from Hepatitis B virus, ad and ayepitopes, to detect the presence of Anti-HBsAg (HBsAb) antobodies in human serum or plasma, with the purpose to determine the concentration of HBsAb antibodies to monitor the recovery of patients with Hepatitis B virus infection or to indicate immune response to the Hepatitis B vaccine. PRINCIPLE OF THE METHOD The microtiter wells of the plate are covered with the HBsAg antigen (solid phase). Specimens of serum or plasma containing HBsAb antibodies are added to the wells together with a HBsAg conjugated with peroxidase. After incubation, it'll form an antigen-antibody-antigen complex represented by the HBsAg conjugated to peroxidase, by the HBsAb antibody from the specimen, and by the HBsAg antigen bound to the microtiter well. Material not bound is removed by washing. A substrate (TMB+ hydrogen peroxyde) is added, which will develop a blue coloration on the cavities when the peroxidase enzyme is present, indicating the presence of the HBsAb antibody. The addition of an acidic stop solution to block the enzymatic reaction will change the coloration of the solution to yellow. The absorbance is then measured at 450 nm. The concentration of the HBsAb antibody is directly proportional to the intensity of the reaction color. KIT PRESENTATION R E F E - 96 determinations 1. Microplate with wells coated with HBsAg antigen (12 removable strips with 8 wells each) 2. Wash Solution concentrated 20x (1 x 30 ml) 3. HBsAg Conjugate tagged with peroxidase (1 x 6.5 ml) 4. Chromogen Substrate Solution A (Hydrogen Peroxide) (1 x 7.0 ml) 5. Chromogen Substrate Solution B (TMB) (1 x 7.0 ml) 6. Stop Solution (1 x 7.0 ml) 7. Negative Serum Control (1 x 1 ml) 8. Positive Serum Control (1 x 1 ml) 9. Instructions for use HBsAg MARKER Anti-HBsAg Anti-HBcAg Total Anti-HBcAg IgM Anti- HEPATITIS B - Interpretation of Markers MEANING It is the first marker that appears in hepatitis B. Declines in up to 6 months. Its presence for more than 6 months indicates chronic hepatitis. Its presence indicates immunity to HBV. Present after the disappearance of HBsAg. Is this present by itself in vaccinated individuals. Its presence indicates recent or previous infection by HBV. Need other markers to characterize the phase of the disease. Indicates recent infection. Can be found up to 32 weeks after infection. It is a marker of viral replication. Its presence indicates the high infectivity. In strains with pre-core mutation (does not produce protein "e") may be absent, although the viral replication continues and, consequently, its high infectivity. Indicates the end of the viral replication stage. Comes after the disappearance of. HEPATITIS B - Interpretation of Serological Results ** Interpretation HbsAg Anti-HBsAg Anti-HBcAg Total Anti-HBcAg IgM Anti- Not immune (-) (-) (-) (-) (-) (-) Recent infection (+) (-) (+) (+) (+) (-) Beginning Convalescence Immune - Recent Previous Infection Immune - Previous Infection Immune - Previous Infection Immune - use of vaccine (-) (-) (+) (+) (-) (-) (-) (+) (+) (-) (-) (+) (-) (+) (+) (-) (-) (-) (-) (-)* (+) (-) (-) (-) (-) (+) (-) (-) (-) (-) * The anti-hbsag can be at undetectable levels by serological tests in prior infection after a long time. ** Atypical Serologic Profiles can be found in the course of infection with HBV. WARRANTY WAMA Diagnóstica guarantees the exchange of the diagnostic kit, provided it is within the expiration date and is proven by its technical support that there were no technical mistakes in the execution, handling and storage of this product. WAMA and its distributors are not liable for failures on the performance of the kits under these conditions.

9 11 08 ANALYTICAL SPECIFICITY There was no cross-reaction in sera from infected patients by the hepatitis A virus, hepatitis C virus, HIV, Cytomegalovirus and Treponema pallidum. During the tests, no "Hook" effect for high concentrations of antibodies was observed nor interference with rheumatoid factor up to 2000 U/mL. The performance characteristic of the test is not affected by high concentrations of bilirubin and hemoglobin. PRECISION OF THE TEST: a. Intra-Assay Precision The intra-assay precision was determined by assaying 2 samples of positive sera, one high and one low in replicates. Positive Samples High Low Number of times b. Inter-Assay Precision The inter-assay precision was determined by assaying 1 sample of positive serum and 1 sample of negative serum in 6 different runs. Positive Samples High Low Number of times LIMITATIONS OF USE Ÿ The test Imuno-ELISA anti-hbsag from WAMA was developed to obtain the highest sensitivity and specificity. ŸResults repeatedly reactives must always be interpreted with the clinical information of the patient and with other laboratory test results. ŸReactive samples that become non-reactive when retested must be considered not reactive. ŸDue to the high sensitivity of ELISA tests, false positive results may occur due to various reasons, many of which are related, but not limited to, improper washing step. ŸThe prevalence of the disease in the evaluated population will affect the predictive value of the test. PRECAUTIONS AND WARNINGS Average of Absorbances 2,492 0,3 Average of Absorbances 2,243 Deviation Standard Deviation Standard 0,083 2,97% 0,72% 3,73% 2,82% 1. The reagents should be kept between 2-8 ºC. 2. The expiry date refers to the last day of the month indicated on the labels of the vial and of the kit box. 3. Avoid exposing the reagents to high temperatures and direct sunlight. 4. Do not freeze the reagent, as this may cause irreversible damage. 5. The Imuno-ELISA anti-hbsag from WAMA contains materials of human origin, which have been tested, with negative results for anti-hiv I and II antibodies, Hepatitis B surface antige virus (HBsAg) (except in the positive serum control) and anti-h. However, as no diagnostic method offers complete safety, in the absence of these and other infectious agents, it is recommended to deal with all the reagents as potentially infectious materials, as well as having the disposing these materials. 6. Do not use reagents or microplates fof different batches. 7. Allow the reagents to reach the room temperature (20-25ºC) before starting the test. 8. The reagents should be homogenized gently by inversion and capped immediately after use. 9. Do not let the wells of microtiter plates dry during the test. 10. Avoid repeated pipetting the reagents,because this could cause contamination. 11. The samples to be tested and the serum controls should be used at the same time to maintain the same test conditions. 12. Do not use the reagent after the expiration date. 13. Discard the material following local regulations. 14. Use the Good Laboratory Practices (GLPs) in storage, handling and disposal of materials. R E F E determinations 1. Microplates with wells coated with HBsAg antigen (24 removable strips with 8 wells each) 2. Wash Solution concentrated 20x (2 x 30 ml) 3. HBsAg Conjugate tagged with peroxidase (2 x 6.5 ml) 4. Chromogen Substrate Solution A (Hydrogen Peroxide) (2 x 7.0 ml) 5. Chromogen Substrate Solution B (TMB) (2 x 7.0 ml) 6. Stop Solution (2 x 7.0 ml) 7. Negative Serum Control (2 x 1 ml) 8. Positive Serum Control (2 x 1 ml) 9. Instructions for use REAGENT PREPARATION AND STABILITY ŸMICROPLATE (1): Remove from the envelope the strips that will be used, and allow it to reach room temperature (20 25 C). The strips that will not be used must be returned to the sealing envelope, with desiccant, and kept at 2 8 C. ŸWASH SOLUTION (20x Concentrated) (2): Phosphate buffered Saline (PBS), ph 7.4, containing Tween 20 as detergent. Dilute the volume of the concentrate, filling it to 570 ml with distilled or deionized water. If crystals are formed in the concentrated diluent, they must be dissolved at 37 C before the dilution is made. During each wash cycle, each well must be washed completely with approximately 350µl of the diluted wash solution. Allow it to reach room temperature (20 25 C) before using it. ŸHBsAg CONJUGATE TAGGED WITH PEROXIDASE (3): ready to use. Stable at 2 8 C up to the expiration date printed on the bottle. Do not freeze. Allow it to reach room temperature (20 25 C) before using it. ŸCHROMOGEN SUBSTRATE SOLUTION A (UREA HYDROGEN PEROXIDE) (4): stabilized and ready for use. Stable at 2 8 C until expiration date printed on the bottle. Do not freeze. Allow it to reach room temperature (20 25 C) before using it. ŸCHROMOGEN SUBSTRATE SOLUTION B (TMB) (5): solution stabilized with Tetramethyl Benzidine. Ready to use. Stable at 2 8 C until expiration date printed on the bottle. Do not freeze. Allow it to reach room temperature (20 25 C) before using it. The TMB is not mutagenic and not carcinogenic. ŸSTOP SOLUTION (6): ready to use. Contains 1.0 M Sulfuric Acid (H2SO4). Handle with care. Corrosive. On skin contact, immediately flush with large amounts of water. Allow it to reach room temperature (20 25 C) before using it. Stable at until expiration date printed on the bottle. ŸNEGATIVE SERUM CONTROL (7): negative human serum to HBsAb. Ready to use. Use it as is (do not dilute it). Stable at 2 8 C up to the expiration date printed on the bottle. Contains ProClin 300 at 0.05% as preservative. ŸPOSITIVE SERUM CONTROL (8): positive human serum to HBsAb. Ready to use. Use it as is (do not dilute it). Stable at 2 8 C up to the expiration date printed on the bottle. Contains ProClin 300 at 0.05% as preservative. Note.: The kit has the same performance after first use, and is stable until the expiration date described on the label if it is kept in the indicated temperature (2-8 C). SPECIMENS Use serum or plasma specimens not hemolysed, lipemic or contaminated. The sample can be stored covered in refrigerator at 2-8 C for 48 hours. For long-term storage, serum or plasma must be kept in the freezer at 20ºC. Frozen specimens must be homogenized before testing. Avoid making foam. Avoid repeated freezing and thawing as this may lead to false results. Do not use inactivated specimens. MATERIAL REQUIRED BUT NOT PROVIDED ŸMicropipettes (50µl) and tips ŸDistilled and deionized water for the dilution of the wash solution. ŸMicroplate shaker. ŸIncubator at 37 C. ŸELISA plate reader with 450nm filter. ŸMicroplate Washer ŸAbsorbent paper. ŸContainer for material disposal

10 09 10 PROCEDURE IMPORTANT: Bichromatic absorbance measurements using reference filter with wavelength of 630 nm is recommended when available. In this condition, the use of "blank" should be disregarded, since it should be used only when using a 450 nm single filter. 1. In accordance with the plan established plan for the plate distribution, use 3 wells for the serum negative control (7) and 2 wells for the serum positive control (8). Use one cavity well for the blank, which will only have 50µl of the chromogen substrate solution A (4), and 50µl of chromogen substrate solution B (5). 2. Pipete 50µl of the positive serum control and negative serum control (without diluting them) as instructed in step 1. Pipete 50µl of the samples to be tested into the other microplate wells. Use individual tips for each sample, to avoid contamination. 3. Pipete 50µl of the conjugate (3) in all the cavity wells, except on the blank. 4. Gently homogenize the samples, by holding the plate on the edges and shaking it for 30 seconds or use a microtiter plate shaker. 5. Cover the plate with adhesive foil and incubate at 37 C for 60 minutes. 6. Discard the contents of the plate into a container with disinfecting solution carefully, to avoid contamination between the cavities. 7. Wash the plate 5 times with diluted Wash Solution (2) (see Preparation and Stability of Reagents). Aspirate the contents of the plate, dispense 350µl of diluted Wash Solution (2) in each well, wait 30 seconds, and empty the contents of the wells. Repeat this procedure 4 times (total of 5 cyclos). We recommend using a microplate washer (manual or automatic). WARNING: The correct washing procedure is essential for good performance of the test. 8. After the last wash, turn the plate over and tap it dry on absorbent paper to remove any residual liquid. 9. Pipette 50µl of chromogen substrate Solution A (4) and 50µl of chromogen substrate - Solution B (5) in each well of the microplate, including the blank. A blue color will develop wherever the peroxidase enzyme is present. Gently homogenize the samples, by holding the plate on the edges and shaking it or use a microtiter plate shaker for 30 seconds. 10. Incubate at 37 C for 15 minutes, protecting from light. 11. Block the reaction by dispensing 50µl of Stop Solution (6) in each well of the microplate, including the blank. The solution will change the color to yellow. Gently homogenize the samples, by holding the plate on the edges and shaking it or use a microtiter plate shaker for 30 seconds. 12. Read the absorbance (O.D.) in a microplate reader with 450 nm filter, against the blank of the substrate, within 5 minutes. NOTE: Bichromatic absorbance measurements using reference filter with wavelength of 630 nm is recommended when available. IMPORTANT: The wash procedure is critical for the performance of the test. Insufficient washing will result in inaccurate readings or falsely elevated absorbance. Performing the tests in duplicate, though not required, is recommended. The pipetting time for the specimens and controls should not exceed 30 minutes. SUMMARY OF THE PROCEDURE 1. Pipette 50µl of sample, negative control (7) (3 wells) and positive control (8) (two cavities) into the microplate. 2. Pipette 50µl of enzyme conjugate (3) in each well of the plate, except blank. 3. Mix for 30 seconds and incubate at 37 C for 60 minutes. 4. Discard the contents of the plate and wash it six times with wash solution (2) 5. Completely discard the contents of the last wash, removing any residual liquid. 6. Pipette 50µl of Chromogen Substrate - Solution A (4) and 50µl of Chromogen Substrate - Solution B (5) in each well of the plate, including the blank (which should contain only these reagents). The color of the solution turns blue wherever there is peroxidase. 7. Mix for 30 seconds and incubated in the dark at 37 C for 15 minutes. 8. Pipette 50µl of the Stop Solution (6) in each well of the microplate. The color of the solution will turn yellow. 9. Mix for 30 seconds. 10. Read the OD in a microplate reader with a 450 nm filter against the blank, or in a double wavelength (450/630 nm), within 5 minutes. A B C D E F G H EXAMPLE OF THE DISTRIBUTION DIAGRAM OF MICROPILATE 1 Blank Neg. Coltrol Neg. Control Neg. Control Pos. Control Pos. Control A1 A2 2 A3 A4 A5 A6 A CALCULATION OF RESULTS Determine the optical density (OD) for each test and control serum. whose the final value is obtained by subtracting the blank from the OD. If double wavelength is used, the blank is ommited, therefore, the the O.D readings are used without subtracting. If more than one microplate is used they should be considered separately for calculation and interpretation of results. To determine the Cut-off value: Cut-off = average OD of Negative Control x 2.1 Warning: If the average OD of the negative control is less than 0.05, use it as If the value is greater than 0.05 consider the measured OD, respecting the validation criteria for the test. Example: Average of Negative Controls = 0.03 Therefore, CUT-off = 0.05 x 2.1 = TEST VALIDATION: The test is valid if: ŸThe O.D. of the blank,which contains only Substrate Chromogen A and B and the Stop Solution, must be less than at 450 nm. ŸThe O.D. value of the negative controls must be less than at 450/630 nm or at 450 nm after subracting the blank. ŸThe O.D. value of the positive controls must be equal or greater than at 450/630 nm or at 450 nm after subtracting the blank. INTERPRETATION OF THE RESULTS Divide the patient sample O.D. value by the Cut-offvalue. The test is considered: REACTIVE : if the value is equal or greater than 1.1. INDETERMINATE (Borderline) : if value is between 0.9 and 1.1. NOT REACTIVE : if value is less than 0.9. WARNING: IT IS ALWAYS RECOMMENDED REPEAT THE TEST IN THE REACTIVE SAMPLES. SENSITIVITY AND SPECIFICITY OF THE TEST ANALYTICAL SENSITIVITY The Imuno-ELISA Anti-HBsAg (Qualitativo) has a sensitivity of 5 miu/ml. In a study conducted with 304 samples of serum and plasma obtained from a reference laboratory, of which 94 were positive and 210 negative, the sensitivity and specificity were determined for the Imuno-ELISA anti- HBsAg from WAMA. Sensitivity = True Positive / (True Positive + False Negative) x 100 Specificity = True Negative / (True Negative + False Positive ) x 100 True Positives RESULTS 94 False True Falses Sensitivity Especificity Positives Negatives Negatives ,55