EFECTO ANTIMICROBIANO DE EXTRACTOS HEXÁNICO Y METANÓLICO DE CEPAS HÍBRIDAS DE Pleurotus spp.

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1 EFECTO ANTIMICROBIANO DE EXTRACTOS HEXÁNICO Y METANÓLICO DE CEPAS HÍBRIDAS DE Pleurotus spp. Resumen. La producción de hongos comestibles del género Pleurotus (setas) ha tenido un auge importante en México a partir de los años 70's del siglo XX, debido a las propiedades nutricionales de este macromiceto y a que los requerimientos de infraestructura para su producción no son tan costosos como para el champiñón. Así mismo, Pleurotus es un macromiceto que consume material lignocelulósico que no puede ser degradado por otros seres vivos, por lo que el cultivo de setas representa un proceso importante de reciclaje de desechos vegetales. En los últimos años se han descubierto propiedades medicinales en varios hongos comestibles, entre los que se encuentra el género Pleurotus, por lo que en este trabajo evaluaron las propiedades antibacterianas de extractos crudos de los cuerpos fructíferos o carpóoros de las setas, con la finalidad de valorar la producción de setas a partir de cepas híbridas de Pleurotus como una fuente de obtención de biofármacos. Se produjeron cepas híbridas de setas y se determinó el halo de inhibición de los extractos tanto metanólicos como hexánicos de las mismas. Introducción Los hongos superiores o macromicetos ( musrhooms, en inglés) son definidos como macrohongos con cuerpos fructíferos distintivos los cuales pueden ser epigeos o hipogeos, los suficientemente grandes para ser detectados a simple vista y ser cosechados manualmente (Chang y Miles, 1992). El uso medicinal de los hongos superiores tiene una gran tradición en las ciudades Asiáticas, mientras que la utilización farmacológica en el hemisferio Occidental se ha incrementado significativamente a partir de las últimas décadas. Así, el valor comercial de los macromicetos medicinales y sus derivados en Estados Unidos fue de 1.2 billones de dólares en 1991 y para le año de 1999 se estimó en 6 billones de dólares. Desde el punto de vista taxonómico los basidiomicetos forman parte de los hongos superiores, y el número de especies de macromicetos sobre la tierra se estima en 140,000 de los cuales únicamente el 10% es conocido. Asumiendo que la proporción de hongos útiles será de únicamente 5% (Hawksworth, 2001). Aún así, entre las especies conocidas la cantidad de los hongos superiores investigados es relativamente baja, por lo que este hecho, aunado al conocimiento del gran potencial de los micromicetos para la producción de metabolitos bioactivos, la experiencia en el uso etnomedicinal de los hongos superiores, la necesidad ecológica de los hongos para producir metabolitos secundarios bioactivos y el mejoramiento de posibilidades genéticas, farmacológicas y de análisis químico, permite asumir también que los macromicetos tiene un gran potencial en la producción de biofármacos. Los hongos necesitan compuestos antibacterianos y antifúngicos para sobrevivir en su ambiente natural. Por lo que no debe sorprender que se puedan aislar compuestos antimicrobianos útiles para el hombre a partir de los macromicetos. De interés especial son los compuestos con actividad contra cepas bacterianas multiresistentes, así se pueden encontrar hidroquinonas serquiterpenoides, llamadas ganomicinas, aisladas de especies europeas de Ganoderma, que inhiben el crecimiento de la bacteria Staphylococcus aureus

2 resistente a la metilcilina, así como, el de otras bacterias patógenas al hombre (Lindequist, et al., 1990; 2005; Monthana, et al., 2000). Para la obtención de productos con interés farmacológico generalmente se utilizan extractos de cuerpos fructíferos completos, partes de ellos, micelio obtenido en cultivo líquido o sustancias asiladas directamente de ambos. El material biológico se obtiene de colecciones de hongos silvestres, cultivados o por cultivo de micelio en fermentadores con sustratos sólidos o líquidos y los extractos son preparados por contacto con solventes adecuados por medio de maceración o destilación de los carpóforos secos, frescos o del micelio. Los compuestos puros se obtienen por aislamiento y purificación de los extractos de los solventes utilizados y en algunos casos se realiza semisíntesis partiendo de los compuestos puros obtenidos. Frecuentemente los compuestos naturales sirven para la preparación de una gran variedad de derivados. Actualmente entre el 80 y 85 % de todos los productos medicinales de los hongos son derivados de los cuerpos fructíferos, los cuales han sido producidos comercialmente o colectados de hongos silvestres, como ejemplo se tiene el compuesto denominado lentinan obtenido de G. lucidium. Únicamente el 15% de todos los productos están basados sobres extractos obtenidos a partir de micelio obtenido en medio líquido (Lindequist, et al., 2005). Los hongos tienen un gran potencial para la producción de metabolitos bioactivos útiles y son una fuente prolífica de drogas. Los compuestos bioactivos responsables pertenecen a varios grupos químicos, generalmente ellos son polisaráridos o triterpenos. Una especie puede poseer una alta variedad de compuestos bioactivos con diferentes efectos farmacológicos. El mejor ejemplo es la especie G. lucidum, la cual contiene más de 120 triterpenos, así como, polisacáridos, proteínas y otros compuestos bioactivos (Zhou y Gao, 2002; Kim y Kim, 1999). El espectro detectado de actividades farmacológicas de los hongos superiores es muy amplio. Dentro de los macromicetos reportados como productores de metabolitos, los basidiomicetos constituyen una clase de hongos que está representada por más de especies. (Anke 1989). Los basidiomicetos producen una amplia gama de productos naturales que abarca desde componentes estructurales con actividad antitumoral e inmunológicamente activos hasta agentes antimicrobianos, antifúngicos, antivirales, citostáticos, así como, enzimas y reguladores de crecimiento. El metabolismo secundario de los basidiomicetos es rico en terpenoides, especialmente sesquiterpenoides, muchos de los cuales poseen estructuras que hasta ahora sólo han sido detectadas en ésta clase de organismos, mientras que otras están estrechamente vinculadas a los metabolitos de las plantas (Harttig, 1990). Los cuerpos fructíferos de algunas especies del género Lactarius son considerados no comestibles debido a su sabor acre y picante; este sabor esta determinado por la presencia en ellos de aldehídos sesquiterpénicos con marasmanos y lactaranos en su esqueleto, que se forman enzimáticamente a partir de ácidos grasos (Anke, 1989, Daniewski, 1996), estos aldehídos insaturados poseen alta actividad antimicrobiana y mutagénica. En los cuerpos fructíferos de la especie Lactarius flavidulus se aisló un compuesto con actividad antimicrobiana, al que se le dio el nombre de flavidulol (Takahashi, 1998). El compuesto denominado merulidial, aislado de cultivos sumergidos de Merulius tremellosus, posee fuerte actividad antifúngica, mutagénica y citotóxica (Sterner, 1990), es un aldehído sesquiterpénico que en forma cristalina inhibe la síntesis del DNA en

3 células ECA (Células de carcinoma asiático de Ehrlich). El hynophilin, el pleurotelol y el ácido pleurotélico son compuestos aislados de la fermentación del basidiomiceto Pleurotellus hypnophilus. Mientras que el pleurotelol y el ácido plerotélico pertenecen al grupo de los sesquiterpenoides, el hynophilin es un nuevo miembro de la familia de los hirsutazos, a la cual pertenecen un gran número de los típicos metabolitos presentes en basidiomicetos. Estos tres antibióticos poseen alta actividad antimicrobiana y citotóxica (Anke, 1989). Dentro de los compuestos bioactivos en hongos superiores, los poliacetilenos son el grupo más ampliamente estudiado, ya que se han sido aislados más de 50 de estos compuestos insaturados, con actividad antibiótica, a partir de los géneros Clitocybe, Coprinus, Cortinellus, Daedalea, Marasmius, Merulius, Pleurotus, Polyporus, Poria, entre otros (Anke 1989). Como ejemplo, se tiene el antibiótico escorodinin, obtenido de cultivos de la especie Marasmius scorodonius, dicho compuesto posee actividad antimicrobiana y una alta actividad antifúngica y citotóxica (Simon 1995). Muchos otros metabolitos con actividad antibiótica son obtenidos a partir de basidiomicetos que incluyen compuestos fenólicos, ácidos fenilglicoxídicos sustituidos, purinas, quinonas, derivados terpénicos, etc. (Benedict 1972). El agaridin, compuesto bioactivo aislado de cuerpos fructíferos de Agaricus xanthodermus, presenta actividad antimicrobiana frente a bacterias tanto Gram positivas como Gram negativas y es el primer compuesto diazonio aislado en basidiomicetos (Dornberger 1989). Con respecto a los hongos superiores degradadores de material lignocelulósico, se ha reportado actividad antibacteriana para el género Lentinula (Hassegawa, et al., 2005; Ishikawa, et al., 2001.) Se han realizado estudios sobre otras propiedades medicinales de estos macromicetos, tales como, actividad antitumoral y efectos inmunomodulatorios (Zhuang, et al., 1993; Zhang, et al., 1994: 2001; Wang et al., 2000; Wasser, 2002; Wang, et al., 2005), efecto hipoglucémico de extractos acuosos de P. pulmonarius (Badole, et al., 2006; 2007), efecto antiatherogénico de P. ostreatus en ratas y conejos, reduciendo la incidencia del tamaño de placas arterioscleróticas en conejos (Bobek y Galbavy, 1999), entre otras. Anke, 1989 y Brizuela, et al., 1998, reportan que los hongos del género Pleurotus presentan actividad antimicrobiana, mencionando incluso que se debe a compuestos de tipo acetileno. En realidad se tienen pocos antecedentes sobre la actividad antibacteriana de las cepas de hongos del género Pleurotus, es por ello que el interés de este trabajo fue evaluar la actividad antibacteriana de extractos hexánicos de los cuerpos fructíferos de cepas de Pleurotus spp. Materiales y Métodos 1.- Material biológico Se utilizaron 6 cepas de Pleurotus spp., tres parentales; POS, SEC y UAP9, y tres cepas híbridas. UBPO (UAP9 1 xpos 1 ), SAUA (SEC 1 xuap9 1 ) y SAUB (SEC 1 xuap9 2 ). Todas las cepas se encuentran depositadas en el cepario del Laboratorio de Cultivos Celulares de la UPIBI, IPN. El medio de cultivo utilizado para mantener las cepas y hacer las pruebas de compatibilidad fue extracto de malta agar (EMA). Para la determinación de la actividad antibacteriana se utilizaron las cepas de bacterias Gram positivas (Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus ATCC 12398) y bacterias Gram

4 negativas (Enterobacter agglomerans ATCC 27155, Shigella dysenteriae INDRE B2188, Yersinia enterocolitica, Klebsiella rhinoescleromatis y Klebsiella pneumoniae ATCC 13884, las bacterias en la que no se indicó número de colección fueron donadas por el laboratorio de Microbiología de las FES-Cuautitlán, UNAM. Todas la cepa bacterianas se encuentran depositadas en el laboratorio L-514 de la Facultad de Estudios Superiores Iztacala, UNAM. 2.- Obtención de cuerpos fructíferos El utilizó como sustrato paja de trigo picada en trozos de 5 cm de longitud aproximadamente, la cual fue humedecida a saturación y posteriormente se pasteurizó con vapor a 98º C por 3 horas. Una vez que el sustrato pasteurizado se enfrió temperatura ambiente, se procedió a la inoculación de la paja con el inóculo-grano, para ello se colocaron paja e inóculo alternativamente en bolsas bolsa de plástico hasta completar un peso total por bolsa de 1 kg, se utilizaron aproximadamente 5 g inóculo por 100 g de sustrato húmedo y se realizarán 10 repeticiones por cada cepa. Las bolsas ya inoculadas, fueron introducidas en el cuarto de incubación a una temperatura de 28ºC, sin iluminación, para lograr la propagación vegetativa del micelio en el sustrato hasta la invasión total. Después de aproximadamente 15 días de haber inoculado el sustrato, se eliminaron las bolsas de plástico trasladando las pacas formadas al cuarto de fructificación en donde las condiciones ambientales fueron: temperatura 15 a 28º C, humedad relativa entre 90 y 95% con un fotoperíodo de iluminación de 12 h/día y una ventilación continúa para mantener la concentración de CO 2 por debajo de los niveles inhibitorios de la fructificación. La cosecha se realizó antes de que los esporóforos alcanzaran su máximo desarrollo. 3.- Obtención de los extractos orgánicos de los cuerpos fructíferos. Los carpóforos obtenidos fueron cortados y deshidratados a temperatura ambiente. La obtención de los extractos hexánicos se llevó a cabo por reflujo durante un tiempo 24 horas en equipo Soxleth. Los extractos obtenidos se concentraron a sequedad bajo presión reducida en el rotavapor, se conservaron a -4 C hasta su uso en la prueba microbiológica. Posteriormente, el residuo seco del hongo se llevó de nuevo a reflujo con metanol por 24 horas, se concentró a sequedad bajo presión reducida en el rotavapor y se conservó a -4 C hasta su uso en la prueba microbiológica. 4.- Evaluación de la actividad antibacteriana Se prepararon dos medios de cultivo: Muller-Hilton (MH) y Agar Nutritivo (AN) los que se esterilizaron a 121 ºC y 15 lb de presión por 20 minutos, para ser posteriormente colocados en cajas Petri. Posteriormente las cajas fueron inoculadas con las cepas de las bacterias correspondientes. Paralelamente se prepararon tubos de ensayo con la escala de Mc Farland, utilizando H 2 SO 4 al 1% y BaCl 2 al 1%, de tal forma que en el tubo 0.5 de la escala tuviera una turbidez equivalente a una concentración de 1.5 x 10 8 UFC/mL, dicho tubo sirvió de base para la inoculación de la concentración indicada de cada una de las bacterias a utilizadas. También se realizó la preparación de sensidiscos (6 mm de diámetro), con los extractos hexánicos y metabólicos a una concertación de 400 mg/ml, como control negativo se utilizaron hexano y metanol, como control positivo sensidiscos comerciales de cloranfenicol (30 µg). Una vez colocados los sensidiscos sobre la caja Petri recién inoculada con las bacterias respectivas, éstas se incubarón a 35 ºC por 24 horas y posteriormente se determinó el diámetro del halo de inhibición generado con los extractos

5 orgánicos de las diferentes cepas de Pleurotus. Cada ensayo se realizó por quintuplicado y se aplicaron las pruebas de ANOVA de uno y dos factores para detectar diferencias entre los halos obtenidos por los extractos de las cepas de Pleurotus utilizadas, así como, entre el efecto inhibitorio provocado en las bacterias utilizadas. Para identificar entre que extractos hexánicos y/o bacterias se presentaron las diferencias se utilizó la prueba de rango múltiple de Duncan. Resultados y Discusión En la tabla 1 se muestran los halos de inhibición generados por los extractos hexánicos de los carpóforos de las seis cepas de Pleurotus trabajadas. Los extractos hexánicos de las cepas parentales POS, SEC y UAP9, presentaron halos de inhibición en 7 de las cepas bacterianas utilizadas, teniendo un efecto tóxico tanto en bacterias Gram postivas como Gram negativas. Mostrado las cepas POS y SEC mayores efectos antibacterianos para las Gram positivas B. subtilis y S. aureus, y para la cepa UAP9 además de presentar un mayor halo de inhibición para S. aureus, también lo hizo para las cepa Gram negativas E. agglomerans, Y. enterocolitica y S. dysenteriae. Con respecto a las cepa híbridas, el extracto hexánico de la cepa UBPO fue el que presentó halos de inhibición para las 8 bacterias trabajadas, aunque los tres extractos hexánicos de las cepas híbridas UBPO (UAP9 1 xpos 1 ), SAUA (SEC 1 xuap9 1 ) y SAUB (SEC 1 xuap9 2 ) presentaron inhibición del crecimiento para las bacterias tanto Gram positivo como Gram negativo, se obtuvieron mayores halos de inhibición para la bacteria Gram positiva S. aureus. Es importante indicar que extracto hexánico de la cepa SAUB únicamente presentó efecto tóxico en 5 de las 8 bacterias trabajadas. El ANOVA de dos factores indicó diferencias estadísticas significativas para el factor hongo (F (144,5) = , p<0.0001), formándose cuatro grupos que son: con el mayor halo de inhibición la cepa SAUA, el segundo grupo con la cepa UBPO, en el tercer grupo se ubican las tres cepas parentales POS, SEC y UAP9 y en el último el grupo la cepa SAUB. Tabla 1. Diámetros de los halos de inhibición presentados por las bacterias en contacto con los extractos hexánicos de cepas híbridas y parentales. Bacteria Halo de inhibición 1 (mm) POS SEC UAP9 UBPO SAUA SAUB CLORAN E. agglomerans 15.3±0.8 b 10.7±0.7 a 17.6±0.8 c 19.6±0.8 b 21.3±0.6 b 14.1±0.7 b 43.6±0.3 B. subtilis 12.0±1.0 a 18.0±1.5 c 14.0±1.5 b 118.6±0.6 b 23.3±0.8 b ±0.8 S. aureus(1) 24.3±2.1 c 11.3±0.3 a 19.0±1.5 c 25.3±0.3 c 14.6±0.8 a 9.0±0.5 a 29.6±0.3 S. aureus(2) 9.6±0.3 a 18.3±0.6 c 11.0±1.5 a 9.3±0.8 a 28.0±2.3 c 13.0±1.5 b 26.0±0.5 Y. enterocolitica 18.3±0.6 b 18.3±1.2 c 19.0±1.0 c 24.6±0.8 c 26.3±2.0 c 13.0±0.1 b 31.0±0.5 K. pneumoniae 13.6±2.4 a ±0.5 a 10.6±0.8 a ±0.0 K. rhinoescleromatis ±0.5 d - 9.0±0.5 a 22.5±0.8 b ±0.8 S. dysenteriae 16.6±0.8 b 15.3±0.3 b 18.6±0.8 c 20.0±0.3 b 16.6±0.3 a 10.0±0.1 a 21.3±0.3 1 Promedio de cinco repeticiones ± el error estándar de la media (ESM). Las letras diferentes indican diferencias estadísticas significativas (Duncan, p<0.05) para cada una de las cepas de Pleurotus independientemente. Asimismo, con el factor bacteria se presentaron diferencias significativas (F (144,7) = , p<0.0001), y con la prueba de Duncan se formaron 5 grupos, la bacteria que presentó los

6 mayores halos de inhibición fue Y. entrerocolítica y las que presentaron menor halo de inhibición fueron B. subtilis, S. aureus2 y K. pneumonae. En la tabla 2 se muestra el diámetro del halo de inhibición para cada una de las cepas bacterianas trabajadas con los extractos metanólicos de los carpóforos de Pleurotus spp. Dichos extractos de las cepas parentales y de las cepas híbridas provocaron halos de inhibición en algunas de las bacterias utilizadas, de la misma forma que para los extractos hexánicos, en los metanólicos los mayores halos de inhibición fueron en la bacteria Gram positiva S. aureus, particularmente en la cepa UAP9 no hubo diferencias estadísticas significativas en halos generados por los extractos metanólicos de esta cepa sobre las bacterias E. agglomerans, S. aureus(1), S. aureus(2) y S. dysenteriae. Tabla 2. Diámetros de los halos de inhibición presentados por las bacterias en contacto con los extractos metanólicos de cepas híbridas y parentales. Bacteria Halo de inhibición 1 (mm) SEC UAP9 UBPO SAUA SAUB CLORAN E. agglomerans ± ±0.5 a 13.4±0.1 b 43.6±0.3 B. subtilis ±0.8 S. aureus(1) 37.3±3.9 c 11.9± ±3.8 b 40.0±2.8 b 35.0±1.5 c 29.6±0.3 S. aureus(2) 21.6±1.4 a 11.7± ±0.6 a 10.0±0.1 a 9.3±1.8 a 26.0±0.5 Y. enterocolitica ±0.5 K. pneumoniae ±0.0 K. rhinoescleromatis ±0.8 S. dysenteriae 10.0±0.1 b 7.6± ±0.6 a ±0.3 1 Promedio de cinco repeticiones ± el error estándar de la media (ESM). Las letras diferentes indican diferencias estadísticas significativas (Duncan, p<0.05) para cada una de las cepas de Pleurotus independientemente. El ANOVA de dos factores indicó diferencias estadísticas significativas para el factor hongo (F (75,4) =8.613, p<0.0001) y el factor bacteria (F (75,4) =338.76, p<0.0001), para el caso de las cepas de Pleurotus trabajadas, se encontró que el extracto metanólico de los cuerpos fructíferos de la cepa SEC provocó el mayor efecto inhibitorio del crecimiento bacteriano de las cepas Gram positivas y negativas utilizadas en este estudio. Así mismo, se determinó que la bacteria que fue mayormente afectada por los extractos metanólicos utilizados fue S. aureus1 y las que presentaron menor halo de inhibición fueron las bacterias E. agglomerans y S. dysenteriae. Los componentes de los extractos hexánicos, debido a su carácter no polar, por lo general son lípídos, se ha reportado la composición de ácidos grasos de los lípidos de las especies de Pleurotus, indicando la presencia principalmente de ácido linoléico y oleico en porcentajes que van del 33-68% y 43-46%, respectivamente (Dimou, et al., 2002, Kavishree, et al., 2008), así mismo, se ha informado que los ácidos grasos insaturados poseen un amplio espectro de propiedades biológica tanto en animales como en plantas y que el ácido linoléico y el oleico desarrollaron actividad antibacteriana sobres bacterias Gram positivas, también se ha reportado un efecto sinérgico entre ambos ácidos en la inhibición del crecimiento de S. aureus (Dilika, et al., 2000).

7 Por otro lado los flavonoides han sido reconocidos como metabolitos secundarios responsables de la actividad antibacteriana de extractos de los basidiomicetos comestibles Lactarius deliciosus, Sarcodon imbricatus and Tricholoma portentosum (Barros et al., 2007), también los terpenoides aislados de hongos han sido implicados como el fitoconstituyente responsable de su actividad antibacteriana (Iacobellis et al., 2005; Iwalokun et al., 2007), así como los sesquiterpenoides guaiana aislados de los cuerpos fructíferos del género Lactarius (Anke et al., 1989). Como nuevos trabajos a desarrollar a partir de los resultados obtenidos hasta el momento será necesario determinar la concentración mínima inhibitoria para tener la certeza de que existe un mayor efecto tóxico de los componentes que se encuentran presentes en los extractos de ambas cepas, así como la elucidación de los compuestos químicos presentes en ambos extractos. Conclusiones Se obtuvieron los neohaplontes de las cepas parentales POS, SEC y UAP9, y a partir de ellos se generaron las cepas híbridas de Pleurotus spp. UBPO (UAP9 1 xpos 1 ), SAUA (SEC 1 xuap9 1 ) y SAUB (SEC 1 xuap9 2 ), las cuales al ser cultivadas en el sustrato paja produjeron cuerpos fructíferos, con los cuales fue posible obtener extractos hexánicos y metanólicos con actividad antibacteriana. Por lo que los extractos obtenidos representan un material valioso para la obtención de compuestos con actividad farmacológica. Impacto La obtención de cepas híbridas de (Pleurotus spp.) tiene importancia fundamental debido al auge que ha adquirido en la actualidad la producción nacional de setas, asimismo, la determinación de las propiedades antibióticas de los extractos orgánicos de capóforos de las setas adquiere importancia para el desarrollo de tecnologías que permitan la producción de biofármacos a partir del cultivo de basidiomicetos. La obtención de nuevas substancias que presenten actividad antibactaeriana permitirá hacer frente a los problemas de salud de la población. Desde el punto de vista educativo el proyecto repercutió en la formación de recursos humanos, como son: Becarios del programa PIFI, alumnos de Servicio Social, tesis de una estudiante de Maestría y proyectos terminales de titulación. Así mismo, fue posible la presentación en congresos Nacionales e Internacionales de los resultados obtenidos en el proyecto de investigación desarrollado. También se logró publicar un artículo en una revista mexicana de arbitraje estricto. Agradecimientos: Este trabajo se realizó con el apoyo del proyecto SIP del IPN y proyecto CONACYT

8 Literatura citada Ancona, L., S. Medina Peralta, G. Cetz Zapata, Preferencia en el consumo de Pleurotus djamor en Baca, Yucatán, México. Revista Mexicana de Micología 20: Anke T., Basidiomycetes: A source for new bioactive secondary metabolites. Progress in Industrial Microbiology 27: Anke, H., O. Bergendorff, O. Sterner, Assays of the biological activities of guaiane sesquiterpenoids isolated from the fruit bodies of edible Lactarius species. Food and Chemical Toxicology 27 (6): Badole, S.L, S.N. Shah, N.M. Patel, P.A. Thakurdesai, S.L. Bodhankar, Hypoglycemic activity of aqueous extract of Pleurotus pulmonarius (Fr.) Quel.- Champ in alloxan induced diabetic mice. Pharmacology and Biology 44: Badole, S.L., N.M. Patel, P.A. Thakurdesai, S.L. Bodhankar, Interaction of aqueous extract of Pleurotus pulmonarius (Fr.) Quel-Champ. with glyburide in alloxan induced diabetic mice. Evidence-based Complementary and Alternative Medicine 5(2): Bailey, W.R., G.E Scott, Diagnóstico Microbiológico. Editorial Panamericana, Buenos Aires, pp Barros L., R.C. Calhelha, J.A. Vaz, I.C.F.R. Ferreira, P. Baptista, L.M. Estevinho, Antimicrobial activity and bioactive compounds of Portuguese wild edible mushrooms methanolic extracts. European Food Research Technology. 225(2): Benedict, R.G., LR. Brady, Antimicrobial activity of mushroom metabolites. Journal of Pharmacological Science 61: Bobek, P., S. Galbavy, Hypocholesterolemic and antiatherogenic effect of oyster mushroom (Pleurotus ostreatus) in rabbits. Nahrung 43: Brizuela, M.A., L. García., L. Pérez, M. Mansur, Basidiomicetos: nueva fuente de metabolitos secundarios. Revista Iberoamericana de Micología 15: Cedano, M., M. Martínez, C. Soto, L. Guzmán-Dávalos, Pleurotus ostreatorroseus (Basidiomycotina, Agaricales) in Mexico and its growth in agroindustrial wastes. Cryptogamic Botany 3: Chang ST., Mushroom research and development equality and mutual benefit. In: Royse DJ (ed). Proceedings of the 2nd International Conference on Mushroom Biology and Mushroom Products. Pennsylvania, State University, United States, pp Chang, S.T, P.G. Miles, Mushrooms biology-a new discipline. Mycologist. 6:64 5. Daniewski, W.M., M. Gumulka, D. Truzewska, U. Jacobson, T. Noria, Monohydroxylactones of Lactarius vellereus. Phytochemistry 41: Domínguez, A. X., Métodos de Investigación Fitoquímica. Editorial Limusa, México, D.F. Dornberger, K., H. Lich, Zureck A. Antibiotics from Basidiomycetes. The 4- hydroxy-benzenediazonium ion, an antimicrobial, cytotoxic and antineoplastic metabolite from the Basidiomycete Agaricus xanthodermus (Agaricales). Progress in Industrial Microbiology 27:

9 Harttig, U., W. Chaing, Leianafulvene, a sesquiterpenoid fulvene derivated from cultures of Mycena leiana. Phytochemistry 29: Gaitán-Hernández, R., D. Salmones, Análisis de la producción de cepas de Pleurotus djamor. Revista Mexicana de Micología 15: Harbone J.B., Phytochemical Methods. Chapman and Hall, London. Hassegawa, H.R., M.C.R. Kasuya, D.C.M. Vanetti., Growth and antibacterial activity of Lentinula edodes in liquid media supplemented with agricultural wastes. Elec. Journal of Biotechnlogy 8: Hawksworth, D.L., Mushrooms: the extent of the unexplored potential. International Journal of Medicinal Mushrooms 3: Iacobellis N.S., P. Cantore, F. Capasso, F. Senatore, Antibacterial activity of Cuminum cyminum L. and Carum carvi L. essential oils. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53(1): Ishikawa, K.N., M.C.M. Kasuya, D.C.M. Vanetti, Antibacterial activity of Lentinula edodes grown in liquid medium. Brazilian Journal of Microbiology 32: Iwalokun, B. A, U.A. Usen, A.A. Otunba, D.K. Olukoya, Comparative phytochemical evaluation, antimicrobial and antioxidant properties of Pleurotus ostreatus. African Journal of Biotechnology 6 (15): Kim, H.W., B.K. Kim, Biomedicinal triterpenoids of Ganoderma lucidum (Curt.: Fr.) P.Karst (Aphyllophoromycetidae). International Journal of Medicinal Mushrooms 1: Koneman, W.M., S.D. Allen, W.M. Janda, P.C. Schreckenberg, W.C. Winn, Diagnóstico Microbiológico. Editorial Panamericana, Buenos Aires, pp Lin, B.Z, M.Y Wang, Q. Liu, Q.M. Che, Effects of total triterpenoids extract from Ganoderma lucidum (Curt.:Fr.) P.Karst. (Reishi Mushroom) on experimental liver injury models induced by carbon tetrachloride or d-galactosamine in mice. International Journal of Medicinal Mushrooms 4(4): Lindequist, U., E. Teuscher, G. Narbe, Neue Wirkstoffe aus Basidiomyceten. Z Phytother;11: (in German). Lindequist, U., H.J.T. Niedermeyer, J. Wolf-Dieter, The pharmacological potential of mushrooms. Evidence-based Complementary and Alternative Medicine 2(3): López Cobá, E.H., M.L. Ancona, P. S. Medina, Cultivo de Pleurotus djamor en laboratorio y en una casa rural tropical. Revista Mexicana de Micología 21: Salmones, D., L. Mestizo Valdéz, R. Gaitán Hernández, Entrecruzamiento y evaluación de la producción de las variedades de Pleurotus djamor (Fr.) Boedijn. Revista Mexicana de Micología 18: Wasser S.P., E. Nevo, D. Sokolov, S. Reshetnikov, M. Timot-Tismenetsky, Dietary supplements from medicinal mushrooms: diversity of types and variety of regulations. International Journal of Medicinal Mushrooms 2(1): Wasser, S.P Medicinal mushrooms as a source of antitumor and immunomodulating polysaccharides. Applied Microbiology and Biotechnology 60(3): Zhang J, G. Wang, H. Li, C. Zhuang, T. Mizuno, H. Ito, H. Mayuzumi, H. Okamoto, J. Li, Antitumor active protein-containing glycans from the Chinese mushroom songshan lingzhi, Ganoderma tsugae mycelium. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 58(7):