Revisión sobre la Enfermedad de la Mancha Blanca (WSSV). Epidemiología, Diagnóstico, y Métodos de Lucha.

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1 Revisión sobre la Enfermedad de la Mancha Blanca (WSSV). Epidemiología, Diagnóstico, y Métodos de Lucha. Félix Royo, Olivia Gironés y Silvia Ania Laboratorio de Ictiopatología. Fac. de Veterinaria. Univ. de Zaragoza C/ Miguel Servet Zaragoza (España) Tel: Fax: Introducción Este año pudimos leer en la revista Panorama Acuícola la aparición del la enfermedad de la mancha blanca o WSS (White Spot Syndrome) en varias instalaciones de cultivo de camarón en Honduras y Nicaragua, amenazando la importante producción de crustáceos marinos de Centro América. También se han detectado casos de WSS en la costa Sudeste de los E.E.U.U. y en el golfo de Méjico (Wang y cols., 1999). Este virus tiene gran importancia en la acuicultura asiática, pero hasta el momento no se había considerado un peligro para la maricultura occidental. Sin embargo, como otros procesos pandémicos que comienzan en un punto concreto para después extenderse por todo el mundo, el WSSV se puede considerar hoy en día como una enfermedad cosmopolita, lo que añade mayor importancia si cabe al hecho de ser una enfermedad devastadora en términos económicos y ecológicos. Fig. 1: Rutas comerciales: Zonas productoras y zonas consumidoras de langostinos y camarones. Nuestro propósito en esta revisión es ofrecer a nuestros lectores una breve recopilación sobre los conocimientos que hasta hoy se tiene sobre la enfermedad, queriendo profundizar en algunos aspectos sobre su diagnóstico, transmisión y medidas de profilaxis. La enfermedad de la mancha blanca se describe a principios de esta década en Asia, de forma simultánea en diversos países con tradición en el cultivo de crustáceos marinos, y que denominaron el proceso de diferente forma; En Japón se describe el Virus Bacilar de los Peneidos (PRDV); En China se atribuye la enfermedad al Baculovirus de la Necrosis Hipodérmica y Hematopoyética (HHNBV); En Tailandia el agente causal de la enfermedad se denomina Baculovirus Ecto y Mesodermal (SEMBV). Posteriores estudios, utilizando técnicas genéticas para identificación y clasificación de los

2 virus, todos estos agentes se agruparon como el complejo WSSV, existiendo muy pocas diferencias entre ellos (Lightner, 1996). Clínicamente, el WSS se caracteriza por la aparición de manchas blancas en la cara interna de la cutícula de los crustáceos afectados, que son una amplia variedad de ejemplares tanto cultivados como salvajes (Tabla 1). Tabla 1: Especies de crustáceos afectados Especies cultivadas Especies salvajes Cangrejos Penaeus monodon Penaeus japonicus Metapenaeus ensis Penaeus penicillatus Macrobrachium rosembergii Penaeus monodon Penaeus japonicus Penaeus penicillatus Penaeus semisulcatus Calappa philarigus Charybdis natator Charybdis feriatus Helice tridens Portunus pelagicus Portunus sanguinolentus Scylla serrata La aparición de estas manchas no conlleva necesariamente la presencia de otros síntomas clínicos, y se podría interpretar que los crustáceos que no presentasen ningún otro signo, están en una fase de prepatencia, más que desarrollando la enfermedad propiamente dicha. Esta aparece en la mayoría de los casos como consecuencia de una situación de estrés, y se manifiesta con letargia, coloración rojiza, anorexia, natación en superficie, y muerte en horas o en unos pocos días, y la mortalidad puede alcanzar el 100% del lote afectado (Lo y Kou, 1998). Se ha hecho referencia a diferencias en el curso de la enfermedad según la edad de los ejemplares afectados, señalando una tendencia a la cronicidad en lotes compuestos por adultos y reproductores (Sudha y cols., 1998). Además de su alta virulencia, el WSSV se caracteriza por ser poco especifico en cuanto a la capacidad de invadir y dañar diversos tejidos (Chang y cols., 1996). Mediante técnicas de histopatología, se han encontrado evidencias de infección y destrucción celular en tejido conectivo, glándula de la antena, tejido hematopoyético, branquias, tejido nervioso, ectodermis y órganos linfoides, siendo estas dos localizaciones las que más frecuentemente se ven afectadas (Wang y cols, 1997a). Epidemiología Sin duda uno de los aspectos que más preocupa a los maricultores, y a la par más importante en esta enfermedad, es el gran poder de diseminación del virus, por las múltiples vías de infección y por el amplio espectro de hospedadores, tanto salvajes como cultivados que pueden albergar al virus y actuar como reservorio (Wang y cols, 1997b). La transmisión del WSSV se produce tanto por cohabitación con crustáceos infectados, y de forma experimental, altas diluciones (10-7 /ml) del virus en el agua son infectantes. Igualmente se puede transmitir el virus por ingestión, bien en fenómenos de canibalismo, predación, o por inclusión en la dieta de crustáceos infectados. Es importante eliminar estos de la dieta, tanto frescos, como congelados, ya que en estos el virus persiste infectante. La introducción en el continente americano de ejemplares congelados provenientes de Asia parece ser la causa de la aparición en el continente de la enfermedad (Nunan y cols. 1998). También se ha comprobado la vía vertical, donde el virus se transmite por células de las oogonias, y a través de células conectivas presentes en el espermatóforo, infectando los huevos antes de la eclosión. Esta vía de transmisión tiene una fuerte repercusión económica, al morir las larvas antes de

3 la eclosión y por tanto reducirse la productividad, pero no tanta trascendencia en la transmisión de la enfermedad (Lo y Kou, 1998). Sin embargo, y como consecuencia de la presencia del virus en el agua y en los reproductores, las larvas tienen alto riesgo de infectarse en sus primeros meses de vida, tal y como se comprobó en un seguimiento de una crianza de padres infectados, donde las larvas sufrieron una infección leve pero progresiva que afectó prácticamente al 100% de las crías (Lo y Kou, 1998). Una de las mayores dificultades con las que nos encontramos para iniciar planes de erradicación es que las especies salvajes se ven afectadas y actúan como reservorios, por ejemplo diversas especies de cangrejos y camarones de vida libre, que son capaces de mantener y transmitir el WSSV (Lo y cols., 1996). Los cangrejos marinos han sido muy utilizados como parte de la dieta para reproductores cultivados de forma habitual en la acuicultura asiática, y últimamente la recomendación de no usar crustáceos como parte de la dieta, y tomar medidas para evitar la entrada de cangrejos en las instalaciones, han dado buenos resultados (Lo y cols., 1997). El último punto a tener en cuenta es que la presencia del virus no siempre determina la presencia de la enfermedad. La existencia de portadores subclínicos hace mucho mas complicado el control de la enfermedad. Estos portadores subclínicos suelen sufrir la enfermedad cuando se les somete a estrés. Así, se ha señalado que el transporte de los ejemplares hasta el laboratorio reactiva la infección de ejemplares salvajes que eran portadores detectables por doble PCR pero no padecían ningún tipo de síntoma (Lo y Kou, 1998). Experimentalmente, se ha logrado la transformación de individuos infectados asintomáticos, mediante la escisión de pereiópodos, demostrando la relación entre la reactivación del virus y el estrés al que se somete a los crustáceos (Peng y cols., 1998). Diagnóstico Los métodos más utilizados para el diagnóstico de esta enfermedad han sido, hasta hace unos años, los que utilizaban técnicas de histopatología y observación de improntas con microscopía clásica. También se ha utilizado para describir la infección la microscopía electrónica. Estos métodos, combinados con la sintomatología clínica, sirvieron para describir los primeros casos de la enfermedad del WSS (Inouye y cols., 1994). Las lesiones que pueden apreciarse mediante histopatología, se describen como una hipertrofia de los núcleos celulares en los diversos tejidos afectados, que llegan a sufrir una necrosis. No obstante no se aprecian cuerpos de inclusión en citoplasma o núcleo (Wang y cols., 1997a). Mediante microscopía electrónica pueden verse partículas víricas de forma bacilar y con envoltura trilaminar, típica de los baculovirus, en los diferentes tejidos del crustáceo infectado. Algunos virus presentan un apéndice alargado en un extremo (Wang y cols. 1997a). Debido a que existen diferentes baculovirus que afectan a crustáceos, y que como se señalo anteriormente, sólo tras algunos años de estudio se pudo agrupar todas las cepas aisladas a partir de casos de WSS, la utilización de técnicas mas especificas, basadas en la detección de ADN, ha supuesto un gran avance en el diagnóstico de esta enfermedad. Dentro de estas técnicas, la primera que se utilizo fue la hibridación "in situ", que también sirvió para identificar tejidos en los que el virus estuviera presente (Chang y cols. 1996). Después se han puesto a punto técnicas de PCR (Lo y Kou, 1996). Comparando las diferentes técnicas, se ha podido clasificar el grado de infección en función de que técnica es capaz de detectar la infección. Así, existen portadores del virus que únicamente pueden detectarse mediante doble PCR, o por Dot-Blot, que parece tener resultados similares a la técnica de doble PCR (Chang y cols., 1998a).

4 Son los primeros estadios de la infección, y no pueden ser diagnosticados por PCR simple, o por hibridación "in situ". Es un estado de prepatencia de duración variable, generalmente hasta que se somete a los crustáceos a estrés, y en la que pueden aparecer manchas blancas, pero tampoco es rara su ausencia (Lo y Kou, 1998). Cuando la infección se reactiva, es posible detectar el virus mediante PCR simple o por hibridación "in situ", y al igual que en el caso anterior, las manchas blancas características no tienen porque estar presentes. Antes de que aparezcan los restantes síntomas de enfermedad, se denomina a esta fase como estado de transición, y a diferencia del estado de prepatencia, dura unas pocas horas. El siguiente estado se manifiesta por los síntomas clínicos propios de la enfermedad, además de las manchas blancas, siempre presentes, y termina con la muerte de un alto porcentaje de individuos afectados (Lo y Kou, 1998), si bien una mayor edad de los ejemplares puede determinar una menor mortalidad (Sudha y cols., 1998). Por tanto, la mayor complejidad no radica en el diagnóstico de la enfermedad, sino en la detección de portadores subclínicos, para los que será necesario una técnica de doble PCR, aunque en ocasiones el examen macroscópico puede ser suficiente si existieran manchas blancas en el exoesqueleto de los crustáceos. Métodos de lucha Como en toda enfermedad vírica, al referirnos a lucha queremos decir prevención. Se han descrito, a partir del ciclo ecológico de este agente, recomendaciones que pueden ser útiles para reducir el riesgo y la expansión de la enfermedad. En zonas que no sufren de forma endémica el WSSV, la forma principal de prevención es la adquisición de ejemplares procedentes de factorías libres de WSSV. Esta recomendación se aplica ya para muchas enfermedades en el continente Americano, como el Baculovirus Penaei (BP), o el Virus del Síndrome de Tesalia (TSV) (Lightner y Redman, 1998). Si los reproductores están infectados, las posibilidades de transmisión son elevadas, a pesar de mantener los cultivos de engorde separados de los reproductores. La posibilidad de una transmisión vertical, estando el virus presente tanto en ovocitos, como en el espermatóforo (aunque no en los espermatozoides), y más importante, la convivencia con los adultos tras la eclosión de las larvas, hace que en la practica el 100% de las crías sean portadoras del virus, detectables por doble PCR, aunque no necesariamente vayan a sufrir la enfermedad si no son sometidas a estrés (Lo y cols., 1997). El manejo adecuado, evitando toda situación de estrés supone, sí no un camino hacia la desaparición de la enfermedad, sí una disminución práctica del riesgo de sufrir la enfermedad clínica (Lo y Kou, 1998). También se han estudiado los efectos de inmunopotenciadores, como son los peptidoglucanos, administrados por vía oral, como aditivo en el pienso. Probados en infecciones experimentales, aumentan el porcentaje de supervivencia (Itami y cols., 1998). Como potenciales fuentes de virus, no solo hay que contar con los ejemplares cultivados, sino que como se ha señalado anteriormente, la dieta que contenga cualquier tipo de crustáceos frescos o congelados es una potencial fuente de infección, por lo que existe hoy en día la propuesta de limitar la comercialización de productos provenientes de países asiáticos en el continente americano (Nunan y cols., 1998). Para prevenir este riesgo, se ha sugerido el uso exclusivo de pienso seco extrusionado, puesto que el virus puede soportar la congelación, pero es sensible a la desecación (Lo y Kou, 1998). Uno de los elementos a tener en cuenta son los reservorios naturales del virus. Diversos tipos de crustáceos son portadores y diseminadores del virus, y en zonas endémicas, la solución pasa por impedir la entrada a las instalaciones de cangrejos salvajes (Lo y Kou, 1998). El último punto de interés es el agua. Una alta concentración del virus puede persistir en el agua de mar hasta 120 días, de forma experimental. Sin embargo a concentraciones naturales no resiste infectante más de 5-7 días, tiempo suficiente no obstante para diseminar la infección (Maeda y cols.

5 1998). Algunos de los métodos de desinfección que han resultado eficaces son el hipoclorito sódico, a concentración de 10ppm durante 5, la povidona yodada, a igual concentración y dosis, o concentraciones del 15% de Cloruro Sódico (Maeda y cols., 1998). Otros métodos que se han utilizado de forma experimental son las radiaciones ultravioleta, ph extremo (ph 3 durante 1h), o el uso de ozono, que produce la inactivación del virus con T.R.O. (Residuo Oxidante Total) de 0 5 mg/ml (Chang y cols., 1998b). La desinfección tras un vacío sanitario, y la adquisición de ejemplares libres de WSSV, conjuntamente con una dieta segura, y evitar en la medida de lo posible el contacto con los posibles reservorios, son las directrices para la lucha frente a esta enfermedad. Referencias bibliográficas Chang, P.S.; Lo, C.F.; Wang, Y.C.; Kou, C.H. (1996): Identification of white spot syndrome associated baculovirus (WSBV) target organs in the shrimp Penaeus monodon by in situ hybridization. Diseases of Aquatic Organisms, 27: Chang, P.S.; Tasi, D.H.; Wang, Y.C. (1998a): Development and evaluation of a dot blot analysis for the detection of white spot syndrome baculovirus (WSBV) in Penaeus monodon. Fish Pathology, 33: Chang, P.S.; Chen, L.J.; Wang, Y.C. (1998b): The effect of ultraviolet irradiation, heat, ph, ozone, salinity and chemical disinfectants on the infectivity of white spot syndrome baculovirus. Aquaculture, 166: 1-17 Inouye, K.; Miwa S.; Oseko, N.; Nakano, H.; Kimura, T. (1994): Mass mortalities of cultured kuruma shrimp, Penaeus japonicus in Japan in 1993; electron microscopic evidence of the causative virus. Fish Pathology,29: Itami, T.; Asano, M.; Tokushige, K.; Kubono, K.; Nakagawa, A.; Takeno, N.; Nishimura, H.; Maeda, M.; Kondo, M.; Takahashi, Y. (1998): Enhancement of disease resistance of kuruma shrimp, Penaeus japonicus, after oral administration of peptidoglycan derived from Bifidobacterium thermophilum. Aquaculture, 164: Lightner, D.V. (ed.) (1996): A handbook of pathology and diagnostic procedures for diseases of penaeid shrimp. World Aquaculture Soc. Baton Rouge. Section 3.11 Lightner, D.V.; Redman, R.M. (1998): Strategies for the control of viral diseases of shrimp in the Americas. Fish Pathology, 33: Lo, C.; Ho, C.; Peng, S.; Chen, C.H.; Hsu, H.C.; Chiu, Y.L.; Chang, C.F.; Liu, K.F.; Su, M.S.; Wang, C.H.; Kou, G.H. (1996): White spot syndrome baculovirus (WSBV) detected in cultured and captured shrimp, crabs and other arthropods. Diseases of Aquatic Organisms, 27: Lo, C.F.; Ho, C.H.; Chen, C.H.; Liu, K.F.; Chiu, Y.L.; Yeh, P.Y.; Peng, S.E.; Hsu, H.C.; Liu, H.C.; Chang, C.F.; Su, M.S.; Wang, C.H.; Kou, G.H. (1997): Detection and tissue tropism of white spot syndrome baculovirus (WSBV) in captured brooders of Penaeus monodon with a special emphasis on reproductive organs. Diseases of Aquatic Organisms, 30: Lo, C.F.; Kou, G.H. (1998): Virus-associated white spot syndrome of shrimp in Taiwan: a review. Fish Pathology, 33: Maeda, M.; Kasornchandra, J.; Itami, T.; Suzuki, N.; Hennig, O.; Kondo, M.; Albaladejo, J.D.; Takahashi, Y. (1998): Effect of various treatments on white spot syndrome virus (WSSV) from Penaeus japonicus (Japan) and P. monodon (Thailand). Fish Pathology, 33: Nunan, L.M.; Poulos, B.T.; Lightner, D.V. (1998): The detection of white spot syndrome virus (WSSV) and yellow head virus (YHV) in imported commodity shrimp. Aquaculture, 160: Peng, S.F.; Lo, C.F.; Liu, K.F.; Kou, G.H. (1998): The transition from pre-patent to patent

6 infection of white spot syndrome virus (WSSV) in Penaeus monodon triggered by pereiopod excision. Fish Pathology, 33: Sudha, P.M.; Mohan, C.V.; Shankar, K.M.; Hegde, A.I. (1998): Relationship between white spot syndrome virus infection and clinical manifestation in Indian cultured penaeid shrimp. Aquaculture, 167: Wang, C.S.; Tang, K.F.J.; Kou, G.H.; Chen, S. (1997a): Light and electron microscopic evidence of white spot disease in the giant tiger shrimp, Penaeus monodon (Fabricius), and the kuruma shrimp, Penaeus japonicus (Bate), cultured in Taiwan. Journal of Fish Diseases, 20: Wang, C.S.; Tsai, Y.J.; Kou, G.H.; Chen, S.N. (1997b): Detection of white spot disease virus infection in wild-caught greasy back shrimp, Metapenaeus ensis (de Haan) in Taiwan. Fish Pathology, 32: Wang C.; White, B.L.; Redman, R.M.; Lightner,D.V. (1999): Per os challenge of Litopenaeus vannamei postlarvae and Farfantepenaeus duorarum juveniles with six geographic isolates of white spot syndrome virus. Aquaculture, 170: 3-4, Artículo publicado en la Revista AquaTIC nº 8, noviembre 1999