Técnicas: ELISA y Western Blot
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- Bernardo Duarte Farías
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1 Técnicas: ELISA y Western Blot Aspectos prácticos Prof. Diana Ortiz Cátedra Inmunología EJMV-UCV dprincz@gmail.com
2 Fundamento: Técnica de ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay: Ensayo por Inmunoadsorción Ligado a Enzimas. Inmunoensayo: detección Antígeno Anticuerpo unido a una enzima y cuantificado por espectofotometría Ventajas: Es una prueba de alta sensibilidad y especificidad. Es cuantitativa. Es relativamente económica. Se pueden procesar hasta 96 muestras por placa. Reactivos de gran estabilidad. Limitaciones: Positividad Vs. Infección activa: depende del tipo de anticuerpo evaluado. A menos que se evalúe presencia de antígenos en la muestra problema. Dificultad de detección de Acs en pacientes con alguna inmunodeficiencia, en período de ventana o infectados por cepas desconocidas.
3 Tipos de ELISA: Técnica de ELISA
4 Técnica de ELISA
5 Técnica de ELISA Fases: 1. Unión del antígeno o anticuerpo primario a los pocillos de la placa (soporte sólido (polímero): poliestireno, polivinilo) 2. Lavado 3. Bloqueo 4. Muestra (antígeno o anticuerpo) 5. Lavado 6. Anticuerpo secundario conjugado con una enzima (sensibilidad) 7. Lavado 8. Sustrato de la enzima 9. Cuantificación (lector de ELISA)
6 Técnica de ELISA Aspectos a considerar: Adecuado uso de controles positivos y negativos (control de calidad). Adecuado diseño de la técnica (Ag-Ac, Enzima sustrato). Concentración/ dilución de antígenos y anticuerpos. Reactivos en buen estado. Cuidado de la cadena de frío.
7 Técnica de ELISA Evaluación de anticuerpos ELISA Estuches comerciales: Detección de anticuerpos IgM, IgG, IgE, IgA. Kit Pyloriset EIA-G (Orion Diagnostic): Títulos 20 positivos
8 Técnica de ELISA Elisa estandarizada en laboratorio 1.- IgA secretora anti H. pylori en saliva: (ELISA) Sensibilización: 2,5µg/pozo Ag Hp toda la noche a 4 C o 2h a 37 C Lavado: 3 veces con 200 µl de PBS-Tween Bloqueo: PBS-BSA 1% x 2h a 37 C Muestras de saliva 1/10 x 1h a 37 C Lavado: 3 veces con 200 µl de PBS-Tween Anticuerpo secundario conjugado: con peroxidasa 1/1000 x 1h a 37 C Revelado: OPD (o-phenylenediamine) + Peróxido de hidrógeno Se detiene la reacción con H 2 SO 4 Valores: UDO > 0,300 positivos (Ortiz y col., 2000) 2.- IgA secretora total en saliva: (ELISA) Monoclonal IgA (Sigma) (Ortiz y col., 2000)
9 Enzimas más utilizadas: Peroxidasa Fosfatasa alcalina β-galactosidasa Tetra-metil-benzidina Técnica de ELISA
10 Técnica de ELISA Interpretación de resultados: Qué es un valor cut off? Títulos de anticuerpos Valores reportados en unidades de Densidad óptica
11 Técnica de ELISA Algunas Aplicaciones de la ELISA Determinación de hormonas: progesterona, estrógenos, cortisol, insulina, HGC, etc. Proteínas Agentes infecciosos (virales, bacterianos, parásitos, hongos) Marcadores de drogas Control de calidad de vacunas Screening de recién nacido Investigación clínica Anticuerpos: Acs antinucleares Antígenos tumorales: alfa-feto-proteína, Ag prostático, carcinoembrionario, etc. Autoanticuerpos
12 Una variante de la ELISA Elispot Mide el número de células productoras de anticuerpos. El antígeno se une al fondo de un pocillo, se añaden las células productoras de anticuerpos en un medio semisólido y los anticuerpos que se han secretado y unido se detectan mediante un anticuerpo anti-ig ligado a una enzima como en un ELISA.
13 Inmunohistoquímica
14 Western Blot Western blot, inmunoblot o electrotransferencia, técnica analítica altamente específica utilizada para identificar proteínas específicas en una mezcla compleja de proteínas, presente en extractos celulares o de tejidos. Etapas: 1. Preparación de la muestra 2. Separación de la muestra por tamaño (Electroforesis en gel de poliacrilamida) 3. Transferencia a un soporte sólido (membrana de nitrocelulosa ) 4. Visualización mediante marcaje de proteínas con el uso de anticuerpos primarios o secundarios apropiados.
15 Preparación del gel de poliacrilamida SDS-PAGE y corrida electroforética. Western Blot
16 Western Blot Tinción del gel con azul de Coomassie
17 Transferencia Western Blot Se transfieren las bandas de proteínas o desde el gel hacia una membrana de nitrocelulosa (flechas azules).
18 Western Blot
19 Western Blot
20 Western Blot
21 Revelado Western Blot
22 Western Blot Wang, Mol Vis 2012; 18:
23 Western Blot CORTES X, GARCIA Z, TORRES L, TAYLOR L. Patrones Indeterminados de Western Blot en sueros reactivos por anticuerpos contra los virus linfotrópicos de células T tipo I/II (HTLV I/II) en donantes de sangre en Costa Rica. Rev. costarric. cienc. méd [online]. 2007, vol.28, n.1-2 [cited ], pp
24 Western blot
25 Western blot Aplicaciones: Investigación: Es una de las técnicas más usadas en el estudio de la biología molecular Permite identificar antígenos inmuno-dominates para vacunas. Estudiar perfil de citocinas. Presencia o ausencia de una proteína y sus niveles en una muestra. Factores de crecimiento Niveles de fosforilación, modificaciones post traduccionales, etc Diagnóstico: Prueba confirmatoria de VIH Prueba de la encefalopatía espongiforme bovina, comúnmente llamada enfermedaddelasvacaslocas Enfermedad de Lyme.
26 Western Blot
27 ELISA Vs. Western Blot
28 MABA Ensayo de unión a múltiples antígenos: MABA Muestras: Sueros y salivas Péptidos 20 g/ml diluidos en buffer carbonato ph 9.6 (1 h) Bloqueo: leche descremada al 5% en PBST ph 7.2 (2 h) Muestras: Suero 1/100 en PBST (1 ½ h) Saliva 1/10 Anti IgG o IgA peroxidasa 1/30.000, 1/6000 (1 ½ h) Revelado quimioluminescente Identificación de reconocimiento a epitopes sintéticos (Noya o y col, 1998)
29 MABA (Ortiz-Princz D, 2015) Fig. 24: Reactividad de sueros (IgG) frente a péptidos sintéticos de H. pylori utilizando MABA. En vertical se muestran las tiras correspondientes a cada paciente: tira 1: conjugado, tiras 2-28 sueros de pacientes. En horizontal están los péptidos sintéticos que fueron sensiblizados en el papel de nitrocelulosa, del 2-4: péptidos de UreB, 5: pool de Ure, 6: pool de flagelina, 7-14: péptidos de VacA, 15: pool de VacA, 16-26: péptidos de Cag, 27: pool de Cag, 1 y 28: Antígeno de H. pylori.
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