DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO DE DENGUE EN PANAMÁ

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1 DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO DE DENGUE EN PANAMÁ TM Brechla Moreno A. Instituto Conmemorativo Gorgas de Estudios de la Salud, Panamá Departamento de Virología y Biotecnología 2013

2 TÉCNICAS PARA LA DETECCIÓN VIRAL Aislamiento viral DEL DENGUE RT-PCR cuantitativa en tiempo real Enzimas de restricción

3 INTENTO DE AISLAMIENTO VIRAL Células sin efecto Microsp. invertido Efecto citopático

4 INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA Microp. de fluorescencia

5 ENZIMAS DE RESTRICCIÓN PARA TIPIFICACIÓN DE DENGUE Y OTROS FLAVIVIRUS HaeIII MspI Patrones observados después del corte con enzimas de restricción.

6 Es un método de diagnóstico aplicable a muestras clínicas en fase aguda de la infección por dengue. Esta técnica permitirá determinar diferentes especies de flavivirus usando solo un par de cebadores y una enzima de restricción. Publicado en agosto del 2012 en Journal of Virological Methods. ENZIMAS DE RESTRICCIÓN PARA TIPIFICACIÓN DE DENGUE Y OTROS FLAVIVIRUS

7 RT-PCR EN TIEMPO REAL

8 RESULTADOS OBTENIDOS POR RT-PCR CUANTITATIVA EN MUESTRAS DE SUERO DE DENGUE La cuantificación de la fluorescencia emitida durante cada ciclo de la PCR será proporcional a la cantidad de ADN que se está amplificando.

9 VENTAJAS DE LA RT-PCR CUANTITATIVA La amplificación puede ser monitoreada en tiempo real. Se puede detectar igual o menor a 2 copias virales. Específico, sensible y reproducible.

10 EVALUACIÓN DE ELISA DE CAPTURA PARA NS1 COMO NUEVA HERRAMIENTA DEL DIAGNÓSTICO TEMPRANO DE LA INFECCIÓN POR DENGUE EN PANAMÁ Brechla Moreno1*, Yamilka Díaz1, Julio Cisneros1, Gisel de Díaz2, Juan M. Pascale1, Sandra López-Vergès1, Mariana García1. 1Departamento de Investigación en Virología y Biotecnología, Instituto Conmemorativo Gorgas de Estudio de la Salud (ICGES), Panamá, Panamá. 2Laboratorio Clínico de Hospital San Fernando (LCHSF), Panamá, Panamá.

11 EVALUACIÓN DE ELISA DE CAPTURA PARA NS1 COMO NUEVA HERRAMIENTA DEL DIAGNÓSTICO TEMPRANO DE LA INFECCIÓN POR DENGUE EN PANAMÁ Objetivo: Comparar la sensibilidad de una ELISA comercial de captura para NS1 con otros métodos diagnósticos de Dengue utilizados en Panamá y determinar si puede ser utilizada directamente en las instalaciones públicas de salud. Materiales y Métodos: Se analizaron 138 sueros provenientes de la Ciudad de Panamá, para diagnóstico de Dengue por ELISAs comerciales de captura para NS1 e IgM, detección del genoma viral por RT-PCR en tiempo real y aislamiento viral en cultivo celular, y se compararon los resultados obtenidos por cada método.

12 PERIODO DE DETECCIÓN DE LA RESPUESTA INMUNE Y PRODUCTOS VIRALES DURANTE LA INFECCIÓN DE DENGUE Dengue, Guías para el diagnóstico, tratamiento, prevención y Control, nueva edición 2009 (OPS)

13 Aislamiento Viral Detección del ARN viral y de NS1, con detección o no de IgM PCR+ PCR+ NS1+ NS1+ IgM+ IgM- IgM+ IgM- (PCR+= 41) (NS1+= 50) Positivo Negativo Total Resultados de aislamiento viral de muestras positivas por PCR en tiempo real para el ARN viral de Dengue o por ELISA de NS1 con detección o no de IgM Leparc-Goffart, 2009

14 EVALUACIÓN DE ELISA DE CAPTURA PARA NS1 COMO NUEVA HERRAMIENTA DEL DIAGNÓSTICO TEMPRANO DE LA INFECCIÓN POR DENGUE EN PANAMÁ Conclusión: La ELISA de NS1 en conjunto con la IgM ofrece una sensibilidad de detección de 87,23% y un diagnóstico precoz de Dengue, lo que sugiere que la implementación de la ELISA NS1 en las instalaciones de salud en Panamá permita un diagnóstico rápido acertado.

15 DIAGNÓSTICO DE DENGUE en panamá Licda. Yarisel E. Rodríguez R. Técnologa médica Sección de inmunovirología del lcrsp - icges

16 DIAGNÓSTICO DE DENGUE ACTIVIDADES COTIDIANAS Evaluación de los Kits comerciales para diagnóstico que ingresen a Panamá (Decreto 148 del 9 de agosto de Gaceta oficial 23868) Participación en el GT de dengue Nivel Central. Vigilancia Laboratorial del Dengue

17 Evaluación de los Kits comerciales para diagnóstico que ingresen a Panamá (Decreto 148 del 9 de agosto de 1999 (gaceta oficial 23868) Casa comercial solicita evaluación de producto para Registro Sanitario DEPARTAMENTO DE EVALUACIÓN DE INSUMOS Y REACTIVOS SECCIÓN DE INMUNOVIROLOGÍA Consulta la posibilidad de realización y materiales necesarios. Establece la forma de evaluación del producto. SECCIÓN DE INMUNOVIROLOGÍA SECCIÓN DE INMUNOVIROLOGÍA Se realiza la evaluación y se emite el criterio técnico de evaluación Emite el Registro Sanitario DEPARTAMENTO DE EVALUACIÓN DE INSUMOS Y REACTIVOS DEPARTAMENTO DE EVALUACIÓN DE INSUMOS Y REACTIVOS Recibe quejas de productos y establece en equipo las acciones a seguir.

18 KITS DE ELISA PARA DX ACS CONTRA DENGUE KITS DE ELISA PARA DX DE AG DE DENGUE PRUEBAS RÁPIDAS PARA DX DE AG O ACS O AMBAS EVALUACIÓN DE KITS COM. PARA DX.

19 Evaluación de los Kits comerciales para diagnóstico que ingresen a Panamá (Decreto 148 del 9 de agosto de 1999 (gaceta oficial 23868)

20 GRUPO TÉCNICO NACIONAL Comunicación social Vigilancia epidemiológica Manejo Integrado de Vectores Laboratorio Atención al paciente Medio Ambiente

21 Guía de Abordaje integral del Dengue en Panamá

22 VIGILANCIA LABORATORIAL DEL DENGUE EN PANAMÁ

23 CONFORMACION DE LA RED NACIONAL DE DENGUE LABORATORIO LCRSP-ICGES MINSA 17Laboratorios Patronatos 3 laboratorios Caja de Seguro Social 21 laboratorios *En proceso de aumentar el número *Laboratorios Privados 5 Total de instalaciones que realizan la prueba de Dengue: 46 Más de 79 Tecnólogos Médicos han recibido capacitación: Inicial (previa a instalación de las plataformas de ELISA en las regiones): 2009 Taller de actualización en el diagnóstico laboratorial de dengue (sep. 2011)

24 Detección de IgM mediante ELISA de Captura IgM La prueba de ELISA de captura contra Acs IgM para Dengue utilizada en la red no distingue entre Infección primaria o secundaria.

25 Detección de IgG mediante ELISA de Captura Ig G La prueba de ELISA de captura contra Acs IgG para Dengue utilizada en la red sólo es positiva en casos de Infección Secundaria.

26 RED NACIONAL DE DENGUE ICGES-LCRSP PROGRAMA DE EVALUACIÓN EXTERNA DE LA CALIDAD SUPERVISIONES PRUEBAS DE PROFICIENCIA CONTROL DE CALIDAD INDIRECTO Se han realizado 4 RONDAS de supervisiones a toda la Red de Dengue (2 rondas) 2012 (1 ronda) 2013 (1 ronda) Se han entregado 3 PANELES a la Red de Dengue. 86 % de las regiones envían muestras para el control de calidad indirecto (en proceso las Regiones pendientes por problemas de difícil acceso). 98% de Concordancia (IgM e IgG) Datos del 2011.

27 DISTRIBUCIÓN Y NÚMERO DE LABORATORIOS SUPERVISADOS A NIVEL NACIONAL

28

29 Detección de NS1 Detección de ARN viral Positivo Negativo Total Positivo Negativo Indeterminado Total Tabla 1. Resultados de muestras sospechosas de Dengue por RT-PCR tiempo real para detección del ARN viral y por Dengue Early ELISA de captura de NS1.

30 Aislamiento Viral Detección de ARN viral Positivo Negativo Total Positivo Negativo Total Tabla 2. Resultados de muestras sospechosas de Dengue por RT-PCR tiempo real para el ARN viral y Aislamiento Viral.

31 Aislamiento Viral Detección de NS1 Positivo Negativo Indeterminada Total Positivo Negativo Total Tabla 3. Resultados de muestras sospechosas de Dengue por Aislamiento Viral y Dengue Early ELISA de captura de NS1.

32 ALGORITMO DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE DENGUE EN LA RED NACIONAL DE DENGUE LABORATORIO DE LA RED NACIONAL DE DENGUE RECIBE PACIENTE CON FORMULARIO COMPLETO CLASIFICA MUESTRAS 0-3 DÍAS DE SÍNTOMAS DIAGNÓSTICO VIROLÓGICO (Detección del AgNS1 - Pacientes hospitalizados de acuerdo a Lineamientos /Enviar muestra al ICGES Vigilancia del serotipo circulante) 4 DÍAS DE SÍNTOMAS* NO TOMAR MUESTRA Y CITAR AL PACIENTE PARA TOMARLA DEL DÍA 5 AL 21 DE INICIO DE SÍNTOMAS 5-21 DÍAS DE SÍNTOMAS DETERMINACIÓN DE ANTICUERPOS IgM/IgG PRUEBA DE ELISA POSITIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO REPORTAR ENVIAR 10% DE MUESTRAS PARA CONTROL DE CALIDAD Y VIGILANCIA VIROLÓGICA AL ICGES* CITAR AL PACIENTE PARA II MUESTRA EN FASE CONVALESCIENTE REPORTAR ENVIAR 10% DE MUESTRAS PARA CONTROL DE CALIDAD AL ICGES REPORTAR *Los casos con sospecha de Dengue Grave deben ser enviados inmediatamente al ICGES previa notificación a Epidemiología local y al ICGES.

33 ALGORITMO DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE DENGUE EN EL ICGES MUESTRAS ENVIADAS POR LOS LABORATORIOS DE LA RED NACIONAL DE DENGUE AL INSTITUTO CONMEMORATIVO GORGAS DE ESTUDIOS DE LA SALUD CLASIFICACIÓN DE MUESTRAS 0-4 DÍAS DE SÍNTOMAS RT-PCR TIEMPO REAL * 5-21 DÍAS DE SÍNTOMAS PRUEBAS SEROLÓGICAS POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO REPORTAR REPORTAR REPORTAR REPORTAR CASO CONFIRMADO CASO CONFIRMADO * En caso de agotarse los reactivos para RT-PCR Tiempo Real, las muestras serán analizadas mediante cultivo celular, del cual se obtienen resultados entre los 14 a 30 días. NOTA: Los Laboratorios de la Red enviarán el 10% de muestras Negativas y Positivas para detección de anticuerpos IgM e IgG y Antígeno NS1, además las muestras agudas para vigilancia virológica de acuerdo a lo establecido en los lineamientos para la temporada baja y de brote de casos de dengue.

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