EVALUACIÓN DE LA CINÉTICA DE LA ENZIMA NARINGINASA DE PENICILLIUM DECUMBENS

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Miguel Fernández Bustos
hace 6 años
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1 Clave: EVALUACIÓN DE LA CINÉTICA DE LA ENZIMA NARINGINASA DE PENICILLIUM DECUMBENS Raquel, González-Vázquez; Yadira Rivera-Espinoza; Ma. Teresa Cruz y Victoria DIRECCIÓN DE LOS AUTORES Graduados en alimentos. Escuela Nacional de Ciencias Biológicas. Instituto Politécnico Nacional, México, D.F. CORREO ELECTRÓNICO nenaracer@yahoo.com.mx ; espinoza4@hotmail.com

2 INTRODUCCIÓN La implementación de enzimas, con aplicación significante en la industria de los alimentos, se ha incrementado en años recientes. La Naringinasa es una enzima que está siendo aplicada en esta industria en el proceso de desamargor de los jugos de uva y otras frutas. (Ito et al., 1970; Fukumoto et al., 1973) debido a que puede hidrolizar a la Naringina que es el mayor y principal componente del amargor en los jugos de frutas cítricas y su presencia ha sido la mayor limitación en la aceptación comercial de los jugos de frutas cítrica. La Naringinasa actúa sobre la Naringina hidrolizándola en la no amarga naringenina por medio de sus dos actividades; una de α-l-rhamnosidasa (EC ) que hidroliza ala naringina en prunina y otra de β-d-glucosidasa (EC ) para hidrolizar a la prunina en naringenina compuesto insípido. (Chandler y Nicol, 1975; Habelt y Pittner, 1980). Es importante mencionar que también existen procesos no enzimáticos para lograr el desamargor de los jugos de frutas cítricas sin embargo estos presentan desventajas no solo desde el punto de vista económico, sino también tecnológico, por lo que para asegurar la eficiencia del proceso de desamargor se sugiere implementar el uso de enzimas. Además, las enzimas pueden inactivarse fácilmente cuando se considere que ya han realizado su misión, quedando entonces asimiladas el resto de las proteínas presentes en el alimento (Montes et al., 2002). La aplicación de enzimas provenientes de especies de hongos filamentosos es una constante en el procesado de alimentos. Tal es el caso de la naringinasa que por razones de viabilidad es principalmente producida a partir de microorganismos como Aspergillus niger (Brand y Salomons, 1965) quien es considerado el mejor productor de naringinasa extracelular y Penicillium decumbens (Fulumoto y Okado, 1973) entre otros. Sin embargo la producción de la enzima depende de la fuente de carbono de la cual parta el microorganismo ya que la expresión de la enzima es inducida. En el presente trabajo se evaluó el comportamiento cinético de la naringinasa de Penicillium decumbens in vitro para ser empleada como parámetro de control en la evaluación de naringinasa producida por Aspergillus niger ATCC 1015.

3 MATERIALES Y MÉTODOS Incubadora, Fotocolorímetro, Balanza analítica, Material común de laboratorio; Naringinasa de Penicillium decumbens, glucosa, ácido 3,5.dinitrosalicílico. Efecto de la concentración de la naringinasa de P. decumbens sobre la hidrólisis de naringina. Efecto del tiempo en la velocidad de hidrolisis de la naringina. Curva tipo de naringinasa. Determinación de azúcares reductores por el método del ácido 3,5-dinitrosalicìlico

4 DESARROLLO Para el estudio del efecto de la concentración de la Naringinasa de P. decumbens sobre la hidrólisis de la Naringina se preparó una solución de Naringina 0.005M en buffer de citratos 0.05 ph 4.5 de la cual siempre se adicionó 1.9 ml a cada tubo de ensayo, además de diferentes soluciones de naringinasa de 10, 30, 50, 75, 100, 125 y 150 µg/ml; las cuales fueron elaboradas a partir de una solución concentrada de 1500 µg/ml, siendo siempre la alícuota de 0.1ml. Así el volumen total de cada tubo de ensayo fue de 2ml. Cada ensayo se incubo durante 15 minutos tiempo en el cual se llevaría a cabo la hidrólisis de la Naringina por la naringinasa y se obtendría glucosa como producto final ya que la cantidad de glucosa producida es directamente proporcional a la cantidad de naringenina producida por dicha hidrólisis. Terminado el tiempo de reacción la reacción se detuvo con la adición de 4 ml de DNS y se calentó durante 5 minutos para revelar cada tubo, los cuales una vez fríos fueron leídos en el fotocolorímetro con filtro verde. Para el estudio del efecto del tiempo en la velocidad de hidrolisis de la Naringina se seleccionó del estudio anterior una concentración de Naringinasa a la cual se observara claramente la hidrólisis de la Naringina, dicha concentración se mantuvo constante durante todo el experimento, se emplearon diferentes tiempos los cuales fueron 5,10, 20, 30, 40, 50, 60 minutos adicionando a cada tubo de ensayo 1.9ml de Naringina 0.005M y 0.1ml de Naringinasa. Para el montaje de la curva tipo de naringinasa una vez conocidos tanto la concentración de Naringinasa a emplear (50 µg/ml) y el tiempo de hidrólisis más adecuado para observar tal efecto (10 min), se preparó una solución de Naringinasa en concentración de 50 µg/ml en buffer de citratos M ph 4.5, la concentración de la Naringina empleada fue de 0.005M y se emplearon los siguientes volúmenes: 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1, 1.2, 1.4, 1.6 y 1.8 ml. El tiempo de incubación fue de 10 minutos, posteriormente la reacción fue detenida agregando 4 ml de DNS y los tubos fueron puestos a ebullición durante 5 minutos, una vez fríos se llevo a cabo la lectura en un fotocolorímetro con filtro verde. Para realizar la conversión de Unidades Klett a µg/ml de todos los resultados obtenidos en los tres anteriores experimentos se monto una curva patrón de glucosa la cual no se muestra en los resultados, para lo cual se prepararon 10 tubos con solución de glucosa y agua y cada un representa una concentración en µg/ml, tal como se muestra en la Tabla I. Una vez preparados se les adicionó DNS y se llevaron a ebullición los tubos durante 5 minutos. Una vez fríos los tubos se leyeron en un fotocolorímetro con filtro verde.

5 Tabla I: Curva patrón de Glucosa Solución de Glucosa [1000µg/ml] H 2 O ml [µg/ml]

6 RESULTADOS Efecto de la concentración de la naringinasa de P. decumbens sobre la hidrólisis de Naringina. Concentración UK µg/ml Efecto del tiempo en la velocidad de hidrolisis de la Naringina. Tiempo UK min

7 Curva tipo de naringinasa. [Naringina] UK µg/ml promedio A partir de los resultados obtenidos se calcularon las curvas de Michaelis- Mentes, lineweaberburk, Eadi-Hoffsten y Agustinson. Michaelis- Mentes lineweaberburk Eadi-Hoffsten Agustinson [s] V 1/[S] 1/V v/[s] [S]/V

8 V max = 2017 Km=2817 Curva V max Km Michaelis-Mentes Lineweaverburk Eadie-Hoffsten Agustinson

9 DISCUSIÓN En el grafico de efecto de la concentración de la naringinasa de P. decumbens sobre la hidrólisis de Naringina se observa como el aumento de la concentración de enzima adicionada se refleja en un incremento en la concentración de azucares reductores en un mismo tiempo, la concentración elegida en base a este experimento para montar la curva tipo de naringinasa es de 50 µg/ml. A demás también se observo que el tiempo de incubación empleado (15 minutos) provee una medida excesiva del grado de hidrólisis. El objetivo de realizar el experimento de efecto del tiempo en la velocidad de hidrolisis de la Naringina fue encontrar un tiempo adecuado al cual se lleve a cabo la hidrólisis de la Naringina de manera que sea suficiente pero no excesiva para evitar subestimar o sobrestimar los resultados, en la grafica de efecto del tiempo en la velocidad de hidrólisis se observa que a mayor tiempo de incubación es mayor el grado de hidrólisis, y que un tiempo adecuado para montar la curva tipo de naringinasa es de 10 minutos. Una vez obtenidos los parámetros de concentración de Naringinasa a emplear y tiempo de hidrólisis se prosiguió a montar la curva tipo de Naringinasa y en base a los resultados de UK obtenidos de esta y haciendo uso de la curva patrón de glucosa se calcularon las concentraciones reales en µg/ ml que representa cada volumen empleado de Naringina 0.005M, dichos resultados fueron empleados para trazar las curvas de Michaelis- Mentes, lineweaberburk, Eadi-Hoffsten y Agustinson donde se observa que el grafico de Michaelis muestra la tendencia tradicional de esta curva al igual que las demás de las cuales se tomarán los valores de Vmax y Km para comparar la hidrólisis de la naringinasa producida por Aspergillus niger ATCC 1015.

10 CONCLUSIONES La concentración y tiempo de hidrólisis adecuados para montar la curva tipo de naringinasa es de 50 µg/ml y 10 min respectivamente; para Michaelis Mentes se encontró una Vmax= 316 µg/ml y la Km= 304 µg, para Lineweaverburk Vmax= µg/ml y una Km= µg, para Eadie-Hoffsten una Vmax= 2017 µg/ml y una Km= 2817 µg y para Agustinson una Vmax= µg/ml y una Km= µg.

11 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Bram, B., and GL. Solomons. (1965); Production of the enzyme naringinasa by Aspergillus niger, Appl Microbiol, 13, Chandler, BV. and KJ. Nicol. (1975. Some relationships of naringina: their importance in orange juice bitterness, CCCSIRO Food Res Quart, 35, Fukumoto J, Okada S. Naringinase. (1973); Production by fermentation, Japannese Patent, 7,306, Habelt, K., and F. Pittner. (1980); A rapid method for the determination of naringina, pruning, and naringina applied to the assay of naringinasa, Anal Biochem, 134, Ito, T., and Y. Takiguchi. (1970); Naringinase production by Cochibolus miyabeanu. Japanese Patent, 7,014, Montes, Mª del C., and I. Magaña. (2002); Enzimas con aplicación industrial, Avances y perspectivas, 21,

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