METODOLOGÍA DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE CIANOBACTERIAS Y CIANOTOXINAS. Antonio Quesada Universidad Autónoma de Madrid

Transcripción

1 METODOLOGÍA DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE CIANOBACTERIAS Y CIANOTOXINAS Antonio Quesada Universidad Autónoma de Madrid

2 Índice Identificación y cuantificación de cianobacterias potencialmente tóxicas Taxonomía de cianobacterias Métodos de detección y cuantificación de cianotoxinas Métodos cromatográficos Otros métodos: ELISA, PP1 Resumen

3 METODOLOGÍAS Recepción de las muestras Identificación taxonómica Preparación Determinación Tox. disolución Determinación Tox. particulada Fluorómetro, Microscopio Filtración, extracción, concentración ELISA, LC/MS ELISA, PP, LC-MS, HPLC

4 IDENTIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE CIANOBACTERIAS POTENCIALMENTE TÓXICAS MUESTRA DE AGUA VIVA UTERMÖHL FLUOROMETRÍA FLOTACIÓN IDENTIFICACIÓN (lista de géneros o especies) CUANTIFICACIÓN DISTRIBUCIÓN DE GRUPOS ALGALES (%) BIOMASA DE CIANOBACTERIAS (CLOROFILA a) ABUNDANCIA RELATIVA (% Y/O CLASES ) CONCENTRACIÓN DE CÉLULAS, BIOVOLUMEN

5 TAXONOMÍA DE CIANOBACTERIAS Criterios tradicionalmente morfológicos (aspecto), actualmente además genéticos y fisiológicos. Órdenes familias (subfamilias) géneros especies (variedades). Más de 2000 especies. Constantes variaciones por revisión de expertos.

6 CIANOBACTERIAS POTENCIALMENTE TÓXICAS Alguna de sus cepas a nivel mundial ha sido tóxica. Potencial siempre tóxico Unos 20 géneros tóxicos descritos. Aprox. 25 especies potencialmente tóxicas en España. Los más importantes en España: Microcystis (Microcistinas), Aphanizomenon (Cilindrospermopsina), Anabaena (anatoxina-a) Cylindrospermopsis, Planktothrix, Woronichinia,etc

7 COLONIALES (Orden Chroococcales) Microcystis aeruginosa 50 µm

8 FILAMENTOSAS SIN HETEROCISTOS (Orden Oscillatoriales) Planktothrix agardhii 10 µm

9 FILAMENTOSAS CON HETEROCISTOS (Orden Nostocales) ACINETO HETEROCISTO ACINETO HETEROCISTO Aphanizomenon flos-aquae Anabaena crassa Aphanizomenon ovalisporum

10 FLOTACIÓN vs UTERMÖHL FLOTACIÓN UTERMÖHL Tipo de muestra Viva Fijada (lugol) Microscopio Óptico Óptico invertido Cuantificación Abundancia relativa (%) Concentración de Células Biovolumen Ventajas Inconvenientes Aplicación recomendada Rápido Evita otras algas subestima taxones no formadores de blooms Cuantificación poco precisa Gestión: detección rápida de especies más abundantes formadoras de acumulados Cuantificación precisa Método estandarizado (norma UNE-EN 15204:2007) Tedioso Lugol altera aspecto real Demasiadas especies Posible subestimación de formadoras de scums?? Investigación y/o gestión a medio plazo: seguimientos temporales precisos Experto Recomendable Imprescindible

11 CLAVE DE IDENTIFICACIÓN (MUY) SIMPLIFICADA Unicelular, colonial, filamentosa? Unicelular Colonial Filamentosa Microcystis? Woronichinia? NO Heterocistos? SÍ OSCILATORIALES NOSTOCALES Planktothrix? NO Anabaena? Cylindrospermopsis? Apuntamiento? Aphanizomenon? SÍ

12 Métodos de detección y cuantificación de cianotoxinas Métodos cromatográficos de detección Técnicas para la separación de compuestos en una mezcla que permita una detección individualizada de uno o varios analitos Constan de: 1.Separación cromatográfica 2.Detección Empleados en muy diversos campos

13 Separación cromatográfica 1.Compuestos añadidos conjuntamente a una fase móvil 2.Compuestos atraviesan fase estacionaria 3.Los compuestos son retenidos o eluidos según sus características químicas o físico químicas 4.Los compuestos abandonan la fase estacionaria ordenados inversamente a su grado de retención

14

15 RT: 0,56-77, , ,73 NL: 6,81E8 TIC MS , , , , , , , , ,61 9, , , , , , , , , , , , , , , , ,63 77, Time (min)

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17 RT: 5,11-23, Time (min) , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,04 NL: 6,81E8 TIC MS NL: 2,28E7 m/z= 994,50-995,50 MS NL: 2,08E8 m/z= 519,50-520,50 MS NL: 1,48E7 m/z= 1044, ,50 MS RR -LR -YR

18 Otros métodos de análisis de Microcistinas -Test de Inhibición de Protein-fosfatasa (PPI) - Ensayo de inmunodetección (ELISA)

19 PPI-test (Inhibición enzimática de la protein fosfatasa) Kit comercial (ZEU- Inmunotec) Microcistinas Inhibición de enzimas proteinfosfatasas (tipos 1 y 2A) Principio: Reducción de la defosforilación como medida indirecta de su concentración. Extracto Pfasa + Sustrato (pnitrofenolfosfato) Defosforilación (cambio de color) Cuantificación por absorbancia 405nm Microcistinas

20 ELISA Enzyme-linked inmunosorbent assay Kits comerciales (Envirogard, ) Basado en la interacción entre anticuerpos y toxina. Mecanismo: 1. Placa multipocillo con anticuerpos 2. Adición de muestra [MC desconocida] 3. Adición de conjugado MC-enzima Unión competitiva a sitios de unión 4. Adición de sustrato (genera color en presencia del conjugado) 5. Medición de la absorbancia a 450nm

21 Selectividad RMN MALDI-TOF LC/MS Bioensayo HPLC ELISA PP µg ng pg fg Sensibilidad

22 Gracias!!