APLICACIÓN DE LA METODOLOGÍA MOLECULAR I

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1 APLICACIÓN DE LA METODOLOGÍA MOLECULAR I DIGANÓSTICO DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS Amplificación de la Señal en DNA Ramificado Amplification) (Branched DNA Singal Es un sistema similar al ELISA, en el cual en un placa se han depositado sondas de captura complementarias al genoma viral, posteriormente se adicionan otras sondas complementarias que incluyen una secuencia sobresaliente capaz de unirse a las sondas amplificadoras de la señal, las cuales han sido sintetizadas con una estructura ramificada donde cada rama es capaz de unir 3 moléculas de fosfatasa alcalina, lo cual permite que la señal sea lo suficientemente alta por cada sonda anclada. Finalmente se introduce un substrato quimioluminiscence (dioxetano) que activado por la fosfatasa alcalina genera una señal fácilmente cuantificable por un lector de ELISA. Se utilizan patrones de concentración conocida para generar una curva de calibración donde se extrapolan los datos obtenidos de los pacientes. El sistema es muy útil para diagnóstico de HIV durante el periodo de ventana inmunológica, periodo durante el cual el resultado del ELISA puede ser negativo, para el monitorio de terapia y como valor pronóstico. Actualmente mediante secuenciación se puede hacer sub-tipificación viral, lo cual es altamente útil en la elección de la terapia a seguir (la tasa de generación viral es tan acelerada que el seguimiento de cepas mutantes debe ser constante). Además de sus aplicaciones en HIV, es de gran utilidad en HCV y HBV. DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES GENÉTICAS Diagnóstico en Cáncer de Seno El cáncer de seno pasó a ser el cáncer más frecuente en las mujeres colombianas (superando el cáncer de cérvix). Dos genes llamados BRCA1 y BRCA2 han sido identificados como los responsables de la mayoría de los cánceres de seno y ovario de tipo hereditario. Mutaciones germinales en estos genes inactivan su función supresora de tumores. Las mutaciones en estos genes se transmiten de generación en generación de forma autonómica dominante. Los diferentes grupos poblacionales presentan variaciones tanto en la frecuencia como en la distribución de las mutaciones en estos genes. En países industrializados, se ha implementado una técnica diagnóstica como parte de las herramientas para combatir el cáncer de seno y ovario oportunamente.

2 La identificación de grupos de alto riesgo, como son los portadores de mutaciones en BRCA constituye una herramienta fundamental en la batalla contra esta enfermedad, teniendo en cuenta que las estrategias contra el cáncer son más eficaces, cuanto más temprano se implementen. De todos los cánceres de seno y ovario 33% se agrupan en familias y se ha visto que hasta un 20% de éstos se relacionan con mutaciones en BRCA. Así, hasta un 8% de los casos de cáncer de seno y ovario son atribuibles a BRCA1 o RBCA2. La mayoría de las mutaciones en BRCA son inclusiones, sustituciones o deleciones que generalmente producen una proteína truncada no funcional. Todas estas en general mutaciones puntuales, lo que demuestra que cambios en un solo nucleótido puede inactivar su función. Los genes BRCA están involucrados en procesos celulares fundamentales como control del ciclo celular, reparación del DNA y regulación transcripcional. Se les atribuye también funciones de mantenimiento de la integridad del genoma con un rol en el crecimiento, diferenciación celular y activación transduccional GENÉTICA FORENSE Estudia básicamente unas regiones del DNA que presentan variabilidad entre los distintos individuos, es decir, estudia regiones polimórficas del DNA. Así, analizando un determinado número de regiones polimórficas, las probabilidad de que dos individuos sean genéticamente iguales es prácticamente nula (excepto en el caso de gemelos univitelinos). La identificación con DNA o huella genética se basa en el estudio de una serie de fragmentos de DNA presentes en todos los individuos pero que poseen la característica de ser altamente variables o polimórficos entre los mismos. El análisis de un determinado número de estas secuencias o fragmentos de DNA permite identificar a un individuo con una probabilidad muy cercana al 100%. El DNA que se utiliza para la identificación en genética forense es no codificante. Para analizar dichos polimorfismos los laboratorios de genética forense utilizan una serie de técnicas que están en continua evolución, consiguiendo que cada vez la identificación sea más precisa y rápida. La aplicación de técnicas moleculares en la solución de casos judiciales se produjo en 1985, cuando el Ministro de Interior Británico solicitó la ayuda de Alec J. Jeffreys, profesor de genética de la universidad de Leicaster. Los primeros casos de criminalística fueron resueltos gracias a la técnica de los RFLP s (Fragmentos de Restricción de Longitud Polimórfica).

3 El profesor Jeffreys descubrió la existencia de unas regiones minisatélites hipervariables dispersas por el genoma humano que al ser tratadas con enzimas de restricción generaban fragmentos de longitud variable. Las diferencias en el tamaño de estos fragmentos se deben a que estas regiones consisten en un determinado número de repeticiones en serie de una secuencia dada, las cuales varían de un individuo a otro. Con el uso de la técnica PCR, muestras tan pequeñas como un pelo con raíz, una minúscula mancha de sangre o semen, son suficientes en muchos casos para llevar a cabo un análisis de identificación genética. El uso de marcadores microsatélites (secuencias cortas de DNA) permite la posibilidad de obtener resultados positivos de amplificación cuando el DNA se encuentra degradado, ya que es probable que dichos fragmentos no hayan sido digeridos. Actualmente gracias a los avances tecnológicos se utilizan técnicas como electroforesis en capilar en columnas de sílica, lo cual genera resultados en menor tiempo. Es probable que la próxima revolución la constituyan los llamados biochips ; una combinación entre técnicas electrónicas que utilizan microprocesadores informáticos y material biológico. La principal característica es su capacidad de generar información en muy poco espacio ya que posibilitan el procesamiento de varios ensayos al tiempo. BITOECNOLOGÍA OBTENCIÓN DE PROTEINAS DE MAMÍFEROS Una serie de hormonas como la insulina, la hormona del crecimiento, factores de coagulación, etc... tienen un interés médico y comercial muy grande. Antes, la obtención de estas proteínas se realizaba mediante su extracción directa a partir de tejidos o fluidos corporales. En la actualidad, gracias a la tecnología del ADN recombinante, se clonan los genes de ciertas proteínas humanas en microorganismos adecuados para su fabricación comercial. Un ejemplo típico es la producción de insulina que se obtiene a partir de la levadura Sacharomyces cerevisae, en la cual se clona el gen de la insulina humana. OBTENCIÓN DE VACUNAS RECOMBINANTES El sistema tradicional de obtención de vacunas a partir de microorganismos patógenos inactivos, puede comportar un riesgo potencial. Muchas vacunas, como la de la hepatitis B, se obtienen actualmente por

4 ingeniería genética. Como la mayoría de los factores antigénicos son proteínas lo que se hace es clonar el gen de la proteína correspondiente. INGENIERÍA GENÉTICA EN AGRICULTURA - PLANTAS TRANSGÉNICAS Mediante la ingeniería genética han podido modificarse las características de gran cantidad de plantas para hacerlas más útiles al hombre, son las llamadas plantas transgénicas. Las primeras plantas obtenidas mediante estas técnicas fueron un tipo de tomates, en los que sus frutos tardan en madurar algunas semanas después de haber sido cosechados. Recordando que la célula vegetal posee una rígida pared celular, lo primero que hay que hacer es obtener protoplastos (los protoplastos son células desprovistas de pared celular, que se consigue empleando enzimas que destruyen la lámina media y desorganizan la parte de celulosa). Estas células pueden someterse a tratamientos que modifiquen su patrimonio genético. Las técnicas se clasifican en directas e indirectas. Entre las técnicas indirectas cabe destacar la transformación de células mediada por Agrobacterium tumefaciens Esta bacteria puede considerarse como el primer ingeniero genético, por su particular biología. Esta bacteria, presente en el suelo, es patógena de muchas plantas a las que produce un tumor conocido como "agalla de cuello". Penetra en los tejidos vegetales causando una proliferación celular. Durante el contacto con las células vegetales la bacteria transfiere a las células vegetales un plásmido llamado Ti (inductor de tumores). Este plásmido se integra en el ADN del cromosoma de la célula vegetal. Este plásmido transferido o T ADN contiene los genes oncogénicos (onc) cuya expresión provoca una mayor producción de hormonas de crecimiento, éstas son las que inducen las divisiones celulares que dan origen a la formación del tumor o agalla. Este fenómeno natural es empleado para utilizar a la bacteria Agrobacterium tumefaciens como vector de los genes que se desean introducir en una célula vegetal, con lo que se transforma dicha célula, la cual puede regenerar, por micropropagación, una planta entera que será transgénica. Si en el plásmido Ti se eliminan artificialmente los genes onc y se sustituyen por otros genes que interese clonar, se habrá obtenido un sistema muy eficaz para introducir ADN interesante a la planta, al mismo tiempo que se habrá evitado la aparición de la enfermedad. En la transfección vegetal con Agrobacterium se ha ensayado un marcador inusual: el gen de la enzima luciferasa, de las luciérnagas. El sustrato de esta enzima es una proteína llamada luciferina, que con ATP y oxígeno desprende luz. Plásmidos Ti con este marcador, se transfirieron a células de tabaco, con las que se formaron nuevas plantas. Las nuevas plantas obtenidas se regaron en la

5 oscuridad con agua y luciferina disuelta. El resultado es que las plantas se iluminan como si fueran unas bombillas de poca potencia o un dibujo de un anuncio fluorescente. Entre las técnicas directas, se pueden citar la electroporación, microinyección, uso de liposomas y métodos químicos. RESISTENCIA A HERBICIDAS, A INSECTOS Y A ENFERMEDAD MICROBIANAS. Ya se dispone de semillas de algodón, que son insensibles a herbicidas. Para la resistencia a los insectos se utilizan cepas de Bacillus thuringiensis que producen una toxina (toxina - Bt) dañina para las larvas de muchos insectos, de modo que no pueden desarrollarse sobre las plantas transgénicas con este gen. Respecto a los virus se ha demostrado que las plantas transgénicas con el gen de la proteína de la cápsida de un virus, son resistentes a la invasión de dicho virus. Incremento del rendimiento fotosintético Para ello se transfieren los genes de la ruta fotosintética de plantas C 4 que es más eficiente. Síntesis de productos de interés comercial Existen ya plantas transgénicas que producen anticuerpos animales, interferón, e inclus o elementos de un poliéster destinado a la fabricación de plásticos biodegradables Asimilación de nitrógeno atmosférico Aunque no hay resultados, se ensaya la transfección del gen nif responsable de la nitrogenasa, existente en microorganismos fijadores de nitrógeno, y que permitiría a las plantas que hospedasen dicho gen, crecer sin necesidad de nitratos o abonos nitrogenados, aumentando la síntesis de proteínas de modo espectacular. LA TRANSGÉNESIS EN ANIMALES La transgénesis se puede definir como la introducción de ADN extraño en un genoma, de modo que se mantenga estable de forma hereditaria y afecte a todas las células en los organismos multicelulares. Generalmente, en animales, el ADN extraño, llamado transgen, se introduce en zigotos, y los embriones que hayan integrado el ADN extraño en su genoma, previamente a la primera división, producirán un organismo transgénico; de modo que el transgén pasará a las siguientes generaciones a través de la línea germinal (gametos).

6 Entre las aplicaciones de los animales transgénicos se pueden destacar: La posibilidad de estudiar a nivel molecular el desarrollo embrionario y su regulación. Manipular de forma específica la expresión génica in vivo. Estudiar la función de genes específicos. Poder utilizar a mamíferos como biorreactores para la producción de proteínas humanas. La corrección de errores innatos de metabolismo mediante terapia génica. La transgénesis puede efectuarse siguiendo dos estrategias distintas: 1. Transgénesis por microinyección de zigotos Desde que en 1982 se obtuviera un ratón transgénico, la producción de animales transgénicas es cada vez más cotidiana, existiendo ya animales transgénicos de las siguientes especies: ratón, rata, conejo, cerdo, vaca, cabra y oveja. La técnica se realiza, fundamentalmente por microinyección y se realiza de la siguiente forma: En la primera fase, se aísla un número grande de óvulos fertilizados. Se consigue sometiendo a las hembras a un tratamiento hormonal para provocar una superovulación. La fertilización puede hacerse in vitro o in vivo. En la segunda fase, los zigotos obtenidos se manipulan uno a uno y con una micropipeta a modo de aguja, se introduce una solución que contiene ADN. En la tercera fase, estos óvulos son reimplantados en hembras que actuarán como nodrizas permitiendo la gestación hasta término. Por último, tras el destete de los recién nacidos, éstos se chequean, para ver si ha ocurrido la incorporación del transgén. 2. Transgénesis por manipulación de células embrionarias. Una estrategia más poderosa para la transgénesis implica la introducción de ADN extraño en células embrionarias totipotentes(células ES) o células embrionarias madres (células EM). Estas células se toman del interior de la blástula en desarrollo y se pasan a un medio donde se tratan con distintos productos con lo que se conseguirá que las células no se diferencien, y se mantiene su estado embrionario El ADN extraño se introduce en las células ES mediante diversas técnicas, posteriormente las células transfectadas s on reintroducidas en una blástula y ésta reimplantada en una hembra.

7 Con esta técnica los neonatos son quimeras ; pero mediante el cruce de éstas se consiguen animales transgénicos con aquellas quimeras que hayan incorporado el transgén en su línea germinal Cuando la integración del transgén ocurre después de la primera división celular, el animal es quimérico, lo que quiere decir que las células de su cuerpo tienen diferentes características, según tengan o no el transgén, así en la "ovecabra" quimera entre oveja y cabra, las células de su piel, unas producían lana y otras pelo CLONACIÓN DE ANIMALES El principio de la clonación está en la obtención de organismos idénticos genéticamente, y por tanto morfológica y fisiológicamente, como lo son dos gemelos univitelinos. Esto ha sido el sueño de muchos ganaderos, que han deseado que todo su ganado tuviera las cualidades de algún ejemplar especialmente bueno. Se pueden utilizar dos métodos para conseguir clones de animales: 1. Por DISGREGACIÓN DE CÉLULAS EMBRIONARIAS.Se basa en el mismo principio por el que nacen gemelos de forma natural. Se pueden separar las células de un embrión en diferentes estados de desarrollo, desde el estado de 2 células hasta el estado de mórula. Cada célula separada puede funcionar como un zigoto que puede desarrollarse para dar un individuo completo. 2. Por TRANSFERENCIA NUCLEAR. Se toman células embrionarias en fase de mórula o blástula, obtenidas por disgregación, se cultivan in vitro, y después se transfieren a ovocitos a los que se les ha quitado el núcleo. Se provoca la fusión de las dos células animales de modo que el núcleo de la célula embrionaria quede en el interior del ovocito, pudiendo éste empezar a funcionar como un zigoto. Cuanto más diferenciadas estén las células donantes de material genético, más difícil es conseguir la reprogramación de dicho material genético para que pueda iniciar la diferenciación de la célula receptora. Actualmente es posible obtener clones de células totalmente diferenciadas de un animal adulto que actúan como donantes de su material genético, como ocurrió en el caso de la famosa oveja Dolly.

8 Obtención de una cerda transgénica Un gen híbrido que contiene el gen humano que codifica la síntesis de una proteína de interés biológico junto con el promotor del gen que codifica una proteína de la leche de rata, se introducen por microinyección en un óvulo de cerda fecundado. El desarrollo de ese óvulo da lugar a un animal transgénico que tiene en todas sus células el gen híbrido. Debido al promotor elegido, ese gen solamente se expresa en la glándula mamaria de la cerda induciendo la producción de la proteína humana en la leche. El ganado transgénico que se emplea para producir proteínas terapéuticas, debe contener en el ADN extraño de sus células, además del gen codificante de la proteína, una secuencia o promotor que haga que se exprese dicho gen en unas determinadas células solamente. Por ejemplo, si se quiere que la proteina se produzca junto con la leche, el transgén se fusiona con una secuencia reguladora de una proteína de la leche, con lo que la proteína sólo se formará en las células de glándulas mamarias. Esto es lo que se hizo con la oveja Tracy en 1992, la primera oveja que produjo una proteína humana, la alfa-antitripsina bajo la dirección del promotor ovino de la beta-lactoglobulina. Dicha proteína se produce en una cantidad de 35 g/l, la cual se emplea para curar el edema pulmonar. Lo mismo se ha hecho para la famosa cerda Genie, que fabrica en su leche la proteína C humana que controla la coagulación sanguínea y es necesaria para los hemofílicos.