Dpto. Parasitología y Micología CEFA

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Ricardo Flores Pereyra
hace 6 años
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1 Dpto. Parasitología y Micología CEFA

2 En medicina general: grupo de pruebas diseñadas para la detección de anticuerpos específicos (Acs dirigidos contra una Ag conocido), reacciones de hipersensibilidad, producción de linfoquinas, entre otras, en respuesta a diversas patologías. En parasitología clínica: cualquier técnica que se utilice para la detección de Acs específicos contra parásitos y hongos, constituyendo el diagnóstico serológico.

3 SEROLOGÍA La detección de anticuerpos circulantes específicos se realiza en el Suero del Paciente. Númerosas técnicas de laboratorio se han implementado para realizar pruebas serológicas. En la Práctica Clínica el estudio se solicitica como Serología para citomegalvirus, toxoplasmosis, leptosprosis,.etc.

4 Identificar problemas de salud. Determinación de la distribución de una enfermedad. Determinar la incidencia y la prevalencia de una enfermedad. Medición de la inmunidad materna específica. Calendarios de vacunación. Evaluación de programas y/o campañas de vacunación.

5 Diagnostico etiológico. Establecer diagnósticos diferenciales entre diferentes patologías infecciosas : parasitarias, fúngicas, bacterianas. Elección de la mejor conducta terapéutica. Estimar reactividad. Establecer políticas sanitarias de prevención. Estudios epidemiológicos.

6 UTILIDAD EN PARASITOLOGÍA y MICOLOGÍA Las técnicas serológicas son útiles y prácticas en las parasitosis hemotesiduales y en las micosis profundas. La propiedad de unión de las Igs a un Ag, que dicga unión sea específica y que pueda ser visualizable, hacen que sean las más utilizadas

8 Agente Mecanismo de transmisión Epidemiología Mecanismos inmunológicos Métodos de estudio La buena práctica médica requiere de interconsultas.

9 Los parásitos son mosaicos antigénicos, siendo un estímulo poderoso para el sistema inmunológico del hospedero. ANTÍGENOS PARASITARIOS Somáticos o estructurales: superficie, citoplasmáticos Metabólicos: productos de la actividad fisiológica, Ags de secreción-excreción. proteínas, glicoproteínas, polisacáridos, lipídos.

10 I. SEROCONVERSIÓN El aumento del título o concentración de anticuerpos cuatro veces o más, observado en dos muestras separadas por un intervalo de tiempo de 15 a 21 días. Pasaje de no reactivo a reactivo.

11 II. SENSIBILIDAD: expresa la capacidad de la técnica para detectar la menor concentración de Acs buscados. III. ESPECIFICIDAD: expresa la capacidad de la técnica para diferenciar los Acs específicos de otros presentes en el suero problema. IV. REACTIVIDAD CRUZADA: Acs diferentes al que se busca, y que reaccionan con los Ags, cuando comparten epítopes idénticos o muy similares.

12 CUALITATIVOS: reactivo o no reactivo CUANTITATIVOS: miden la concentración de Acs a estudiar. - TÍTULO: máxima dilución del suero problema que arroja un resultado positivo ( Ej: 1/1024 ) - UNIDADES PREDETERMINADAS: el valor obtenido de la concentración de Acs se compara con un patrón preestablecido de densidad óptica, fluorescencia, luminiscencia, que llamamos punto de corte, el cual permite diferenciar los positivos de los negativos. El valor se expresa en UI/ml, etc. TAMIZAJE: Son utilizadas para estudio de grandes poblaciones. CONFIRMATORIAS: Para establecer el diagnóstico de forma específica.

13 Información Solicitud Obtenciónde la muestra : 6 hrs de ayuno, extracción de sangre venosa, tubo seco sin anticoagulante,.) Transporte (separada, refrigerada ) Conservación (4ºC, -20ºC)

15 TÉCNICAS Floculación Aglutinación Precipitación Fluorescencia Inmunoenzimoanálisis Radioinmunoanálisis Otras

16 Técnicas de aglutinación: Cuando el Ag se encuentra unido o formando parte de células, parásitos o partículas, la reacción Ag-Ac se puede detectar y cuantificar por el aglutinado formado. Técnicas de fluorescencia: Para la realización de estas técnicas el anticuerpo se marca con un fluorocromo, detectándose la formación del complejo Ag-Ac por la fluorescencia emitida. Inmunoprecipitación e inmunoblotting: Permite detectar la presencia y cantidad de antígenos y anticuerpos específicos.

17 Sencillas. Dependen de la fijación inicial de antígenos específicos sobre eritrocitos o partículas. Luego se incuban con el suero y las partículas aglutinan si el Ac se encuentra presente. Detectan Acs totales de tipo IgG e IgM. En general deben ser confirmadas por medio de otras, debido a que puede haber reacciones inespecíficas.

18 En estas técnicas se hacen visibles los complejos Ag-Ac por la aglutinación que producen los Acs cuando el Ag forma parte o se ha unido artificialmente a la superficie de glóbulos rojos, plaquetas, leucocitos, partículas de látex, etc. Normalmente se utilizan glóbulos rojos (hemaglutinación) o partículas de látex.

19 Aglutinación directa Y Y Y Y Suspensiones de parásitos enteros son enfrentadas a sueros de pacientes. Los Ac (Y) presentes aglutinan los parásitos, formando acúmulos consistentes. Y Aglutinación de partículas Y Y Y Y Y Y látex, carbón, etc Suspensiones de partículas inertes, con su superficie cubiertas de Ag parasitarios, son enfrentadas a sueros de pacientes. Los Ac presentes aglutinan estas partículas, formando acúmulos. Y

20 Positivo Negativo

22 - +

23 Para la realización de estas técnicas se requiere que tanto el Ac como el Ag se encuentren en un medio adecuado en el que sea posible la precipitación de los inmunocomplejos. Existen diferentes modalidades: - Técnica de precipitación en gel o difusión simple. - Técnica de difusión radial de Ouchterlony. - Técnica de inmunoelectroforesis. - Otras.

24 TÉCNICAS DE PRECIPITACIÓN

29 Es una técnica que se realiza en dos fases. Primero se separa la mezcla de Ags por electroforesis y posteriormente el Ag que se desea detectar se hace reaccionar con un Ac específico colocado en un pocillo lateral. Por difusión llegan a encontrarse los Ags y el antisuero, apareciendo el complejo Ag-Ac visible en forma de líneas de precipitación que pueden ser estudiadas por comparación con un sistema estándar 3.

30 INMUNOELECTROFORESIS (IEF) Separación de moléculas por campo eléctrico

31 La identificación de Acs en una muestra de suero problema, se realiza en fase sólida, para ello el Ag se encuentra fijo a un soporte (placa de plástico). El marcado de la reacción se hace mediante el empleo anti-igs marcadas con una enzima (peroxidasa) lo que se conoce con el nombre de conjugado.

32 Los anticuerpos conjugados suelen ser monoclonales o anti-igs especificas. Se les llama sistemas competitivos. Se establece competencia por los sitos de unión disponibles entre el reactivo conocido, (Ag) añadido al ensayo a concentración limitada, y el elemento a investigar Ac.

La identificación de Acs en una muestra de suero problema, se realiza en fase sólida, para ello el Ag se encuentra fijo a un soporte (placa de plástico).

33 La identificación de Acs en una muestra de suero problema, se realiza en fase sólida, para ello el Ag se encuentra fijo a un soporte (placa de plástico). El marcado de la reacción para que sea visible y detectable, se hace mediante el empleo anti-igs marcada con una enzima (peroxidasa) lo que se conoce con el nombre de conjugado. 1 2 lavado Ag en pocillo lavado Ac específico en muestra 4 3 lavado enzima conjugada (E) Sustrato (S)

34 Enzimáticos Fluorescentes (Fluoroinmunoensayo) Ligandos (biotina, Avidina) Luminiscentes (Luminoinmunoensayo) Espectrofotometría Fluorescencia Quimioluminiscencia Electro-química

35 CUANTITATIVO 1 1/2 1/4 1/16 1/32 1/64 1/128 BUFFER 1/8

36 DILUCIÓN 1

37 RESULTADO 1 1/2 + 1/4 + 1/8 + 1/16 1/32 1/64 1/

38 AUTOMATIZACIÓN Existen equipos electrónicos, que permiten la automatización de los procedimientos y el análisis computacional de los resultados. La lectura y medida de la [ Acs-Ag ] se hace mediante colorímetros, fluorómetros, fotómetros, etc., Facilitando la padronización y reproducibilidad de las técnicas, mayor precisión y registro de resultados, mejor cuantificación y valoración de los mismos. Disminuye los errores y permite un mejor control de calidad.

39 Cono fase sólida y pipeteo Tira Buffer lavado Substrato 45 0 nm Muestra Diluyente Conjugado REACCION INMUNOLOGICA nm 0 photodiodo 7 3 REACCION ENZIMATICA

40 INMUNOFLUORESCENCIA (I.F.I)

42 Se basa en la unión de Acs presentes en el suero, a los Ags parasitarios de membrana, que han sido fijados a un portaobjeto de vidrio. Se incuba el suero del paciente con el Ag. Lavado con PBS. Posteriormente se agrega un Ac anti IgG conjugada con isotiocianato de fluoresceína. Esta sustancia se vuelve fluorescente al ser expuesta a la luz ultravioleta, emitiendo una luz verde. Fluorescencia en el citoplasma del parásito. o IgM humana

43 Toxoplasma gondii Trypanosoma cuzi Echinococcus granulosus

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