Métodos no invasivos para el estudio de la comedogénesis y comedolisis
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- Trinidad Río Maidana
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1 Métodos no invasivos para el estudio de la comedogénesis y comedolisis Luis R. Coll, Lucila Monti y Fernando M. Stengel RESUMEN: El estudio de la hipercornificación del infrainfundíbuio de los folículos sebáceos en la piel humana es un medio predictivo para valorar la acción comedogénica y comedolítica de productos farmacéuticos y cosméticos. Permite, además, analizar las características y la evolución de cuadros acneicos. Los métodos de estudios no invasivos de los microcomedones se realizan en dos etapas: análisis directos sobre la superficie cutánea que permite la observación del comedón en su parte más externa y por medio de la biopsia folicular, con la cual se accede al segmento más profundo del folículo sebáceo. El Procesamiento Digital de Imágenes permite su análisis cualitativo y/o cuantitativo y lo hace objetivo y reproducible. Palabras claves: biopsia folicular - videomicroscopía - Procesamiento Digital de Imágenes - microcomedón - comedón - folículo fundido. SUMMARY: The study of the hypercornification process in sebaceous follicles of human skin is a predictive method for the comedogenic and comedolytic properties of topical drugs and eos- ~ v metics. Non invasíve studies for micro comedones are performed in 2 stages: direct skin analysis which allows for surface comedo observation and follicular biopsy that examinates the deeper follicular structures. Digital image processing ensures qualitative and quantitative objective and reproducible results. Key Words: Follicular Biopsy - Videomicroscopy - Digital Image Processing - IVlicrocomedone - Comedo - Follicular Cast. Arch. Argent. Dermatol. 54:49-56, 2004 INTRODUCCION El análisis del folículo sebáceo nos permite valorar el acné y evaluar la acción comedogénica y comedolítica de fármacos y cosméticos. En el año 1971 Marl<s y Dawber introducen un método de estudio del estrato córneo compactum por medio de la polimerización de cianoacrilato. Lo denominaron Biopsia de Superficie^! se usa para la investigación de desórdenes de la cornificación como la psoriasis, ictiosis y pitiriasis rubra pilaris. También para el estudio de queratosis actínicas y el envejecimiento cutáneo' ^ (Fig. Posteriormente Mills y Kligman extienden el procedimiento para evaluar rápidamente y en forma no invasiva el folículo sebáceo. Lo denominan Biopsia Foiicuiar^ ^. Este método consiste en la obtención de tres o más capas de corneocitos del estrato córneo acompañado de pelos, material queratínico, detritus celulares, lípidos y bacterias. En el canal pilosebáceo, la compactación de todos estos materiales forma una masa amorfa ad- Servicio de Dermatología. Instituto Universitario CEIVIIC. herida entre sí que se denomina Folículo Fundido''. El Procesamiento Digital de las Imágenes obtenidas de la biopsia folicular permite cuantificar y cualificar con precisión la variación de los microcomedones, observando el número y tamaño de los folículos fundidos y ostium foliculares^ (Fig. 2). Los folículos pilosos de la cara se dividen en tres categorías: folículos originarios de pelos terminales, folículos originarios de lanugos (velloso) y folículos sebáceos. Estos últimos son el sitio de lesiones acneicas con localización en el rostro y parte superior del tronco. Se caracterizan por un infundíbulo largo, con dos o más glándulas sebáceas grandes y un pelo muy primitivo. En la región facial, el tamaño de las glándulas sebáceas es inversamente proporcional a la dimensión del pelo correspondiente'^. El folículo sebáceo en su parte más externa presenta una estructura similar a la epidermis (acroinfundíbulo), con un estrato córneo fino. El infrainfundíbuio presenta un discreto estrato granuloso y la capa de queratina consiste en dos o tres líneas de células que fácilmente se desprenden a la luz del folículo. Estas características histopatológicas se modi- Recibido: Aceptado para publicación:
2 Luis R. Coll y colaboradores Fig. 1: Biopsia de superficie cutánea. En el año 1971 Marks y Dawber introducen un método de estudio del estrato córneo compactum por medio de la polimerización de cianoacrilato. Imágenes captadas a 200X. Fig. 2: Biopsia folicular, c; comedón, permite los análisis cualitativos y cuantitativos. me: microcomedón, of. ostium folicular, ff: folículo fundido, pdi: procesamiento digital de imágenes, fican en el acné, donde se aprecia una capa granulosa espesa y una capa córnea compacta. Los conductos de las glándulas sebáceas presentan características histológicas similares al infrainfundíbuio"^. Se desconoce el mecanismo íntimo de desencadenamiento de la hipercornificación del ductus. Aparentemente las anomalías de los lípidos sebáceos como el incremento de los ácidos grasos libres, escualeno y sus peróxidos y la disminución del ácido linoleico serían factores favorecedores^ ^ Los lípidos en los folículos fundidos presentan una concentración distinta al estrato córneo. Por medio de estudios de cromatografía de capa fina (HPTLC) se detecta una mayor concentración de ceramidas tipo 3 y ácidos grasos libres en los folículos fundidos, mientras que los triglicéridos, esteróles y esteres de ceras y el escualeno se encuentran en concentraciones mayores en el estrato córneo^ (Cuadro 1). Esta disminución de las ceramidas explicaría la pérdida parcial de agua en la pared del folículo sebáceo favoreciendo la hipercornificación en los pacientes con acné^. 50 Arch. Argent. Dermatol.
3 Métodos no invasivos para el estudio de la comedogénesis y comedolisis CUADRO 1 Diferencia de concentración de lípidos entre la capa córnea y el folículo fundido Composición Capa Folículo lipídica córnea fundido Sulfato de colesterol Ceramidas tipo III Esteróles libres Acidos grasos libres Triglicéridos Esteróles y esteres de ceras Escualeno t T T T T t t Factores etiológicos mayores del acné CUADRO 3 / \n del ductus pilosebáceo II -Incremento de la secreción de sebo III-Colonización del ductus por el P. acné IV-Cuadro inflamatorio ^ Mayor concentración. Ref. Thielitz A. y col.' La hiperprollferación de queratinocitos ductales, la inadecuada separación de los corneocitos o la combinación de ambas son los desencadenantes de los microcomedones. Esta es la lesión más precoz del acné". La hiperprollferación de los queratinocitos en el ductus pilosebáceo fue demostrado por métodos inmunohistoquímicos utilizando anticuerpos monoclonales Ki 67 y también por medio de la marcación de la síntesis de ADN celular con timidina tritiada. La diferenciación anormal fue corroborada por medio de marcadores de queratina 16 (K 16), que junto con la K 6 se detecta en los queratinocitos activados""'". Estos microcomedones en su crecimiento producen la dilatación de los folículos sebáceos. Posteriormente pueden progresar a comedones clínicamente visibles dando origen al comedón abierto (cabeza negra) y/o comedón cerrado (cabeza blanca), siendo este último el responsable de lesiones acneicas (comedón inflamatorio)6 (Cuadro 2). En resumen: la hipercornificación del ductus pilosebáceo es la lesión más precoz del acné, y conforma parte de los cuatro factores etiológicos mayores de las alteraciones básicas de esta patología, junto con el incremento de la secreción de sebo, la colonización del duc- Hiperproliferación de queratinocitos Comedón abierto-^ (cabeza negra) CUADRO 2 Formación de comedones Microcomedones Separación inadecuada de los corneocitos Comedón cerrado (cabeza blanca) Comedón inflamatorio tus por Propionibacterium acnés y el posterior cuadro inflamatorio'^'^ (Cuadro 3). Por lo tanto, el estudio de la evolución de los microcomedones nos permite evaluar los pacientes con acné en modalidad de comedolisis y comedogénesis. MATERIALES Y METODOS " Para la evaluación de las lesiones se utiliza un v - deomicroscopío con fuente lumínica de luz halógena proyectada por fibra óptica, que permite la transmisión de rayos de luz visible aleatoria (difusa) o polarizada a la superficie en estudio. También se emplean fuentes de lámpara de xenón con emisión de luz ultravioleta. Las imágenes se captan en forma directa sobre la superficie de la piel y/o sobre preparados de biopsias foliculares. Se aplican lentes con una amplificación de imágenes de 20X, 50X y 200X, El estudio directo sobre la superficie cutánea se ejecuta sobre un promedio de diez campos en zona predeterminada de la cara y/o parte superior del tronco. La biopsia folicular se obtiene en las mismas zonas anatómicas, por medio de un portaobjeto con cianoacrilato distribuido en forma homogénea que se aplica en la zona de estudio por un período de 30 segundos con un peso de 200 gr aproximadamente. De cada preparado se toma un promedio de diez imágenes con diferentes niveles de resolución. Se efectúa coloración de los preparados con PMS (Polychrome Múltiple Stain, solución de azul de toluidina y fucsina básica) que permite incrementar el contraste entre los microcomedones y el fondo. Todas las imágenes obtenidas son estudiadas por medio de Procesamiento Digital de Imágenes con programa ad hoc, que mejora las imágenes con diferentes filtros matemáticos para la obtención de información cualitativa y macros que permiten obtener información cuantitativa. Los datos obtenidos son volcados a planillas electrónicas para efectuar los cálculos estadísticos pertinentes. Tomo 54 ns 2, Marzo-Abril
4 Luis R. Coll y colaboradores COMENTARIOS El análisis de los microcomedones y comedones por medio no invasivos se divide en dos etapas: los estudios directos sobre la superficie cutánea y los estudios indirectos por medio de la biopsia folicular (Cuadro 4). El estudio directo de la superficie cutánea puede efectuarse con rayos de luz visible aleatoria y/o luz polarizada, posibilitando detectar comedones cerrados (cabeza blanca), precursores de procesos inflamatorios acneicos. La determinación de la cantidad de este tipo de comedones por área de superficie permite comprobar la efectividad de productos comedolíticos o por el contrario definir la capacidad de un producto en desencadenar comedogénesis^ (Fig. 3). Con el mismo procedimiento podemos cuantificar la CUADRO 4 Etapas de estudio de los Microcomedones y Comedones Estudio Directo sobre la superficie cutánea: Luz visible aleatoria (difusa) Luz visible polarizada Rayos ultravioleta A Estudio Indirecto por biopsia folicular Luz visible aleatoria (difusa) Luz visible polarizada Tinción policroma múltiple cantidad de comedones abiertos (cabeza negra), para determinar la efectividad de un tratamiento en reacciones acneiformes, por ejemplo las producidas por el alquitrán de hulla, o en cuadros no acneicos como la elas- Luz aleatoria Luz polarizada Fig. 3: Comedón cerrado (cabeza blanca), ce: comedones cerrados, me: microcomedones. Luz aleatoria Luz polarizada i Fig. 4: Comedón abierto (cabeza negra), ca; comedón abierto. 52 Arch. Argent. Dermatol.
5 Métodos no invasivos para el estudio de la comedogénesis y comedolisis toidosis a quiste y comedón (Favre-Racouchot). También en el caso de falsos comedones como en la rosácea, para valorizar las modificaciones vasculares pre y pos tratamiento o determinar la presencia de Demodex folliculorum^ (Figs. 4 y 5). Otro método directo de estudio de la superficie cutánea consiste en analizar el número y dimensiones del orificio folicular cuando éstos emiten fluorescencia al ser estimulados con rayos luz Ultravioleta A (UVA). Este método fue ideado por Sauermann y colaboradores para evaluar el efecto comedolítico de tratamientos tópicos para el acné. La fluorescencia es emitida por la presencia de porfirinas producida por el Propionibacterium acnés (color anaranjado) y mínimamente por el sebo (color amarillo) presente en el infundíbulo sebáceo. Un aumento o reducción de la fluorescencia refleja una variación de la cantidad de P. acnés (Fig. 6). La etapa indirecta para el estudio de microcomedones por medio de la Biopsia Folicular se efectúa por dos parámetros: estudio del ostium folicular y de los folículos fundidos. Se considera su cantidad por unidad de superficie y su tamaño en ambos casos, reflejando el balance entre comedogénesis y comedolisis (Fig. 7). Aunque los folículos fundidos se encuentran tanto en pacientes con y sin acné, el punto a determinar es la variación en ambos grupos como también los cambios que se producen según la severidad del cuadro. Por ejemplo: los estudios demuestran que el porcentaje de folículos fundidos detectados sobre el total de folículos sebáceos en la cara en caso de acné moderados y severos se encuentra entre 35,1 + 4,3 %, en el acné leve 28,5 ± 0,16 y en grupos libre de acné 18,7 ± 1,25%". Otro punto a tener en cuenta es la distribución de los folículos pilosos que varían según la zona donde se efectúe el estudio. En la raza caucásica la zona central de la frente y la nariz son regiones de mayor concentración Fig. 5: Pseudocomedones (rosácea). Luz aleatoria, df: demodex folliculorum, psc: pseudocomedón, caf; capilares aneurismáticos y tortuosos. Fig. 6: Análisis directo del folículo sebáceo por luz ultravioleta A ( nm) (Sauermann y col fof: fluorescencia del orificio folicular, fa: fluorescencia amarilla (sebo), fn: fluorescencia naranja (P. acné). Tomo 54 n«2, Marzo-Abril
6 Métodos no invasivos para el estudio de la comedogénesis y comedolisis toidosis a quiste y comedón (Favre-Racouchot). También en el caso de falsos comedones como en la rosácea, para valorizar las modificaciones vasculares pre y pos tratamiento o determinar la presencia de Demodex folliculorum^ (Figs. 4 y 5). Otro método directo de estudio de la superficie cutánea consiste en analizar el número y dimensiones del orificio folicular cuando éstos emiten fluorescencia al ser estimulados con rayos luz Ultravioleta A (UVA). Este método fue ideado por Sauermann y colaboradores para evaluar el efecto comedolítico de tratamientos tópicos para el acné. La fluorescencia es emitida por la presencia de porfirinas producida por el Propionibacterium acnés (color anaranjado) y mínimamente por el sebo (color amarillo) presente en el infundíbulo sebáceo. Un aumento o reducción de la fluorescencia refleja una variación de la cantidad de P. acnés (Fig. 6). La etapa indirecta para el estudio de microcomedones por medio de la Biopsia Folicular se efectúa por dos parámetros: estudio del ostium folicular y de los folículos fundidos. Se considera su cantidad por unidad de superficie y su tamaño en ambos casos, reflejando el balance entre comedogénesis y comedolisis (Fig. 7). Aunque los folículos fundidos se encuentran tanto en pacientes con y sin acné, el punto a determinar es la variación en ambos grupos como también los cambios que se producen según la severidad del cuadro. Por ejemplo: los estudios demuestran que el porcentaje de folículos fundidos detectados sobre el total de folículos sebáceos en la cara en caso de acné moderados y severos se encuentra entre 35,1 ± 4,3 %, en el acné leve 28,5 ± 0,16 y en grupos libre de acné 18,7 ± 1,25%". Otro punto a tener en cuenta es la distribución de los folículos pilosos que varían según la zona donde se efectúe el estudio. En la raza caucásica la zona central de la frente y la nariz son regiones de mayor concentración Tomo 54 ns 2, Marzo-Abril
7 Luis R. Coll y colaboradores Fig. 7: Biopsia folicular, ff: folículo fundido, of: ostium folicular, f)of: fiipercornificación del ostium folicular. de folículos, siguiendo en frecuencia la parte media del pómulo y mentón. Las áreas de menor concentración se detectan en las zonas laterales de la frente y preauricular. Una distribución similar se ve en el caso de los microcomedones, donde la densidad mayor se ve en la nariz, seguido de la parte media del pómulo, luego la parte central de la frente y el mentón. Cunliffe y col. estiman por medio de microscopía de superficie un promedio de 320 unidades pilosebáceas por cm^ en la frente, mientras que por medio del Sebutape se obtiene un rango de 150 a 250 unidades por cm^. Los folículos fundidos representan un promedio de 5 a 20% de los folículos sebáceos en pacientes libres o con predisposición al acné, mientras que en los pacientes con cuadro de acné severos pueden superar el 60% de folículos fundidos por cm". El estudio de los folículos fundidos se efectija con luz visible aleatoria a la superficie del preparado. Las áreas de los folículos fundidos en los pacientes libres de acné oscilan entre 0,119 a 0,029 mm^, mientras que los que presentan acné se encuentran entre 0,038 a 0,047 mm^»(fig. 8). El estudio del ostium folicular se efectúa por proyección de luz polarizada a los preparados, permitiendo definir la cantidad detectada por unidad de superficie y su tamaño (área). El numero de orificios foliculares oscila entre 2 a 24/ cm^, dependiendo la zona de la cara estudiada. Las áreas de superficie del ostium se las puede dividir en tres grupos: de 0,003 a 0,016 mm^ 0,016 a 0,042 mm^ y más de 0,042 mm^, dependiendo de la severidad del Pretraianúento (día 0) Postraíamienio (día 120) Fig. 8: Análisis de folículos fundidos, (ff) luego de 4 meses de tratamiento con isotretinoina oral (disminución de área en 74,7%). 54 Arcti. Argent. Dermatol.
8 Métodos no invasivos para el estudio de la comedogénesis y comedolisis cuadro (Fig. 9). El método basado en la coloración de los preparados con PMS tiene la ventaja para el ojo humano de definir los bordes de los elementos de estudio con mayor realce. Por otra parte permite efectuar análisis basados en la colorimetría (Fig. 10). El estudio en la oreja de conejo para determinar la acción comedogénica y/o comedolítica de productos farmacéuticos o cosméticos, presenta el inconveniente de dar falsos positivos por ser hiperpredictivo. La piel humana es menos sensible y responde más lentamente que la piel de conejo a estímulos idénticos. Un ejemplo de ello es el peróxido de benzoilo, que al ser analizado en estos animales demostró una actividad comedolítica importante mientras que los estudios en humanos revelaron que esta cualidad era casi inexistente^'^. En el estudio predictivo de la actividad comedogénica de los cosméticos en forma oclusiva en áreas del tórax, hay que considerar que la simple oclusión de la piel produce modificaciones a nivel del ostium folicular por sí mismo. A su vez, estas zonas tienen una respuesta diferente a la de la cara'^. Fig. 9: Análisis del ostium folicular. Imágenes de biopsia folicular en paciente tratado con Isotretinoina por vía oral, con reducción del área del ostium folicular del 85,3%. hof: fiiperconificacion de ostium folicular, of: ostium folicular. Fig. 10: Preparados teñidos con Múltiple Mancfias Policroma (Polychrome Múltiple Stain: solución de azul de toluidina y fucsina básica), hof: hiperconificación de ostium folicular, ff: folículo fundido. Tomo 54 n- 2, Marzo-Abril
9 Métodos no invasivos para el estudio de la comedogénesis y comedolisis cuadro (Fig. 9). El método basado en la coloración de los preparados con PIVIS tiene la ventaja para el ojo humano de definir los bordes de los elementos de estudio con mayor realce. Por otra parte permite efectuar análisis basados en la colorimetría (Fig. 10). El estudio en la oreja de conejo para determinar la acción comedogénica y/o comedolítica de productos farmacéuticos o cosméticos, presenta el inconveniente de dar falsos positivos por ser hiperpredictivo. La piel humana es menos sensible y responde más lentamente que la piel de conejo a estímulos idénticos. Un ejemplo de ello es el peróxido de benzoilo, que al ser analizado en estos animales demostró una actividad comedolítica importante mientras que los estudios en humanos revelaron que esta cualidad era casi inexistente^'^. En el estudio predictivo de la actividad comedogénica de los cosméticos en forma oclusiva en áreas del tórax, hay que considerar que la simple oclusión de la piel produce modificaciones a nivel del ostium folicular por sí mismo. A su vez, estas zonas tienen una respuesta diferente a la de la cara'^. Luz polarizada Imágenes al inicio del íraícmunto 'mk ^ 200X ^^^^^^^^^^^^^^^ <4 aleatoria ImágeitíSJl cuatro meses de traiamiento Fig. 9: Análisis del ostium folicular. Imágenes de biopsia folicular en paciente tratado con Isotretinoina por vía oral, con reducción del área del ostium folicular del 85,3%. hof: fiiperconificacion de ostium folicular, of: ostium folicular. Fig. 10: Preparados teñidos con Múltiple Manchas Policroma (Polychrome Múltiple Stain: solución de azul de toluidina y fucsina básica), hof: hiperconificación de ostium folicular, folículo fundido. Tomo 54 n^ 2, Marzo-Abril
10 Luis R. Coll y colaboradores CONCLUSIONES El estudio del microcomedón es un medio predictivo para evaluar la acción comedogénica y comedolítica de productos farmacéuticos y cosméticos, como también de las características y evolución de cuadros acneicos. La asociación de procedimientos de magnificación por videomicroscopío directo de la superficie de la piel y/o la biopsia folicular, más el procesamiento digital de imágenes, son herramientas muy útiles para el análisis cualitativo y cuantitativo de las características del comedón en sus diferentes etapas evolutivas. Esta metodología es uno de los estudios aconsejados por las agencias internacionales de control sanitario para el análisis de productos tópicos cosméticos y/o farmacéuticos. BIBLIOGRAFIA 1. Marks, R.; Dawber, R.P.R.: Skin surface biopsy: an improved tecfinique for the examination of the horny layer. Br J Dermatol 1971; 84: Thielitz, A.; Helmdach, M.; Ropke, E.M.; Golinick, H.: Lipid analysis of follicular casts from cyanoacryiate strips as a new method for studying therapeutic effects of actiacne agents. Br J Dermatol 2001; 145: Mills, O.H.; Kligman, A.M.: The follicular biopsy. Dermatológica 1983; 167: Cunliffe, W.J.: Acné. Martin Dunitz Ltd. Londres; 1991; págs Piérard, G.E.; Piérard-Franchimont, C; Goffin, V.: Digital Image analysis of microcomedones. Dermatology 1995; 190: Harms, M.: Isotretinoina sistémica. F. Hoffmann-La Roche SA. Basilea Suiza; 1993; Cap. 3; págs Motoyoshi, K.: Enhanced comedo formation in rabbit ear skin by squalene and oleic acid peroxides. Br J Dermatol 1983: 109: Letawe, C; Boone, M.; Piérard, G.E.: Digital image analysis of the effect of topically applied linoleic acid on acné microcomedones. Clin Exp Dermatol 1998; 23: Yamamoto, A.; Takenouchi, K.; Ito, M.: Impaired water barrier function in acné vulgaris. Arch Dermatol Res 1995: 287: Knaggs, H.E.; Holland, D.B.; Morris, C; Wood, E.J.; Cunliffe, W.J.: Quantification of cellular proliferation in acné using the monoclonal antibody Ki-67. J Invest Dermatol 1994:102: Cordero, A.A.: Biología de la piel. Edit. Médica Panamericana. Buenos Aires; 1996; págs Cunliffe, W.J.: Acné. Martin Dunitz. Londres; Cap. 15; págs Cunliffe, W.J.; Holland, D.B.; Clark, S.M.; Stables, G.L.: Comedogénesis: some new aetiological, clinical and therapeutic strategies. Br J Dermatol 2000: 142: Pagnoni, A.; Kligman, A.M.; Gammal, S.; Stoudemayer, T: Determination of density of follicles on various regions of the face by cyanoacryiate biosy: correlation with sebum output. Br J Dermatol 1994; 131: Cunliffe, W.J.: Acné. Martin Dunitz. Londres; 1991; Cap. 12; págs Williams, M.; Cunliffe, W.J.; Gould, D.: Pilo-sebaceous duct physiology: Effect of hydration on pilo-sebaceous duct orífice. Br J Dermatol 1974; 90: Dirección postal: L.R. Coll Austria ^ A Buenos Aires 56 Arch. Argent. Dermatol.
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