12 Activación Células NK

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1 12 Activación Células NK M. López-Botet y J. Peña Función citotóxica Función secretora Receptores activadores Receptores específicos antígenos HLA KIR ILT Tipo lectina Transducción señales INTRODUCCION Las células NK participan activamente en la defensa del organismo frente a infecciones, principalmente de tipo viral y frente al crecimiento de célalas tumorales. Estas células participan tanto en la defensa innata y como en los mecanismos de defensa adquirida o adaptativa. La función esencial de estas células es identificar y destruir células blanco. También es importante su función reguladora del sistema inmune debido a su capacidad secretora tanto de citocinas como de quimiocinas. Las células NK constituyen la tercera estirpe de células de tipo linfoide. Carecen de TCR y de Igm y, en su mayoría, expresan en superficie las moléculas FcgammaR-III (CD16) y CD56 que junto con otros marcadores definen a este grupo celular (Tabla 12.1). La detección de algunos de estos marcadores puede ser variable, definiéndose varias subpoblaciones NK, tales como células muy positivas para CD56 (CD56 bright), muy poco positivas para este marcador (CD56 dim ), o células CD16 + CD56 + o CD16 - CD56 +, etc. Las células NK se encuentran en sangre, bazo y médula ósea y en muy baja proporción en ganglios linfáticos. FUNCIÓN CITOTÓXICA DE LAS CÉLULAS NK La función citotóxica de las células NK fue la primera acción asignada a estas células y el motivo de su descubrimiento (Tabla 12.2). Para que las células NK ejerzan su función citotóxica se requiere la identificación, a través de los receptores implicados, de las células blanco. Entre estos receptores destacan receptores de activación y otro grupo recientemente descrito de receptores que tienen como ligando moléculas de histocompatibilidad clase I y que pueden ser de tipo inhibidor o activador (Figura 12.1). En este fenómeno además intervienen ciertas citocinas y moléculas de adherencia facilitadoras de la interacción celular. Mediante la acción citolítica, las células NK pueden destruir un amplio espectro de células, tanto anormales (infectadas por virus o tumorales) como incluso normales (alogénicas). Esta lisis se realiza de manera directa, lisis natural, o bien mediante la participación de anticuerpo, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos o ADCC (Figura 12.2). La citotoxicidad natural consiste en lisis de una gran variedad de células de manera espontánea y sin necesidad de un periodo de sensibilización previa. De ahí la denominación dada de NK (de natural killer) debido a que la capacidad citolítica que presentan lo hacen, a diferencia de las células T citotóxicas, de una manera natural, esto es sin necesidad de un aprendizaje preliminar. Esto implica que estas células no requieren un proceso de preparatorio de activación para destruir células en los términos que lo hacen los linfocitos T citotóxicos, pero sin duda la activación por células blanco o por citocinas hace que esta función sea mas eficiente. Kärre y cols. observaron que variantes de una misma línea celular tumoral manifestaban distinto grado de sensibilidad a la lisis NK, que se correlacionaba inversamente con la expresión de moléculas de clase I del MHC (Figura 12.3). Por otra parte, la transfección de células diana con moléculas del MHC-I les confería resistencia. Los autores propusieron la teoría de missing self para explicar los fenómenos de citotoxicidad natural. Así hoy se considera que pese a que las células NK son responsables de mecanismos de citolisis

2 inespecífica no restringida por el MHC, se sabe que la función de las células NK está regulada en parte por el reconocimiento de moléculas MHC de clase I (MHC-I) en la célula diana. La citotoxicidad dependiente de anticuerpos (ADCC), implica la presencia de anticuerpos que son reconocidos por su extremo Fc por los receptores CD16 presentes en las células NK y también en otras células, como son los macrófagos. Cuando el CD16 reconoce su ligando activa la maquinaria lítica de la célula NK. FUNCIÓN SECRETORA DE LAS CÉLULAS NK Además de la acción citotóxica, las células NK tienen la propiedad de sintetizar y liberar diversos tipos de citocinas de gran importancia en la regulación del sistema inmunitario, en la acción de las propias células NK y en otras funciones como es la hematopoyesis (Figura 12.4 y Tabla 12.2). Las principales citocinas producidas por las células NK son TNF-alfa, IFN-gamma, IL-3, GM-CFS y M-GSF. Estos inmunomoduladores se producen como consecuencia de la activación de células NK como consecuencia de su interacción con la célula blanco, por la acción de diferentes citocinas como son IL-2 y Il-12 o por activación directa, por ejemplo por anticuerpos frente a las moléculas CD16, CD69, CD80 y otras. También las células NK producen cuando son estimuladas ciertas quimiocinas, tales como MIP-1alfa, MIP-1beta y RANTES de gran importancia en los fenómenos inflamatorios. En la tabla 12.3 se recogen las principales diferencias funcionales entre las células NK y los linfocitos T. Hoy se sabe que las células NK mas positivas para el CD56 (CD56 bright ) poseen mayor capacidad para producir citocinas que las células mas débiles para esta molécula (CD56 dim ). A su vez las células NK CD56 dim poseen mayor capacidad citotóxica que las CD56 bright. RECEPTORES ACTIVADORES DE CÉLULAS NK Para que las células NK desarrollen su función tienen que identificar a la célula blanco. Para ello las células NK poseen diferentes tipos de receptores con función de reconocimiento de moléculas en las células blanco y en consecuencia de activar la maquinaria citolítica y/o secretora de estas células. Después veremos como junto a estos receptores de tipo activador existen otros cuya función es inhibidora. En consecuencia hoy se conoce que la acción final de las células NK depende del equilibrio entre las señales inhibidoras y activadoras procedentes de sus receptores de superficie. Entre los receptores de activación de las células NK destacan el CD16, CD80, CD43 y los recién descritos receptores de citotoxicidad natural (NCKs) y entre los inhibidores destacan ciertos receptores presentes en las células NK con capacidad de reconocer molécula de histocompatibilidad (Receptores NK de HLA) (Tabla 12.4). Receptor CD16. La vía de activación a través de CD16 es, al menos parcialmente, comparable a la del CD3/TCR. Ambos receptores se asocian a ciertas cadenas del complejo CD3, implicadas en la transducción de señales. Por otra parte, la estimulación vía CD16, determina también la activación de ciertas cinasas y PLC-gamma, y se ha demostrado su asociación molecular con p56lck.

3 Receptores de citotoxicidad natural. Los receptores de citotoxicidad natural (NCKs), han sido descritos recientemente y de manera mayoritaria por el grupo de Moretta, mediante el empleo de anticuerpos monoclonales en ensayos en donde lo que se ha analizado es la capacidad de inhibir la lisis de determinadas líneas celulares tras el uso de los mencionados anticuerpos. Entre estos receptores destacan tres conocidos como: NKp46, NKp44 y NKp30. También recientemente se han descrito receptores de tipo activante que se caracterizan por reconocer específicamente moléculas de histocompatibilidad y que trataremos a continuación. RECEPTORES NK ESPECIFICOS DE ANTÍGENOS HLA. El reciente descubrimiento de receptores presentes en células NK que reconocen moléculas de histocompatibilidad y que tienen funciones reguladoras de la función de estas células ha abierto una importante puerta para entender la biología de estas células. Los sistemas experimentales convencionales para estudiar estos fenómenos analizan la actividad de clones/subpoblaciones NK frente a líneas tumorales deficientes en la expresión de MHC-I, transfectadas selectivamente con diferentes moléculas de clase I. Los receptores NK específicos de antígenos HLA clase I son un grupo heterogéneo de glicoproteínas que pertenecen a distintas familias de moléculas y se expresan en células NK pero también en ciertos linfocitos T (Figura 12.5 y Tabla 12.5). 1. La primera familia incluye receptores de antígenos HLA-I pertenecientes a la superfamilia de las inmunoglobulinas. Originariamente estos receptores se conocieron por su acción inhibidora de la citotoxicidad y se denominaron como KIRs (killer cell Iglike receptors). 2. Otro grupo de estos receptores pertenece también a la superfamilia de las inmunogbubulinas y son conocidos como ILTs (immunogloobulin like transcripts). 3. Además existe otro grupo de receptores que son heterodímeros formados por la asociación de dos moléculas diferentes con dominio lectina tipo C como es el CD94 que se puede unir a miembros de las superfamilia de moléculas NKG2. Estos receptores pueden tener acción inhibidora, que es como originariamente se descubrieron, pero pueden poseer también acción activante de acuerdo con la estructura de la parte citoplasmatica de sus moléculas. Receptores NK tipo KIR. Se trata de receptores que pertenecen a la familia de las inmunoglobulinas. Originariamente estos receptores fueron descubiertos porque estaban implicados en la inhibición de la lisis al interaccionar específicamente con determinadas moléculas HLA de clase I de la célula blanco (Figura 12.6). En primer lugar, se observó cierta correlación entre la expresión de estos receptores por distintos clones NK y el reconocimiento de diferentes grupos de alelos de HLA-C. Por otra parte, se observó que anticuerpos monoclonales frente a estos receptores restablecían la citotoxicidad de los clones NK frente a dianas protegidas específicamente por la expresión de moléculas HLA. En la tabla 12.6 se recoge una lista de estos receptores y las moléculas que reconocen (Figura 12.6). Según el número de dominios presentes en la molécula del receptor a la palabra KIR, se añaden los sufijos 2D y 3D que indican el número de los dominios de inmunoglobulina que poseen y la letra L (long) o S (short) según que la cola citoplasmática de estas moléculas sea

4 larga o corta respectivamente (Tabla 12.6). Estos receptores pueden ser de tipo inhibidor o de tipo activante. En este último caso estos receptores se asocian de manera covalente con la molécula DAP-12. La distribución de estos receptores en las células NK no es homogénea y cada clon NK puede expresar uno o varios tipos de estos receptores. Se aprecian claras diferencias en la expresión de cada receptor cuando se estudian distintos individuos, y hay indicios en los que el repertorio de receptores está regulado durante el desarrollo por factores genéticos, incluyendo presumiblemente la influencia del propio MHC. A estos receptores recientemente se les ha dado la denominación de CD158 seguido de una letra (ente a y k) según el tipo de receptor. En la Figura 12.7, se recogen los distintos tipos de receptores y las moléculas que reconocen y en la Figura 12.8 se recoge un modelo de la estructura tridimensional de esta molécula unida a un antígeno de histocompatibilidad. Los genes que codifican estos receptores se encuentran localizados en el cromosoma 19 en humanos en una en donde se codifican también los receptores ILTs, Fca y NKp46 (Figura 12.9). Receptores NK tipo ILT Otro grupo de receptores, que también pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas, se conocen como ILTs (immunogloobulin like transcripts) o como LIR (leukocyte Ig-like receptor). Alguno de estos receptores reconocen moléculas HLA-G y la proteína UL18 (LIR1 y LIR2) del citomegalovirus humano y tiene una distribución muy extensa en diferentes tipos de células incluyendo no solo células NK sino también monocitos y ciertas células de tipo polimorfonuclear (Tabla 12.7). A estos receptores recientemente se le ha dado la denominación de CD85 seguido de una letra (a-m) para definir el tipo de receptor. Receptores NK tipo lectina. La tercera familia de estos receptores de HLA esta formada por un grupo heterodimero compuesto por moléculas de tipo C-lectina que comprende la molécula CD94 unida covalentemente de manera alternativa a diferentes moléculas pertenecientes a la familia NKG2 (A, B, C, E y H). La molécula CD94, fue identificada originalmente por uno de nosotros (M. López- Botet) en el laboratorio del Hospital de la Princesa. Este receptor reconoce moléculas de HLA-E en asociación con péptidos derivados de la secuencia líder de otros antígenos HLA-I (Figura 12.10). Las moléculas de la familia NKG2 pueden ser de distinto tipo: A, B, C, E y H. Resultan así que de la combinación del receptor CD94 con los distintos miembros de NKG2, resultan los dímeros CD94/NKG2A, CD94/NKG2C, etc. Esta posibilidad de unirse el CD94 a diferentes miembros de la familia NKG2 justifica la acción unas veces, inhibidora (por ejemplo CD94/NKG2A) y otras activante (por ejemplo CD94/NKG2C) descritas originariamente para este receptor (Tabla 12.8). Consideramos a este receptor de especial importancia en los procesos de regulación de la acción de células NK in vivo, debido a la extensa distribución de las moléculas de histocompatibilidad HLA-E que reconoce y sobre todo por el hecho de encontrarse presente en un amplio numero de células NK (60-80 %) y ciertos linfocitos T, mientras que por ejemplo los recetores KIRs lo están en una proporción de células mucho más baja. La expresión de CD94 es regulada por ciertas citocinas tales como IL-15 IL-10 y TGF-beta. Recientemente se ha visto que los receptores de tipo activante poseen además del CD94 y un miembro de NKG2 (C, E y H), la molécula DAP-12 que posee motivos ITAM, y por tanto se caracteriza por la transmisión de señales de activación. En la Figura se recoge un modelo tridimensional de CD94 unido a una molécula de HLA- E que es su ligando natural. Los genes que codifican tanto los receptores CD94 como los de

5 la familia NKG2 se encuentran localizados en el cromosoma 12 en humanos en una zona conocida como complejo génico NK ( Figura 12.9). Receptores NK de moléculas HLA en otras células Los receptores NK específicos de moléculas HLA se encuentran también en otras estirpes celulares no NK, aunque en una menor proporción y densidad. Este es el caso de una población especial de células NK se encuentran en la decidua y que son conocidas como células NK deciduales y cuya función no esta completamente esclarecida. Otra población conocida que expresa estos receptores corresponde a las células NKT cuya función tampoco esta totalmente esclarecida. Estas células se caracterizan por poseer el fenotipo T con ciertos marcadores de células NK y que se encuentran en gran proporción en el hígado. Estas células son TCR alfa/beta positivas y expresan Va14/Ja18 y tienen la capacidad de reconocer moléculas de histocompatibilidad no clásicas, CD1. Estas células poseen capacidad citolítica, producen ciertas citocinas y su proliferación es activada por IL-12. Algunos de estos receptores se encuentran también en linfocitos T, principalmente del tipo citotóxico (Tc) pero también en linfocitos Th, lo que hace pensar que además de su intervención en la regulación de los procesos citotóxicos de las células intervengan también en su regulación funcional, principalmente en la secreción de citocinas. TRANSDUCCION DE SEÑALES Tal como se ha indicado con anterioridad, tanto los receptores KIR, ILT como el homodímero de CD94 con distintos miembros de la familia de NKG2, pueden ejercer acciones inhibidoras como activantes. El que ejerzan una u otra acción depende de la cola citoplasmatica de dichas moléculas y de las cinasas con las cuales se asocien. Mecanismos de inhibición. Los receptores inhibidores se caracterizan por poseer en sus dominios intracitoplasmáticos los motivos YxxL-26-YxxL, denominados ITIM (immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs) (Figura 12.12). Estos motivos tienen la propiedad de unirse al dominio SH2 que contiene las tirosin fosfatasas, SHP-1 y SHP-2, y así producir inhibición de la citotoxicidad. En la figura se representan un ejemplo de cada uno de los dos tipos de receptores, inhibidores y activadores. Es de destacar que esta acción inhibidora ejercida por los receptores inhibidores después de reconocer a su ligando (HLA clase I) en la células tiene una gran importancia fisiológica, pues esto previene la destrucción de las célula normales del huésped. Esto se debe a que, como se sabe, la mayoría de las células del organismo expresan moléculas de histocompatibilidad clase, incluidas las moléculas HLA-E. Precisamente cuando una célula deja de expresar moléculas de histocompatibilidad, entones pude ser destruida por las células NK al no ser frenada su actividad por no actuar los receptores de tipo inhibidosr (Figura 12.14), Estos mismos fenómenos has sido descritos para linfocitos T, en los que el efecto activador mediado por el TCR-CD3, puede ser bloqueado por acción de un receptor de tipo inhibidor (Figura 12.15). Los receptores de este grupo son KIR2DL, KIR3DL, ILT-2, NKG2A y NKG2B. Mecanismos de activación. Aunque los receptores de antígenos HLA se describieron primero como receptores de tipo inhibidor por su capacidad de bloquear la citotoxicidad dependiente de células NK, posteriormente se han encontrado receptores muy homólogos, que diferían solo en los dominios intracelulares y que funcionaban induciendo señales de tipo activador. Estos receptores poseen una parte citoplasmática muy corta, carecen de la secuencias ITIMs y

6 tienen la propiedad de asociarse a las molécula DAP-12. Estos receptores son KIRD2S, NKG2C, NKG2E y NKG2H. El DAP-12 es un homodimero conocido también como KARAP (Killer activating receptor associated protein), gracias al cual se lleva a cabo la transmisión de señales en el citoplasma de la célula. La molécula DAP12 se caracteriza por contener en su parte citoplasmática un dominio conocido como ITAM (immunoreceptor tyrosine-based activating motif) y tiene la capacidad de unir las cinasas ZAP-70 y Syk. ACTIVACION NK Y RESPUESTA INMUNE INNATA. Las células NK forman parte de la primera barrera defensiva del individuo junto con macrófagos y polimorfonucleares (Figura 12.16). Constituyen así parte de la respuesta inmune innata. Ciertas citocinas que potencian el efecto de estas células son producidas precisamente por macrófagos en las primeras fases de la infección (Tabla 12.9). Las células NK actúan destruyendo células (por ejemplo infectadas por virus) y produciendo citocinas y quimiocinas, que intervienen regulando el sistema inmune y el proceso inflamatorio (Figura 12.17). INMUNOPATOLOGIA DE LAS CÉLULAS NK. Las células NK son de especial importancia en las primeras fases de la infección, especialmente frente a virus, de ahí que cuando estas células no actúan correctamente, el individuo se hace mas vulnerable a la infecciones virales. Por ejemplo en individuos infectados por HIV-1, se ha podido comprobar que las células NK han disminuido su capacidad citolítica, lo que puede explicar que el virus HIV-1 se desarrolle con mas facilidad. De igual manera ha podido ser comprobado que las células NK infiltrantes de tumores poseen menor capacidad citolítica que las células NK normales, probablemente por un aumento de expresión de receptores de tipo inhibidor. Por otra parte una excesiva capacidad citotóxica de las células NK pueden inducir estados de pérdida de la tolerancia normal y contribuir al desarrollo de enfermedades de tipo autoinmune. Recientemente se ha visto que las células NK, pueden ser utilizadas en terapia anti-tumoral. Para ello después de su extracción del individuo y cultivo con Il-2, IL-12 o IL-15, son posteriormente reinyectadas en el enfermo en forma de células LAK (citokyne activated lymphocytes). En enfermos con SIDA, también se esta tratando de potenciar la respuesta inmune innata y en especial estas células NK, mediante la administración de IL-2, con resultados que son prometedores. BIBLIOGRAFÍA 1. Andre,P., Biassoni,R., Colonna,M., Cosman,D., Lanier,L.L., Long,E.O., Lopez-Botet,M., Moretta,A., Moretta,L., Parham,P., Trowsdale,J., Vivier,E., Wagtmann,N., and Wilson,M.J.: New nomenclature for MHC receptors. Nat.Immunol. 2001, 661, 2: Borrego,F., Kabat,J., Kim,D.K., Lieto,L., Maasho,K., Pena,J., Solana,R., and Coligan,J.E. Structure and function of major histocompatibility complex (MHC) class I specific receptors expressed on human natural killer (NK) cells. Mol.Immunol.2002, 38: Moretta,A., Bottino,C., Vitale,M., Pende,D., Cantoni,C., Mingari,M.C., Biassoni,R., and Moretta,L. : Activating receptors and coreceptors involved in human natural killer cellmediated cytolysis. Annu.Rev.Immunol : Smyth MJ, Cretney E, Kelly JM, Westwood JA, Street SE, Yagita H, Takeda K, van Dommelen SL, Degli-Esposti MA, Hayakawa Y. Activation of NK cell cytotoxicity. Mol Immunol. 2005, 42: Moretta L, Bottino C, Pende D, Vitale M, Mingari MC, Moretta A. Different checkpoints in human NK-cell activation. Trends Immunol. 2004, 25:

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