PRÁCTICA No 7: PRUEBAS DE RELACION FILIAL E IDENTIFICACION

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1 PRÁCTICA No 7: PRUEBAS DE RELACION FILIAL E IDENTIFICACION 1. INTRODUCCION Las pruebas de relación filial son un instrumento muy útil para determinar la relación familiar ya sea una paternidad, identificación de cuerpos en accidentes o desastres, fosas comunes, delitos, violaciones, etc. 2. OBJETIVOS Identificar las diferentes técnicas de relación filial de ácidos nucleicos y proteínas existentes. Diferenciar los tipos de relación filial y su aplicación especifica según el objetivo experimental. Adquirir la habilidad para realizar el proceso de análisis de relación filial. 3. MARCO TEORICO La filiación es el vínculo jurídico que existe entre dos personas donde una es descendiente de la otra, sea por un hecho natural o por un acto jurídico. Del carácter estrictamente jurídico de la relación filial se desprenden ciertas consecuencias. En primer lugar, puede darse que no toda persona tenga una filiación o estado filial. En segundo lugar, la filiación biológica puede perfectamente no coincidir con la filiación jurídica; por ejemplo, si alguien siendo padre biológico, pierde el juicio de reclamación por sentencia pasada en autoridad de cosa juzgada. Una prueba de paternidad es aquella que tiene como objeto probar la paternidad esto es determinar el parentesco ascendente en primer grado entre un individuo y un hombre (presunto padre). Los métodos para determinar esta relación han evolucionado desde la simple convivencia con la madre, la comparación de rasgos, tipo de sangre ABO, análisis de proteínas y antígenos HLA. Actualmente la prueba idónea es la prueba genética basándose en polimorfismo en regiones STRs (Short Tandem Repeats). La prueba de paternidad genética se basa en comparar el DNA nuclear de ambos. El ser humano al tener reproducción sexual hereda un Alelos de la madre y otro del padre. Un hijo debe tener para cada locus un alelo que provenga del padre. Esta comparación se realiza cotejando entre locus del genoma del hijo, del presunto padre y opcionalmente de la madre, en regiones que son muy variables para cada individuo llamadas STRs. Para determinar estadísticamente la exactitud de la prueba, se calcula el índice de paternidad, el cual determina la probabilidad que no exista una persona con el

2 mismo perfil de alelos entre su raza. La cantidad de locus es determinada por la cantidad de marcadores genéticos (que limitan los locus) utilizados, a mayor cantidad de marcadores mayor exactitud. Con el uso de 15 marcadores se puede tener exactitudes de alrededor de 99,999%. Sin embargo esta exactitud puede aumentar según la ocurrencia de alelos extraños en cada individuo. Cuando no se cuenta con muestras del presunto padre, se puede obtener un índice de paternidad utilizando muestras de los padres paternos. También es posible obtener muestras de prenatales mediante procedimiento de amniocentesis y Vellosidades coriónicas. Existen pruebas de paternidad con fines informativos o pruebas de paternidad con fines legales. Las pruebas legales requieren validación de la identidad y custodia de las muestras. En varios países la interpretación legal de derechos constitucionales señala que se tiene que tener consentimiento voluntario de toma de la muestra para pruebas de DNA. Las muestras de la escena del crimen o muestras guardadas o semen producto de violaciones incluyendo mezclas, pueden ser cotejadas con la muestra del individuo y la víctima. 4. MARCADORES GENETICOS Los principales hallazgos en el proyecto genoma humano publicados en el año fueron los siguientes: existe el 99.8% de identidad entre individuos, ~ 1% de diferencia con el genoma del chimpancé, el 3% del DNA es codificante, ~ genes y ~ 3 billones de pares de bases (3 X 10 9 bases). Los aportes del proyecto fueron: Conocimiento total de la secuencia de las moléculas de DNA presentes en el genoma humano; Comprensión de la función de la gran mayoría de nuestros genes, cuya utilidad desconocemos; Posibilidad de pronosticar enfermedades; Diagnóstico temprano de las patologías y eventualmente su corrección y posibilidad de curar enfermedades. Son muy pocas las variaciones existentes entre los individuos: Individuos no emparentados varían una vez cada 10 3 pb. Las variaciones son principalmente en el DNA no codificante (DNA no codificante es aprox. el 70% del genoma), cuando la variación se presenta en más del 1% de población se le llama Polimorfismo, cuando lo presenta menos del 1% de la población se le denomina mutación. De los polimorfismos surgen los marcadores genéticos. Los marcadores genéticos son segmentos de DNA con una localización física identificable y reproducible que pueden ser fácilmente rastreados y usados para construir un mapa cromosómico, aplicación en mapeo genético y en la elucidación de patrones humanos demográficos ancestrales, estudios en evolución (divergencia de especies, de poblaciones etc).

3 Los polimorfismos de regiones codificantes también son importantes y útiles, por su relación con enfermedades y desordenes genéticos, causan alteraciones funcionales de proteínas, conduce a cambios fenotípicos evidénciales y rastreables. Los polimorfismos se generan por mutaciones, secuencias repetidas, diferencias en un nucleótido (SNPs), Inserciones, Deleciones y Recombinación. Los principales polimorfismos son minisatélites y microsatélites: MINISATÉLITES: Evolucionan por mecanismos de larga escala como intercambio desigual. Igual que los microsatélites, evolucionan por unidad de repetición. También se conocen como VNTRs (variable nucleotide tandem repeats). Se encuentran dentro o entre genes, las unidades de repetición son pequeñas (50 > 200 pb), el número de copias en tándem de cada secuencia varía en cada individuo, la variación se genera durante la recombinación genética cuando las unidades de repetición no se alinean bien, presentan altas tasa de intercambio genético (sitios frecuentes durante la recombinación), se utilizan como marcadores y son la base de la huella genética o fingerprinting. MICROSATELITES: (STRs Singel Tandem Sequence Repeats): Son secuencias cortas y repetitivas de ADN (1 a 8 pb), se ubican en regiones no codificantes del genoma, la diferencia en la cantidad de repeticiones en determinados alelos para diferentes individuos, constituye la herramienta más importante de identificación forense, diagnóstico ofrecida por los micro-satélites y pruebas de filiación. En los microsatélites los polimorfismos de LONGITUD son los más comunes en el ADN repetitivo, y pueden ser: Inserción de uno o más nucleótidos y Deleción de uno o más nucleótidos. Usualmente la inserción y la deleción ocurren según el número de nucleótidos de la repetición, es decir por unidad de repetición. Las repeticiones simples: Repeticiones contiguas e idénticas y la unidad repetitiva dinucleótica, flanqueda por una secuencia de nucleótidos diferente a la repetición: TCGATATATATATCAG Las repeticiones compuestas: Repeticiones contiguas diferentes, de baja heterocigocidad, flanquedas por secuencias distintas a la repetición: TCGAAAATAAAAATACAG Las repeticiones complejas: Repeticiones de longitud y secuencia variable, con una alta tasa de mutación: TCGAAAGTAGAAAGTAGTCTC

4 Los diferentes alelos se generan por el número de repeticiones como se observa en el ejemplo: 5. PRUEBAS DE FILIACION Es una serie de pruebas biológicas destinadas a realizar la identificación de uno de los progenitores, partiendo del estudio del otro y del hijo cuestionado, abuelos, presuntos tíos, identificación materna, presuntos hermanos paternos biológicos. También sirven para establecer relaciones familiares y paternidad en casos de delitos como la violación, el aborto, el cambio de bebe en los Hospitales, el secuestro y la identificación de restos humanos entre otros. DETECCIÓN DE LOS STRs: Los STRs se detectan por medio de PCR (reacción de polimerización en cadena), con iniciadores (primers o cebadores que están marcados con fluorocromos), en un templado de DNA obtenido de los individuos (ver abajo figura). El fin de la PCR es obtener muchas copias de una región del DNA. Luego los productos de la PCR se separan en un campo eléctrico de acuerdo a su tamaño y son detectados por diferentes métodos (coloración de plata o detección del fluorocromo). Forward primer AATG 7 repeats Reverse primer 8 repeats Los equipos de lectura arrojan electroferogramas que son las representaciones de los alelos amplificados, los cuales han sido codificados de acuerdo a convenciones internacionales y mediante un marcador interno conocido agregado al producto de PCR con el fin de asignar alelos por comparación, como se observa en la figura siguiente para cada individuo.

5 Electroferograma para un individuo Posteriormente, de forma comparativa se hace el cotejo del perfil de los individuos integrantes del caso: Comparación de los perfiles de un presunto padre, una madre y un hijo

6 Comparando los alelos del hijo con de la madre se establece el alelo heredado de la madre y por descarte el paterno. Según la gráfica anterior: el sistema D13S317, Presunto padre 11-12, Madre: 13-14, Hijo: Vemos que en el sistema D7S820, difiere entre el presunto padre y el hijo, mientras que en los otros sistemas comparte al menos 1 alelo con el presunto padre. Con los alelos deducidos no es suficiente para demostrar la paternidad de un individuo, debido a que cada población tiene unos alelos característicos, que difieren con los de otra población, por ejemplo una población de Afro descendientes frente a una población de mestizos, por lo tanto si son alelos muy frecuentes en la población, el padre del menor podría ser cualquier individuo de la población. Por tal motivo hay que tener en cuenta estudios poblacionales previos en poblaciones referencia para aplicar los cálculos estadísticos que acompañan la prueba. La población de referencia para un caso dado es la población donde fue concebido un individuo. COTEJO DE PATERNIDAD: Que tan probable es que sea el padre una vez se ha demostrado que posee todos los AOPs (Alelos obligados paternos). Contrastar los resultados obtenidos con dos hipótesis y realizar los cálculos probabilísticos. La primera hipótesis: X (probabilidad de que el presunto padre sea el padre del menor en cuestión). La segunda Hipótesis: Y (Asumimos que el padre puede haber sido otro individuo dentro de la población que tenga el mismo alelo obligado paterno, del individuo que estamos analizando). Cómo encontramos el X? Asumimos un cruce mendeliano: PP MADRE HIJO D8 10,11 13,13 11,13 Cómo la encontramos Y? PP MADRE HIJO AOP D8 10,11 13,13 11,13 11 Y = 1(frecuencia del AOP, dentro de la población). Índice de paternidad IP = X / Y Probabilidad de paternidad W = X/(X+Y) IP= P (H/M) / P (H/M)*AOP W= IP total / IP total+1

7 Emisión de conclusiones: No exclusión: Se observa que PP posee todos los alelos obligados paternos (AOP) que debería tener el padre biológico de la menor H. Se calculó entonces la probabilidad que tiene de ser el padre biológico comparado con otro individuo tomado al azar en la población de la región Andina de Colombia. PP no se excluye como el padre biológico de la menor YYYYYYY. Probabilidad de Paternidad: %. Es ,74 veces más probable que XXXXX sea el padre biológico de la menor H a que no lo sea. Exclusión: Se observa que PP no posee todos los alelos obligados paternos (AOP) que debería tener el padre biológico de la menor H en DIECISEIS (16) de los sistemas genéticos analizados: D8S1179, D21S11, HUMCSF1P0, D3S1358, HUMTH01, D13S317, D16S539, D2S1338, D19S433, HUMVWA31, HUMTPOX, D18S51, D5S818, HUMFGA Y AMGX-Y. PP queda excluido de la paternidad de la menor H. Principio: Los STRs son polimórficos y son heredados de padres a hijos de tal forma que cada hijo posee una copia de un STR del padre y una de la madre, siendo posible establecer relaciones familiares. Objetivo: Observar el comportamiento de la herencia entre personas relacionadas mediante los STRs. Materiales y reactivos: Guía y fotocopias de diferentes casos de filiación, calculadora. Procedimiento: De acuerdo a la explicación magistral y la guía, hacer la identificación humana del caso que será asignado, incluyendo los cálculos de probabilidades. Sistema PRESUNTO PADRE MADRE MENOR Genético/STRs D8S D21S D7S HUMCSF1PO D3S HUMTH D13S D16S D2S D19S HUMVWA HUMTPOX D18S D5S HUMFGA AMGX-Y XY XX XY AOP

8 Cálculos probabilisticos Sistema X Y W IP D3S1358-An Valor de X: VWA31-And FGA-And Valor de Y: TH01-And TPOX-And IP total: CSF-And D5s818-And D13s317-An Probabilidad de D7s820-And Paternidad: D21s11-And D16s539-An D18s51-And D8S1179-An D2-Hisp D19-Hisp 6. POSTLABORATORIO: 1. Obtener el AOP, el Índice de paternidad y la probabilidad de paternidad 2. Explica cada uno de los 16 sistemas genéticos STRs utilizados. 3. Qué porcentaje de información genética se tiene de los abuelos? 4. Para qué sirve el DNAmt (mitocondrial) en los casos de filiación? 5. Para qué sirve el cromosoma Y en filiación? 6. Qué es una mezcla y como se analiza? 7. BIBLIOGRAFIA AGUIAR BRAVO. Introducción a la genética forense. TÉCNICAS DE ANÁLISIS DEL ADN EN GENÉTICA FORENSE. 8. AUTOEVALUACION NUMERO DE LOGRO LA PRACTICA (Objetivos cumplidos) SI NO FORTALEZAS DEBILIDADES SUGERENCIAS A CADA DEBILIDAD