EFECTO DEL SULFATO DE AMONIO EN EL PERFIL QUÍMICO DE MEZCAL DE

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1 EFECTO DEL SULFATO DE AMONIO EN EL PERFIL QUÍMICO DE MEZCAL DE Agave angustifolia Haw. Araceli Minerva Vera-Guzmán (1)*, Mercedes G. López (2), José Luis Chávez-Servia (1) 1) Instituto Politécnico Nacional, CIIDIR Unidad Oaxaca. Hornos # 1003, Col. Nochebuena, C.P , Santa Cruz Xoxocotlan, Oaxaca, México. Tel (951) avera@ipn.mx y jchavez@ipn.mx. 2) CINVESTAV-IPN Unidad Irapuesto. Km. 9.6 Libramiento Norte Carr. Irapuato-León, C.P Irapuato, Guanajuato, México. Tel/fax (462) mlopez@ira.cinvestav.mx INTRODUCCIÓN El mezcal es una bebida artesanal elaborada con diferentes especies de agave cultivadas o silvestres recolectadas [1]. Oaxaca es el principal productor de mezcal elaborado de A. angustifolia Haw., en el año 2010 alcanzó el primer lugar en volumen de producción de mezcal certificado (809, litros), equivalente a 53% del volumen nacional [2]; principalmente por el proceso artesanal, a pesar de que en los últimos años se han introducido nuevas tecnología para la elaboración. El proceso artesanal consta básicamente de cuatro etapas: a) cocción del agave en hornos de tierra; b) molienda del agave cocido en molinos de piedra; c) fermentación espontánea (sin adición de levaduras) en tinas de madera con o sin la adición de sulfato de amonio; y d) destilación en alambiques de cobre [3]. Cada una de estas etapas se conduce con base en la experiencia y criterios del productor, lo que genera un mezcal de calidad variable. La fermentación es una etapa clave donde la actividad de levaduras de crecimiento natural y los carbohidratos hidrolizados presentes, generan etanol, dióxido de carbono y otros compuestos volátiles como alcoholes superiores, ésteres y ácidos orgánicos, los que determinan el sabor y aroma del mezcal producido [4, 5]. Sin embargo, en esta etapa regularmente no hay control de los parámetros que influyen en la producción de los compuestos volátiles. Por ejemplo, una práctica común entre productores de mezcal es la adición de sulfato de amonio con el objetivo de reducir el tiempo de fermentación, sin tomar en consideración lo cambios o efectos en el producto final. Ante esto, se planteo el objetivo de evaluar el efecto de la adición de sulfato de amonio durante la fermentación, sobre la concentración de compuestos volátiles mayoritarios y minoritarios en mezcal de A. angustifolia Haw., en Santiago Matatlán, Oaxaca, mediante cromatografía de gases (CG) y cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (CG-EM), técnicas analíticas para la separación, identificación y cuantificación de compuestos volátiles. EXPERIMENTACIÓN Se analizaron ocho muestras de mezcal obtenidas de una fábrica artesanal (palenque) de Santiago Mazatlán, Oaxaca. En la elaboración se utilizó A. Angustifolia Haw.: las piñas (tallo y restos de hojas) se cocieron en un horno de tierra; la fermentación fue espontánea con y sin la adición de sulfato de amonio (tratamientos); y se destiló en alambiques de cobre, la evaluación se realizó en primavera y otoño. Todo bajo un diseño completamente aleatorio. 489

2 Evaluación de compuestos volátiles mayoritarios. En cada muestra de mezcal se determinó el grado alcohólico real (NMX-V-1993-SCFI) [6]. Los compuestos volátiles mayoritarios fueron analizados en un cromatógrafo de gases marca Perkin Elmer con detector de ionización de flama y una columna HP-INNOWAX (30 x 0.25 m de diámetro interno x 0.25 μm de espesor de película). El gas acarreador fue helio con un flujo de 3.0 ml min -1. Se utilizó un programa de temperatura en el horno de 40 C con incrementos de 3 C min -1 hasta 120 C (por 3 min) y de 6 C min -1 hasta 200 C (por 20 min). La temperatura del detector (FID) fue de 230ºC y 180 C del inyector [3]. En la cuantificación de los volátiles se utilizó como estándar interno el sec-butil-acetato y se construyeron las curvas de referencia de cada estándar (acetato de etilo, metanol, ácido acético, propanol, 2-metil-propanol, 3-metil-butanol, 2-butanol y butanol). Los resultados se reportan en mg/100ml de alcohol anhidro. Todos los análisis se hicieron por triplicado. Extracción y evaluación de compuestos volátiles minoritarios. Se realizó una extracción líquida-liquida con diclorometano [7]. Cada extracción se realizó por duplicado y se analizaron en un cromatógrafo de gases acoplado a un espectrómetro de masas (CG-EM). Cada muestra se inyectó en un cromatógrafo de gases Hewlett- Packard 5890 Series II acoplado a un detector selectivo de masas Hewlett-Packard. Con una columna HP-FFAP (30 m, 0.25 mm ID, 0.32 m de espesor). La temperatura del inyector fue de 180 C y la del detector de 230 C. El flujo de helio fue de 20 ml min - 1 [8]. La identidad de los compuestos se realizó mediante comparación del espectro de masas del compuesto con la biblioteca de compuestos NIST98. El tiempo de retención de los compuestos se expresó en índices de Kovats (IK). Análisis estadístico. Con los valores de cada compuesto evaluado en cada muestra de mezcal, se hizo un análisis de varianza mediante un modelo factorial: tratamiento de sulfato (adición o no), estación de muestreo (primavera u otoño) y la interacción tratamiento-estación con tres y repeticiones en los compuestos mayoritarios y minoritarios, respectivamente. Cuando se determinaron diferencias significativas en las fuentes de variación, se procedió a realizar una comparación de medias por el método de Tukey (P 0.05). RESULTADOS Y DISCUSIÓN Con la técnica analítica de CG y CG-EM, se evaluaron los principales volátiles mayoritarios referidos en la Norma Oficial Mexicana [1]. En el mismo sentido, se evaluaron los compuestos volátiles minoritarios, en muestras de mezcal de A. angustifolia con especial atención a la adición o no de sulfato de amonio en la fermentación. En la Tabla 1 se muestran los cuadrados medios y sus significancias estadísticas de cada uno de los compuestos volátiles evaluados, donde se muestra que todos los compuestos mayoritarios presentaron diferencias significativas entre muestras por la adición de sulfato de amonio, entre épocas y en la interacción, a excepción del 2- butanol. Los coeficientes de variación más altos o compuesto de mayor variación en su determinación fueron 2-butanol y el butanol, quizás por presentarse en bajas concentraciones y con problemas en la cuantificación. Dentro de los volátiles minoritarios, el decanoato de etilo, feniletil acetato, dodecanoato de etilo y α, α, 5- trimetil-5-etenil-tetra-(h)-2-furanmetanol presentaron diferencias significativas por el 490

3 efecto de la adición de sulfato de amonio. La diferencia que presentaron los ésteres de ácidos grasos coincide con los resultados de Barbosa et al. [9], quienes detectaron cambios de estos compuestos en la fermentación de vinos como respuesta a la disponibilidad de nitrógeno. El efecto de la estación o época en la que se elaboró el mezcal se vió reflejado en decanol y alcohol bencílico; en ésteres como octanoato de etilo, feniletil acetato, dodecanoato de etilo y linolenato de metilo; en ácido hexadecanoico; en furanos como α, α, 5-trimetil-5-etenil-tetra-(H)-2-furanmetanol y 5- metilfurfural; y otros compuestos como el acenaftaleno. De los compuesto minoritarios, 2-furan metanol y feniletil acetato, presentaron diferencias significativas en la adición de sulfato de amonio, estación e interacción sulfato-estación. Lo que sugiere una alta influencia por el ambiente. En particular, el feniletil acetato es uno de los compuestos importantes en las características aromáticas florales del mezcal [7], y debe favorecerse su incremento no su decremento. En la Tabla 2 se muestran los promedios de los compuestos volátiles mayoritarios y minoritarios. Los valores promedio del etanol, acetato de etilo, metanol, propanol y butanol incrementaron significativamente por la adición de sulfato de amonio. En el caso del etanol, su incremento se debió a que se mejoraron las condiciones nutritivas del mosto (jugo de agave cocido) y por consiguiente el crecimiento poblacional y metabólico de las levaduras que participan en la producción del compuesto [10]. El propanol es uno de los alcoholes superiores que incremento su concentración y coincide con un reporte previo realizado en mostos de A. tequilana Weber [11]. Las concentraciones de 2-metil-propanol y 3-metil-butanol disminuyeron significativamente con el uso de sulfato de amonio, semejantes resultados también se reportaron en mostos de tequila [12]. El acetato de etilo y ácido acético presentaron diferencias significativas en la interacción adición del sulfato de amonio y estación. Los resultados sugieren que la adición de sulfato de amonio en la fermentación repercute en el producto final (mezcal), independientemente de la estación, ya que disminuyeron los valores de algunos alcoholes superiores, pero otros se incrementaron como butanol y metanol. Este ultimó en altas concentraciones es tóxico y se debe tener especial cuidado. En compuestos minoritarios, el decanoato de etilo, feniletil acetato y dodecanoato de etilo disminuyeron las concentraciones con la adición de sulfato de amonio, y podría indicar un efecto negativo, para ello es conveniente considerar que los ésteres son compuestos determinantes del aroma y sabor de las bebidas alcohólicas. 491

4 Tabla 1. Cuadrados medios y su significancia estadística de los compuestos volátiles evaluados en mezcal de A. angustifolia en Santiago Matatlán, Oaxaca. Compuesto evaluados Uso sulfato de amonio (T) Estación (E) Interacción T*E Coef. de variación (%) Compuestos volátiles mayoritarios: Etanol (% v/v) 12.0** 18.8** 3.0* 1.8 Acetato de etilo ** ** ** 2.7 Metanol ⱡ ** ** ** 5.1 Ácido acético ⱡ ** ** ** 3.1 Propanol ⱡ 303.3** ** 425.9** Metil-propanol ⱡ 638.5** 65.1** 53.6** Metil-butanol ⱡ ** 234.6** 28.9 ns Butanol ⱡ ns ns ns 23.4 Butanol ⱡ 0.34* 2.8** 0.41** 14.9 Alcoholes superiores ** ** 73.9 ns 3.7 Compuestos volátiles minoritarios: 4-Metil-1-pentanol ns ns 0.01 ns Metil-ciclopentanol ns ns ns Etoxi-1-propanol ns 0.12 ns 0.11 ns 17.2 Decanol 0.03 ns 0.63** ns 13.1 Alcohol bencílico ns 0.09* 0.36** 5.1 Octanoato de etilo 77.3 ns 111.8* 1.92 ns 23.7 Decanoato de etilo 261.4* ns 3.3 ns 22.0 Feniletil acetato 62.8** 82.5** 80.45** 17.4 Dodecanoato de etilo 56.1* 346.9** 3.7 ns 18.9 Linolenato de metilo 0.03 ns 0.63** ns 17.1 Ácido dimetilpropanedioico 0.53 ns * 2.7 ns 20.4 Ácido Butanoico 1.4 ns 0.08 ns 0.11 ns 21.5 Ácido Decanoico 25.7 ns 1.23 ns 13.9 ns 16.2 Ácido Hexadecanoico 0.17 ns 17.9** 4.0* 11.9 α,α,5-trimetil-5-etenil-tetra-(h)- 2-furan metanol 0.015* 0.015* 0.023* Metilfurfural 31.7 ns 641.9** 0.61 ns 14.2 Ácido 4-hexil-2,5-dihidro-2,5- dioxo-3-furanacetico 0.02 ns ns 0.27 ns Metil-2-ciclopentenona ns ns ns 17.7 Fenol 3.4 ns 6.4 ns 5.25 ns Metoxi-3-(2-propenil) fenol 2.8 ns 10.9* 2.8 ns Etil-fenol ns 0.24 ns ns 22.7 Linalool 0.13 ns 0.35 ns <0.001 ns Terpineol 2.1 ns 0.19 ns 1.4 ns 25.8 Acenaftaleno 0.18 ns 7.3** 0.21 ns 15.3 ⱡ (mg/100 ml de alc. Anh.); ns No significativo P 0.05; *Significativo a P 0.05; **Significativo a P

5 Tabla 2. Promedios de los compuestos volátiles evaluados en mezcal de A. angustifolia de Santiago Matatlán, Oaxaca. IK Uso sulfato de Estación (E) Interacción T-E (t R ) amonio (T) Primavera Otoño Con Sin Prim. Otoño Con Sin Con Sin Compuestos volátiles mayoritarios: (3.4) Etanol (% v/v) 43.8a 41.8b 44.0a 41.5b 45.5a 42.5b 42.0b 41.0b (1.8) Acetato de etilo 94.8a 71.3b 98.2a 67.9b 135.4a 61.1c 54.2d 81.6b (2.7) Metanol ⱡ 176.4a 119.0b 166.4a 129.0b 185.5a 147.2b 167.2a 90.8c 200 Ácido acético ⱡ 85.4b 108.1a 141.0a 52.4b 110.8b 173.0a 60.0c 44.5d (4.0) Propanol ⱡ 38.9a 28.9b 22.9b 44.8a 33.9b 12.0c 43.9a 45.8a (5.8) 2-Metil-propanol ⱡ 36.8b 51.4a 41.8b 46.5a 32.4c 51.2a 41.3b 51.3a (10.4) 3-Metil-butanol ⱡ 123.3b 180.6a 147.6b 156.4a 117.3a 177.8a 129.3a 183.5a (8.0) 2-Butanol ⱡ 0.28a 0.27a 0.23b 0.31a 0.28a 0.20a 0.28a 0.34a (7.6) Butanol ⱡ 1.6a 1.2b 0.9b 1.9a 1.3b 0.58c 1.9a 1.9a Alcoholes ⱡ superiores 200.9b 262.4a 213.5b 249.9a 185.3a 241.8a 216.7a 283.1a Compuesto volátiles minoritarios: (14.5) 4-Metil-1-pentanol 0.14a 0.16a 0.11a 0.18a 0.13a 0.1a 0.15a 0.2a (15.5) 3-Metil-ciclopentanol 0.6a 0.5a 0.68a 0.47a 0.8a 0.6a 0.5a 0.4a (17.1) 3-Etoxi-1-propanol 1.2a 1.1a 1.4a 0.8a 1.7a 1.1a 0.7a 1.1a 526 Decanol 1.2a 1.3a 0.9b 1.6a 1.0a 1.0a 1.5a 1.6a 635 Alcohol bencílico 1.4a 1.4a 1.5a 1.3b 1.3bc 1.7a 1.5ab 1.1c (19.6) Octanoato de etilo 10.9a 17.11a 10.3b 17.7a 7.7a 12.9a 14.2a 21.3a 408 Decanoato de etilo 17.4b 28.9a 19.4b 26.8a 14.4a 24.5a 20.5a 33.2a 576 Feniletil acetato 5.7b 11.3a 5.3b 11.7a 5.7b 4.9b 5.8b 17.7a 596 Dodecanoato de etilo 11.6b 16.9a 20.8a 7.6b 17.5a 24.1a 5.7a 9.6a 1245 Linolenato de metilo 0.4a 0.5a 0.73a 0.17b 0.7a 0.8a 0.1a 0.3a 332 Ác. dimetilpropanedioico 4.6a 4.2a 5.7a 3.1b 6.6a 4.9a 2.7a 3.4a 400 Ác. Butanoico 3.6a 4.4a 3.9a 4.1a 3.6a 4.2a 3.6a 4.6a 1000 Ác. Decanoico 25.4a 29.0a 26.8a 27.6a 26.3a 27.3a 24.5a 30.7a 1600 Ác. Hexadecanoico 5.6a 5.8a 7.2a 4.2b 6.3ab 8.0a 4.8b 3.7b 227 α,α,5-trimetil-5- etenil-tetra-(h)-2- furan metanol 0.6a 0.5b 0.61a 0.52b 0.6ab 0.6a 0.6a 0.4b Metilfurfural 17.0a 13.0a 24.0a 6.0b 25.7a 22.2a 8.3a 3.8a 849 Ác. 4-hexil-2,5- dihidro-2,5-dioxo-3- furanacetico 0.3a 0.7a 1.2a 1.1a 0.0a 1.4a 0.6a 0.0a Metil-2- ciclopentenona 0.3a 0.3a 0.3a 0.3a 0.3a 0.3a 0.3a 0.2a 756 Fenol 11.1a 9.8a 11.3a 9.5a 11.2a 11.5a 11.0a 8.1a Metoxi-3-(2- propenil) fenol 9.7a 2.5a 0.0a 12.2a 0.0a 0.0a 19.4a 5.1a Etil-fenol 2.0a 2.3a 2.7a 1.6a 2.4a 3.0a 1.6a 1.6a 315 Linalool 1.4a 1.7a 1.3a 1.8a 1.2a 1.5a 1.6a 1.9a 462 -Terpineol 3.0a 4.0a 3.6a 3.3a 2.7a 4.6a 3.2a 3.4a 937 Acenaftaleno 2.5a 2.2a 3.3a 1.4b 3.6a 3.0a 1.4a 1.4a IK= Índice de Kovats, con base en ácidos grasos de cadena corta y larga; (t R) = tiempo de retención. En renglón, medias con letras iguales no difieren significativamente (Tukey, P < 0.05). 493

6 CONCLUSIONES La cromatografía de gases y la cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas son técnicas analíticas importantes para la determinación de compuestos volátiles en mezcal. La adición de sulfato de amonio durante la fermentación y en dos estaciones del año, alteró la síntesis de compuestos volátiles mayoritarios y minoritarios; en etanol, acetato de etilo, metanol y propanol generó un decremento, e incrementó de la concentración de 2-metil-propanol, 3-metil-butanol, ácido acético, decanoato de etilo, feniletil acetato y dodecanoato de etilo. El sulfato de amonio afectó la calidad sensorial del mezcal y favoreció la síntesis de metanol, un compuesto tóxico para la salud. AGRADECIMIENTOS Al Instituto Politécnico Nacional por el financiamiento del proyecto y las facilidades de laboratorio y administrativas para concretar las metas propuestas del estudio reportado. REFERENCIAS [1] NOM-070-SCFI-1994 Disponible en: (abril, 2012). [2] Consejo Mexicano Regulador de la Calidad del Mezcal [3] A.M. Vera-Guzmán, P.A. Santiago-García, M.G. López. Rev. Fitotec. Mex. 32, (2009). [4] C.M. Cedeño. Crit. Rev. Biotechnol., 15,1-11 (1995). [5] D.M. Díaz-Montaño, M.L. Délia, E.M. Estarrón, P. Strehaiano. Enz. Microbial Technol., 42, (2008). [6] NMX-V-1993-SCFI disponible en: (abril, 2012) [7] M.G. López. Tequila aroma. In: Flavor chemistry of ethnic foods; Shahidi H. Ed.; Kluwer Academic/Olenum Publishers: New York, NY, USA, pp: (1999). [8] M. G. López, S. C. Guevara-Yáñez. Authenticity of three Mexican alcoholic beverages by SPME-GC-MS. In: Annual Meeting of Institute of Food Technologists, New Orleans, LA. USA. pp: (2001). [9] C. Barbosa, V. Falco, A. Mendes-Faia, A. Mendes-Ferreira. J. Biosci. Bioeng., 108, (2009). [10] J. Arrizon, A. Gschaedler. Can. J. Microbiol., 48, (2002). [11] G. Arrizon, A. Gschaedler. J. Appl. Microbiol., 102, (2007). [12] L. Pinal, M. Cedeño, H. Gutiérrez, J. Álvarez. Biotechn. Letters, 19, (1997). 494