"Marcadores de inflamación bronquial en el diagnóstico y control evolutivo del asma ocupacional".

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1 "Marcadores de inflamación bronquial en el diagnóstico y control evolutivo del asma ocupacional". Joaquín Sastre Servicio de Alergia Madrid (España) Mayo 25 Clasificación de asma en el lugar de trabajo Asma laboral u ocupacional con periodo de latencia - forma clásica" de asma ocupacional con sensibilización a sustancias del alto o bajo peso molecular Asma ocupacional sin periodo de latencia (asma inducido por irritantes) - Exposición a tóxicos única (RADS = reactive airway dysfunction syndrome - Exposición moderada-alta a tóxicos: "Not-so-sudden onset irritant-induced asthma" Asma pre-existente exacerbada en el trabajo por exposición a niveles bajos de irritantes Síndromes variantes: bronqutis eosinofílica ocupacional, Asma-like disorders: exposición a endotoxinas vegetales, potroom asthma ( aluminio) Eur Respir J, 24 1

2 FISIOPATOLOGÍA DEL ASMA OCUPACIONAL Inflamación IgE-dependiente IgE específica a sustancias de alto peso molecular Alguna de bajo peso molecular se pueden unir a haptenos (proteínas o macromoléculas) para formar antígenos funcionales. Es el caso de sales de platino, anhídridos ácidos o sales de níquel y cromo, tintes,... FISIOPATOLOGÍA DEL ASMA OCUPACIONAL Inflamación linfocito T-dependiente En otros casos no se ha podido demostrar un mecanismo IgE, sin embargo, si parece existir una estimulación específica del sistema inmune, fundamentalmente de linfocitos. Clones de células T específicas se han demostrado para agentes de APM y para algunos de BPM en pacientes sensibilizados como isocianatos, ac.plicático, níquel, cobalto. Las células T pueden orquestar el proceso inflamatorio por sí solas. 2

3 Inflamación bronquial en AO Las biopsias bronquiales en los pacientes con AO muestran signos de inflamación bronquial, una descamación epitelial y una fibrosis subepitelial, con un engrosamiento aparente de la membrana basal y una hiperplasia del músculo liso bronquial. El recuento diferencial de las células inflamatorias muestra un aumento significativo en los recuentos de linfocitos, monocitos y macrófagos, eosinófilos, neutrófilos, mastocitos y células plasmáticas en los pacientes con AO respecto a los controles. No existen diferencias significativas en el número de células en las biopsias bronquiales al comparar los pacientes con AO causada por sustancias de peso molecular alto o bajo. (Am Rev Respir Dis 1992;145:16-168; 1995;151:34-344) Agentes de APM o BPM producen un proceso inflamatorio muy similar. El asma ocupacional sigue el dogma actual de inflamación en el asma 3

4 Esputo en Asma ocupacional Maestrelli y cols.realizaron un recuento celular en las muestras de esputo de forma basal y a las 8, 24 y 48 horas tras la PPBE con isocianatos. Observan un incremento significativo del recuento de eosinófilos en los sujetos con asma profesional por isocianatos ( a las 8 y 24 horas tras la PPBE) con respecto a los sujetos control. También se observó un aumento en la población de neutrófilos pero no fue significativo respecto a la población control. No se apreciaron cambios significativos en otros tipos celulares, macrófagos o linfocitos,. Clin Exp Allergy 1994; 24: Esputo en Asma ocupacional Lemiere y cols. demuestran un incremento significativo del recuento de eosinófilos (tanto en porcentaje como en valor absoluto) y de neutrófilos (en números absolutos, pero no en porcentaje) en un grupo de 17 pacientes con asma profesional y PPBE positivas. No se apreciaron cambios en ninguna población celular en sujetos con asma no profesional expuestos a agentes frecuentes (cianoacrilatos, harinas,...). 4

5 Esputo en Asma ocupacional Pudieron definir que un aumento en el número de eosinófilos mayor de.26x 1 6 /ml y una disminución en en la PC2 de metacolina de al menos 1,8-veces, comparado con las basales, es capaz de predecir una caída en el VEMS del 2% en el 96% (95% CI, 7%- 99%) de los pacientes. En aquellos en los que no hubo cambios en ninguno de los parámetros la posibilidad de una PPBE era del 4% (IC95%:.5-26%) y en los que sólo aumentaban los eosinófilos pero sin cambio clínicamente significativo en la PC2 la posibilidad era del 66% (IC95%:12-74%). Por lo tanto, ambos parámetros que miden indirectamente inflamación bronquial pueden predecir una respuesta bronquial significativa. J Allergy Clin Immunol. 2;16: Esputo en Asma ocupacional Annes y cols. estudian 38 trabajadores con asma ocupacional causado por sustancias de bajo peso molecular a los cuales se les realizó inducción de esputo y mediciones de función respiratoria (PEF) en condiciones de actividad laboral normal. Sólo 14 de los 38 pacientes tenían eosinofilia en esputo (>2.2%). Ambos grupos, eosinofílico y no eosinofílico mostraban neutrofilia en esputo (19.6% y 18.8%, respectivamente). (Thorax 22; 57: ) 5

6 Esputo en Asma ocupacional Park y cols. observan un incremento significativo en el recuento de neutrófilos y mastocitos y de IL-8 en el esputo inducido tras la PPBE con cereales. No apreciaron cambios en los niveles de eosinófilos activados ni de linfocitos. (Clin Exp Allergy 1998) Leigh R, Hargreave FE. Occupational neutrophilic asthma. Can Respir J 1999; 6: Esputo en Asma ocupacional También hay algunos estudios en los que no se demuestra aumento variaciones en el recuento celular del esputo tras provocaciones bronquiales en algunos pacientes, aun a pesar de aumentar la hiperreactividad bronquial (Clin Exp Allergy 1998; 28: Eur Respir J. 1999; 13: ) 6

7 Cambios en esputo inducido tras PBE P<.5 P< Eos % Neut % 2 15 Eos % Neut % Pre Post Pre Post HMW (n=36) LMW (n=23) RECEPCIÓN Y PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS ESPUTO Procesamiento Contaje celular total Viabilidad % Escamosas DTT,1% PI SANGRE (con EDTA) Sangre completa PBLs Purificación de eosinófilos Pellet de eosinófilos - Se desecha Citocentrifugación + Citometría de flujo SANGRE (sin EDTA) Sobrenadante Pellet de células Suero -8ºC Biología molecular 7

8 RESULTADOS CITOMETRÍA % Eosinófilos Valores de referencia Eosinófilos: 1-4 % SANGRE Bronquitis Eosinofílica (n=7) Asma Ocupacional (n=6) Asma Extrínseco (n=6) 35 3 ESPUTO % Eosinófilos Valores de referencia Eosinófilos:,4 ±,9 % Bronquitis Eosinofílica (n=7) Asma Ocupacional (n=5) Asma Extrínseco (n=5) 6 5 % Neutrófilos Porcentaje de Neutrófilos en esputo 1 Bronquitis Eosinofílica (n=7) Asma Ocupacional (n=5) Asma Extrínseco (n=5) Porcentaje de Macrófagos en esputo % Macrófagos Bronquitis Eosinofílica (n=6) Asma Ocupacional (n=5) Asma Extrínseco (n=5) 8

9 CITOMETRÍA,8,7 % Pre. Eosinofílicos,6,5,4,3,2 CD34+/CDw125+ SANGRE,1 Bronquitis Eosinofílica (n=5) Asma Ocupacional (n=5) Asma Extrínseco (n=5) ESPUTO % Pre. Eosinofílicos CD34+/CDw125+ Bronquitis Eosinofílica (n=7) Asma Ocupacional (n=5) Asma Extrínseco (n=3) CITOMETRÍA,25 CD63+/CDw123+ % Basófilos Act.,2,15,1,5 SANGRE Bronquitis Eosinofílica (n=6) Asma Ocupacional (n=4) Asma Extrínseco (n=5) 4 ESPUTO % Basófilos Act. 3,5 3 2,5 2 1,5 1,5 CD63+/CDw123+ Bronquitis Eosinofílica Asma Ocupacional (n=5) Asma Extrínseco (n=4) (n=6) 9

10 BIOLOGÍA MOLECULAR (resultados de pacientes positivos) RESULTADOS MUESTRAS EOSINÓFILOS DE SANGRE PERIFÉRICA IL-5 IL-1 IL-13 VEGF B. eosinofílica,58 +,29 (n=5) 1,4 +,48 (n=5),51 +,31(n=5) 1,1 +,37(n=8) A. ocupacional,53 +,22 (n=4),95 +,42 (n=4),54 +,15 (n=5) 1,43 +,5 (n=6) A. extrínseco,99 +,75 (n=3) 1,61 + 1,57 (n=2),49 +,28 (n=3) 1,23 +,67 (n=5) RESULTADOS MUESTRAS ESPUTO IL-5 IL-1 IL-13 VEGF B. eosinofílica,51+,25 (n=6) 1,2 +,56 (n=7),7 +,27 (n=7) 1,46 +,7 (n=8) A. ocupacional,43 +,22 (n=4),83 +,67 (n=5),74 +,81 (n=4) 1,3 +,76 (n=5) A. extrínseco,84 +,6 (n=3) 1,52 +,77 (n=5),65 +,4 (n=4) 1,54 +,53 (n=5) CASO CLÍNICO. PACIENTE POSITIVO A ESTIRENO Células en esputo BASAL POST-PROVOCATION - POS-PROVOCATION + % EOS NEU T CELLS MAC ACTIVATED BAS 1

11 Expresión de citoquinas por las células del esputo por RT-PCR IL-5 IL-1 IL-13 VEGF IL-2 IL-4 TGF- IFNmRNA Fold Induction 2,5 2 1,5 1,5 BASAL POST-PROVOCATION + Citoquinas solubles en sobrenadante de esputo IL-8 IL-1 TNFpg/ml BASAL POST-PROVOCATION 11

12 Esputo y Función pulmonar Lemiere y cols. no hallan correlación entre el recuento de eosinófilos y la caída de VEMS expresada como área bajo la curva o como caída máxima del VEMS, tras la respuesta asmática (J Allergy Clin Immunol. 2;16:1163-7) Pero en otro trabajo estos mismos autores observaron una correlación significativa entre la caída del VEMS tras la PPBE y los cambios del esputo inducido en los recuentos de eosinófilos (r=.5; p<.1) y de neutrófilos (r=.6;p<.1). (J Allergy Clin Immunol 21; 17: 163-8) Maestrelli y cols obtuvieron una correlación entre el recuento de eosinófilos en el esputo y la magnitud de la caída del VEMS durante la PPBE, expresada como área bajo la curva de la PPBE (r=.71; p=.14). En cambio, no encuentran correlación con la caída máxima del VEMS. (Clin Exp Allergy 1994; 24:29-34) Esputo y Función pulmonar Obata y cols. (24) hallan correlación negativa entre el porcentaje de caída del VEMS durante la PPBE y la variación en el recuento porcentual de eosinófilos en el esputo inducido a las 6 horas de la provocación con ácido plicático (Eur Respir J 1999; 13: ) Annes y cols. relacionan la eosinofilia en esputo (>2.2%) con un grado de asma profesional más severo y una mayor reversibilidad tras el tratamiento broncodilatador. En cambio, no encuentran relación entre la eosinofilia en esputo y los valores de PEF durante la exposición a los agentes ocupacionales en su medio laboral (Thorax 22; 57: ) 12

13 Esputo y Función pulmonar Lemiére y cols (26) observan una relación inversa entre los valores de PC 2 de metacolina, el recuento de eosinófilos y el nivel de proteína catiónica del eosinófilo en el esputo inducido. Sin embargo, los datos aportados por estos autores en cuanto a la correlación entre las variaciones de eosinófilos y neutrófilos y la hiperreactividad bronquial son bajos (r=-.4; p=.3 y r=-.4; p=.1; respectivamente)(j Allergy Clin Immunol 21; 17: 163-8) Di Franco y cols (27) estudian 24 pacientes con asma profesional. Observan una relación inversa significativa entre el porcentaje de eosinófilos en las muestras de esputo y la respuesta a la inhalación de salino hipertónico. No obstante, no encuentran relación entre el porcentaje de eosinófilos y la PD 2 metacolina (Respir Med 1998; 92: 55-7) Esputo y Función pulmonar Chan-Yeung y cols realizaron un estudio en 71 pacientes con asma ocupacional por cedro rojo utilizando varios parámetros como funcionales (espirometría), test de metacolina, óxido nítrico exhalado y esputo inducido. El porcentaje de eosinófilos en el esputo inducido mostró una una correlación inversa significativa con el VEMS (r = -.46, p <.1) y una correlación positiva significativa con los niveles de ONE (r =.42, p <.1) y con la clase de incapacidad (r =.52, p <.1). En este estudio se demuestra que el número de eosinófilos en esputo se correlaciona mejor que el ONE con el grado de incapacidad respiratoria medido fundamentalmente por parámetros funcionales, pero se observa también una clara tendencia al aumento de ONE según el grado de incapacidad. (Am J Respir Crit Care Med. 1999;159:1434-8) 13

14 Esputo inducido en el seguimiento del asma ocupacional. Lemiere y cols estudian el comportamiento de los eosinófilos en el esputo en 1 pacientes con asma ocupacional y sin asma ocupacional en periodo de trabajo y sin trabajar. Los pacientes con asma ocupacional tuvieron un incremento significativo en la media (intercuartil) de eosinófilos en el esputo y ECP cuando estaban trabajando comparado con los peridos sin trabajar,1. (17.5) frente a.8 (1.6)% (p=.7) y 3,84 (6,76) frente a 116 (18) microg x L(-1) (p=.1). (Eur Respir J. 1999; 13: ) Esputo inducido en el seguimiento del asma ocupacional. Girard y cols. estudian 49 pacientes con asma ocupacional y les realizan un seguimiento de pico-flujo y análisis de esputo inducido mientras estaban trabajando y durante una baja laboral. Encuentran que el añadir el análisis de esputo a la monitorización del pico flujo aumenta la especificidad de la prueba en 18 (rango [r] ) o 26.8% (r ) dependiendo si se elige el punto de corte en el incremento en porcentaje de eosinófilos en mas del 1% o 2% cuando estaban trabajando. (Am J Respir Crit Care Med. 24;17:845-5) 14

15 Esputo inducido en el seguimiento del asma ocupacional. Magnni y cols realizan un seguimiento de 133 pacientes con asma ocupacional durante una media de 8,7 años después de retirase de su puesto de trabajo. En 9/28 pacientes (32.1%) sin mejoría frente a 6/56 (1.7%) con mejoría parcial o curación tenían una eosinofilia en esputo igual o mayor del 2% y en 11/28 (39.3%) frente a 11/56 (19.6%) pacientes presentaban una neutrofilia en esputo mayor o igual del 61%. Los niveles en esputo de mieloperoxidasa ie IL-8 fueron significantemente mayores en el grupo que no mejoraron. Este estudio demuestra que los pacientes con asma ocupacional que no mejoran tras dejar la exposición tienen un claro componente de inflamación bronquial.(am J Respir Crit Care Med. 24;169:367-72) Esputo en otro tipo de patología respiratoria ocupacional En trabajadores de granjas de cerdos con síntomas respiratorios. El análisis del esputo de los pacientes en comparación con controles demostró un aumento significativo del número de macrófagos, mientras que no hubo diferencias en el número de neutrófilos. No se encontraron eosinófilos. De forma paralela encontraron un ligero aumento en los niveles de óxido nitrico exhalado en los pacientes con respecto a los controles. Estos resultados apoyan que en este tipo de patología hay una inflamación en las vías respiratorias mas periféricas y que es distinta a la encontrada en el asma o en la bronquitis crónica. (J Toxicol Clin Toxicol. 1998;36:557-65) 15

16 Conclusiones La proporción de eosinófilos en el esputo y de proteína catiónica del eosinófilo estan aumentadas en muchos pacientes con asma ocupacional inducido por sustancias de alto o bajo peso molecular, aunque en algún subgrupo de pacientes pueden predominar los neutrófilos. La monitorización de la celularidad del esputo puede suplementar el resultado de otras técnicas diagnósticas como el segumiento de pico flujo, la hiperreactividad bronquial a metacolina o la pruebas de provocación específica para establecer el diagnóstico de asma ocupacional La monitorización de los cambios celulares en esputo el también puede servir para monitorizar los cambios inflamatorios bronquiales que ocurren en sujetos con asma ocupacional tras cesar su exposición. BRONQUITIS EOSINOFÍLICA OCUPACIONAL - Entidad caracterizada clínicamente por tos, ausencia de broncoespasmo, test de metacolina negativo e inflamación bronquial eosinofílica. - Buena respuesta a esteroides inhalados - Se ha descrito por latex y lisozima (IgE mediada) y acrilatos - Fisiologíapatología: ausencia de mastocitos en la zona de musculo liso bronquial? - Se considera como una variante de asma ocupacional 16

17 Latex-induced eosinophilic bronchitis % Fall in FEV 1 % eosinophils in sputum Latex 99 ng/m 3 6 minutes bas min 1h 2h 4h 6h 8h 1h 24h Allergen challenge PC 2 methacholine > 16 mg/ml Quirce et al. JACI 21 PC 2 > 16 mg/ml OXIDO NÍTRICO EXHALADO EN ASMA OCUPACIONAL Pilipari y cols (4) han valorado los niveles de ONE en 4 pacientes con sospecha de asma ocupacional antes y después de la provocación bronquial específica. Encontraron un un aumento significativo en los nivels de ONE sólo en los pacientes en los que la provocación bronquial fue positiva con respuesta tardía y que además presentaban valores normales basales de ONE. En los pacientes con provocación positiva y con valores basales >14.5 ppb no encontró una elevación significativa. (Eur Respir J. 22 ;2:1532-7) 17

18 OXIDO NÍTRICO EXHALADO EN ASMA OCUPACIONAL Allmers y cols valoraron los cambios en ONE tras provocaciones bronquiales en pacientes son sospecha de asma ocupacional por isocianato de difenilmetano (MDI) y látex, así como tras provocaciones con metacolina. En 3/9 pacientes en los que se produjo una respuesta inmediata por MDI se produjo una elevación > de 1 ppm de ONE a las 22 horas. OXIDO NÍTRICO EXHALADO EN ASMA OCUPACIONAL Ocho de los 18 pacientes que fueron sometidos a la provocación con látex mostraron aumentos > 1 ppm de ONE tras la provocación. Pero en sólo 4 de estos 8 tuvieron una caída significativa del VEMS. En tres sujetos de los 19 en los que se realizó un test de metacolina y que además habían recibido un broncodilatador se observó una disminución de las concentraciones de ONE a las horas. (Int Arch Occup Environ Health. 2 ;73:181-6) 18

19 OXIDO NÍTRICO EXHALADO EN ASMA OCUPACIONAL Obata y colbs (24) no encontraron una relación entre los cambios en eosinófilos en el esputo, inducidos por la provocación bronquial con el ácido plicático del cedro rojo y las modificaciones de las concentraciones de ENO originadas por la misma. (Eur Respir J 1999; 13: ) OXIDO NÍTRICO EXHALADO EN ASMA OCUPACIONAL Adisesh y cols estudiaron los niveles de ONE y nasal en pacientes con sospecha de asma ocupacional relacionado con sensibilización a animales de laboratorio. Encontraron un aumento de ONE en aquellos sujetos con alergia a animales y que estaban sintomáticos ( media 17,97±1,24 ppb 1.24) comparado con los asintomáticos (6.8 ppb+/- 1.15, P <.5). Los pacientes sintomáticos también presentaban un aumento del ONE nasal con respecto a los asintomáticos (diferencia media de 378 ppb, P <.5). (Clin Exp Allergy. 1998;28:876-8) 19

20 OXIDO NÍTRICO EXHALADO EN ASMA OCUPACIONAL Baur y Barbinova han estudiado los valores de ONE tras provocaciones bronquiales con látex en pacientes sensibilizados y controles. El ENO aumentó una hora después de las provocaciones en pacientes y controles, pero sólo en los pacientes sensibilizados se produjo un aumento del ENO a las 22 horas de la provocación positiva con látex. No encontraron diferencias en el ENO basal o a las 22 horas en sujetos alérgicos al látex con asma o sólo con rinitis. La especificidad y sensibilidad de un incremento del 5% en el ENO a las 22 horas de una respuesta positiva fue del 1 y 56% respectivamente. OXIDO NÍTRICO EXHALADO EN ASMA OCUPACIONAL En este trabajo el aumento de ENO, aunque significativo, no presentaba grandes variaciones pasando de valores basales de,1 a,8 ppb de media basal a un máximo a las 22 horas en los pacientes con provocaciones positivas de 6,8±1,7. Los pacientes fumadores tenían menor ENO basal, pero en los fumadores y no fumadores con provocación al látex positiva se produce un aumento de ENO. Los corticoides inhalados hacen no aumentar el ENO durante las provocaciones pero no abolen la respuesta clínica a la provocación. (Eur Respir J. 25;25:39-16) 2

21 ONE en otro tipo de patología respiratoria ocupacional Se ha evaluado los niveles de ONE y nasal en trabajadores expuestos a cubas de electrolisis de aluminio ( potroom asthma). En los trabajadores no fumadores y expuestos a las cubas de electrolisis se obtuvieron concentraciones de ONE mayores que en los sujetos no expuestos 9.3 ( ) vs 5.7 ( ) ppb, p=.1). Los dos grupos no diferían en valores espirométricos y en síntomas asmáticos. Los trabajadores expuestos no fumadores con síntomas de asma tenían concentraciones de ONE mas altas que los que no tenían síntomas ( media e intercuartil): 21. ( ) v 8.5 ( ) ppb, p=.1) pero tenían valores espirométricos comparables. ONE en otro tipo de patología respiratoria ocupacional En los pacientes fumadores no se encontró diferencia entre expustos y controles (media y rango intercuartil: 4.6 (3.3-8.) v 4. ( ) ppb. El ONE no se asoció de forma significativa con la duración del empleo o los niveles de fluoruros o polvo inhalado. El ONE podría ser un marcador temprano de afectación, en sujetos no fumadores, expuestos a cubas de electrolisis de aluminio. (Occup Environ Med. 2 ;57:274-8) 21

22 ONE en otro tipo de patología respiratoria ocupacional Olin y cols estudian los cambios en ONE en sujetos expuestos a ozono en varias factorías de blanqueado de pasta de madera. Los trabajadores expuestos a mas altas concentraciones de ozono mostraron un aumento en los síntomas respiratorios y tenían una media mas alta en ONE en comparación con el grupo de trabajadores menos expuesto al ozono (19.2 frente a 15.7 ppb). (Eur Respir J. 24;23:87-92) Conclusiones A la vista de los resultados de los diferentes estudios analizados, no puede aventurarse una opinión definitiva acerca de la relación entre las concentraciones de ENO y las provocaciones específicas con agentes ocupacionales, por lo que el valor diagnóstico de esta prueba, en la actualidad, es limitada. Tampoco hay experiencia en el seguimiento del asma ocupacional. Sin embargo, parece que el análisis de esputo inducido aporta una evidencia mas objetiva de inflamación bronquial y el grado de afectación respiratoria en estos pacientes. 22

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