Cardiomioplastia celular: investigación y desarrollo

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1 Vol. 13 Nº 1 CARDIOVASCULAR RISK FACTORS Cardiomioplastia celular: investigación y desarrollo J. C. CHACHQUES Departamento de Cirugía Cardíaca. Hospital Europeo Georges Pompidou. París. Francia. RESUMEN El trasplante de células miogénicas y angiogénicas en el miocardio se ha denominado "cardiomioplastia celular" y los actuales en marcha están dirigidos hacia la regeneración de cicatrices postinfarto. El trasplante de mioblastos y de células de origen medular mejora la función cardíaca por un incremento de la contractilidad, incremento del grosor de la pared infartada, efecto antiremodelado ventricular, desarrollo de angiogénesis y mejoría de la función diastólica por un incremento de la elasticidad de la zona infartada. Los ensayos clínicos realizados sugieren que la cardiomioplastia celular es una buena estrategia para compensar la pérdida brutal de células cardíacas después de un infarto, aunque para evaluar objetivamente los resultados es necesario llevar a cabo ensayos clínicos randomizados con seguimiento a largo plazo. Cuando los mecanismos responsables de los beneficios funcionales sean mejor conocidos, podrá establecerse la familia celular y la vía de administración, en función del tipo de enfermedad causante de la insuficiencia cardíaca. INTRODUCCIÓN Los avances recientes en el dominio de la biología celular y molecular permiten la realización de cultivos celulares para ser utilizados en cardiología (infartos de miocardio), cirugía vascular (isquemia crítica de miembros inferiores), oftalmología (trasplante de células corneales en úlceras o quemaduras), neurología (enfermedades de Parkinson, de Huntington, lesiones medulares), hepatología (trasplante de hepatocitos), diabetes (trasplante de células beta de islotes de Langerhans), miopatías (distrofia de Duchenne), ortopedia (trasplante de condrocitos en la articulación de la rodilla), dermatología (trasplante de queratocitos y fibroblastos en quemados). Numerosos estudios experimentales han sido realizados en esas disciplinas y las primeras aplicaciones clínicas se están efectuando en estos momentos. El trasplante de células "miogénicas" y/o "angiogénicas" en el miocardio se ha denominado "Cardiomioplastia Celular", y se realiza con dos objetivos diferentes pero potencialmente complementarios. Se trata en primer lugar de suplir una parte de las células cardíacas que perdieron su capacidad de trabajo útil, y en segundo lugar de utilizar esas células trasplantadas para inducir el desarrollo de nuevos vasos sanguíneos (angiogénesis). Los estudios más avanzados están orientados hacia la regeneración de cicatrices recientes post-infartos y en este sentido se dirige específicamente esta línea de investigación, en la cual nuestro equipo trabaja desde el año Es probable que la puesta en práctica del trasplante de células normales adultas permitirá en el futuro implantar células genéticamente modificadas. INSUFICIENCIA CARDÍACA La muerte de cardiomiocitos adultos consecutiva a 19

2 CARDIOVASCULAR RISK FACTORS FEBRERO los accidentes isquémicos, provoca frecuentemente el desarrollo de una insuficiencia cardíaca congestiva. Es generalmente admitido que los cardiomiocitos pueden reproducirse solamente durante el desarrollo embrionario y fetal. En los adultos, los cardiomiocitos conservan de manera muy limitada su capacidad proliferativa. En los pacientes adultos, la desaparición o pérdida de una parte de la población de cardiomiocitos no es compensada por la multiplicación de cardiomiocitos restantes y en el lugar del tejido funcional, se desarrolla una cicatriz fibrosa aquinética. La sobrecarga de trabajo generada, la modificación de la geometría ventricular y la distensión de la cicatriz fibrosa producen la dilatación progresiva que evoluciona hacia la insuficiencia cardíaca congestiva terminal. Frente a esta situación, las opciones terapéuticas no son numerosas. A pesar de que el tratamiento médico mejora parcialmente la supervivencia del paciente, el pronóstico permanece sombrío, ya que alrededor del 60% de pacientes sobreviven al año y solamente 30% sobreviven a los 5 años. Los trasplantes cardíacos están limitados por la escasez de donantes, las complicaciones y el costo de la inmunosupresión, así como por los rechazos potenciales. La asistencia circulatoria mecánica es esencialmente empleada en pacientes que esperan el trasplante cardíaco. La asistencia ventricular por cardiomioplastia dinámica utilizando el músculo dorsal ancho electroestimulado permite una mejoría clínica y funcional de pacientes muy seleccionados. La reducción ventricular por la técnica de Batista no ha encontrado una plaza definitiva en el arsenal terapéutico de la insuficiencia cardíaca, ya que la mortalidad operatoria es elevada, existiendo además riesgo importante de arritmias malignas y de recidiva de la dilatación ventricular. BIOLOGÍA CELULAR El desarrollo de la biología celular permite crear nuevas técnicas y de hecho el concepto de cardiomioplastia celular reposa sobre el aporte de células exógenas al miocardio enfermo, tratando de suplir de células vivas un territorio cicatricial fibroso hipo o aquinético localizado (infarto), que modifica la geometría cardíaca (remodelado) e induce una sobrecarga sobre los cardiomiocitos restantes, alterando la función ventricular. Este nuevo concepto terapéutico utilizando células de la médula ósea o provenientes de una biopsia de músculo esquelético, deriva del concepto de regeneración celular y tisular (bio-asistencia cardiocirculatoria). El objetivo fundamental de esta nueva técnica en desarrollo es reparar, reemplazar, o estimular la función biológica de células alteradas, así como restituir una masa miocárdica funcional para mejorar la contractilidad ventricular. TERAPIA CELULAR MIOGÉNICA Y ANGIOGÉNICA: EVOLUCIÓN HISTÓRICA Estudios de factibilidad utilizando cardiomiocitos Desde 1955 ha sido posible aislar cardiomiocitos a partir de una biopsia de miocardio, utilizando la digestión con tripsina que elimina el tejido conjuntivo. Las características fisiológicas, bioquímicas y biológicas de los cardiomiocitos son diferentes en cada período de la vida. En la decada del 90 se utilizó una línea celular para probar la factibilidad de la inyección de células de origen cardíaco dentro del miocardio. El trasplante sinérgico de esta línea, denominada AT-1, se tradujo en una sobrevida a largo plazo de dicho trasplante en el seno del tejido huésped sin encapsulación ni arritmogenia. A pesar de que la línea fue potencialmente cancerígena y de la pérdida de ciertas propiedades de los cardiomiocitos adultos, este primer trabajo mostró la posibilidad de introducir en el seno del miocardio elementos celulares con el objetivo de restaurar una función ventricular deprimida. Posteriormente se desarrolló este concepto utilizando cardiomiocitos primarios fetales. Después del trasplante los cardiomiocitos se integraron en el miocardio del huésped, desarrollando notablemente las fusiones intercalares características del tejido cardíaco. Utilizando células transfectadas "in vitro" mediante un gen portador, se demostró la posibilidad del trasplante de cardiomiocitos genéticamente modificados dentro del miocardio del ratón.

3 Vol. 13 Nº 1 CARDIOVASCULAR RISK FACTORS Estudio de factibilidad utilizando mioblastos Esto fue probado en el trasplante de mioblastos con la ayuda de la línea celular C2 C12. Las células inyectadas en condiciones sinérgicas formaron miotubos (células contráctiles multinucleadas), demostrando de esa manera signos de diferenciación muscular esquelética, sin arritmogenia. En este sentido, no se demostró evidencia de acoplamiento eléctrico entre los cardiomiocitos y los miotubos. La línea celular C2 C12 puede convertirse en carcinogénica. Estudio de funcionalidad (cardiomiocitos) Diversos estudios han demostrado la supervivencia y la contractilidad de los trasplantes de cardiomiocitos fetales realizados en el tejido celular subcutáneo de la rata. El tejido neoformado dentro de esta zona ectópica fue contráctil durante varios meses e indujo una angiogénesis local. Varios equipos desarrollaron lesiones de criolesión miocárdica localizada, por congelación rápida de una parte del ventrículo izquierdo. Se demostró que el trasplante celular al término de 4 semanas reducía la expansión cicatricial, aumentaba la presión sistólica (evaluada en una columna de Langendorff) y promovía la angiogénesis. El desarrollo reciente de sondas ecocardiográficas de alta frecuencia (15 MHz) permite registrar 160 imágenes por segundo, esta adquicisión muy rápida es adaptada a la dimensión del miocardio de pequeños animales. Diversos equipos demostraron una mejoría de la función ventricular izquierda después de implantes celulares. Los mecanismos de acción serían el aumento directo de la masa contráctil, una estimulación local de la angiogénesis o la liberación de factores de crecimiento todavía desconocidos. Como consecuencia los cardiomiocitos fetales mejoran globalmente la función ventricular izquierda en los modelos de infartos de miocardio. Existen todavía problemas mayores en cuanto a la utilización clínica de cardiomiocitos. En efecto, su origen fetal pone en primer plano los problemas éticos así como la cantidad de tejido fetal necesario para realizar un solo trasplante. Hay que destacar que el mayor problema generado por la utilización de células embrionarias y fetales es la producción de teratomas después de ser implantadas. Por otra parte, el origen necesariamente alogénico de este tipo celular, produce un problema crucial en cuanto a la inmunosupresión necesaria que vendría a unirse al tratamiento de pacientes fuertemente medicados. Estos problemas fundamentales han hecho que las investigaciones se orienten hacia soluciones alternativas y a proponer el trasplante de células de la médula ósea (stem cells) y de células musculares esqueléticas, conociéndose ya por diversas investigaciones que ambas células pueden sobrevivir y permanecer estables con el tiempo en el interior del miocardio sano o patológico. Estudio de funcionalidad (mioblastos) Los primeros estudios de funcionalidad fueron realizados en modelos de trasplantes de mioblastos neonatales introducidos en el miocardio infartado de ratas. La formación de miotubos en esos modelos fue seguido de una fase de maduración caracterizada por una transición de cadenas pesadas de la miosina de forma rápida a la forma lenta que sería una forma de adaptación al ritmo cardíaco. Los marcadores específicos de tejido cardíaco no han sido identificados dentro de estas estructuras esqueléticas. En otros experimentos, fueron implantados microcristales piezoeléctricos en conejos para realizar estudios de funcionalidad en trasplantes autólogos de mioblastos, encontrando una mejoría en la función sistólica. Una correlación entre los estudios funcionales, los estudios histológicos y los estudios inmunohistoquímicos han puesto en evidencia el desarrollo de estructuras musculares esqueléticas diferenciadas dentro del tejido infartado, pero sin evidencia de un acoplamiento entre miotubos y cardiomiocitos. Los resultados obtenidos por los diferentes equipos sugieren una eficacia funcional del trasplante de mioblastos dentro del tejido infartado. El mecanismo de acción de esta miogénesis no es bien conocido y los miotubos formados pudieran participar en la contracción cardíaca; sin embargo el acoplamiento eléctrico y mecánico del huésped con el trasplante es tema de controversia. La hipótesis que sostenía que la inyección de mioblastos estimulaba localmente la angiogenesis nunca 21

4 CARDIOVASCULAR RISK FACTORS FEBRERO fue demostrada. El nuevo tejido formado pudiera, por sus propiedades físicas proveer de resistencia o de elasticidad que se opondría a la expansión de la cicatriz fibrosa, mejorando de una manera indirecta la compliance cardíaca y la función diastólica. La demostración de angiogenesis en infartos fue obtenida después del implante de células provenientes de la médula ósea (angioblastos) o de células endoteliales obtenidas a partir de la íntima de arterias y venas. Células de origen medular El estroma de la médula ósea contiene células "madres" indeferenciadas con un fuerte potencial proliferativo. En medio de estas células pudieran encontrarse los precursores de los cardiomiocitos y de las células satélites, porque la diferenciación sería dependiente de condiciones de crecimiento y de interacción con el medio ambiente. En condiciones de cultivo adecuado, estas células estromales constituyen un conjunto de células trasplantables. Para evitar que estas células se diferencien en fibroblastos después de ser implantadas en una cicatriz de infarto, deberían ser pre-condicionadas "in vitro". Con ese objetivo se han utilizado co-cultivos con cardiomiocitos y 5-azacitidina (sustancia tóxica). Nuestro grupo ha realizado eficazmente electro-estimulación in vitro de los cultivos celulares durante 2 semanas, utilizando marcapasos. Nuevos conceptos para investigar El cultivo masivo de cardiomiocitos adultos autólogos representaría la situación óptima. Sin embargo, en el estado actual de nuestros conocimientos, la estimulación de la capacidad proliferativa de esas células no es todavía realizable. Una solución intermedia consistiría en forzar la diferenciación cardiogénica de células autólogas relativamente indiferenciadas o los fibroblastos localizados en la pared ventricular. Los mecanismos promotores de la diferenciación no son totalmente conocidos ni controlados. Este procedimiento ha sido denominado "cardiomioplastia molecular". Las células musculares sin inervación no se contraen espontáneamente cuando son trasplantadas en el miocardio. La asociación de la electroestimulación cardíaca a la terapia celular transformaría un procedimiento pasivo en una "terapia dinámica activa", ya que las células implantadas serían estimuladas conjuntamente con la pared ventricular. MECANISMOS DE ACCIÓN DE LA CARDIOMIOPLASTIA CELULAR Hasta el presente, los estudios experimentales y clínicos han demostrado que la cardiomioplastia celular mejorará la función cardíaca por los siguientes mecanismos: Creación de una zona biológicamente activa, donde las células implantadas pueden organizarse en miotubos y en miofibras. Mejoría de la contractilidad, ya que esos miotubos y miofibras acompañan a las fibras cardíacas en su contracción. Producción de angiogénesis, a partir de las células de la médula ósea trasplantadas. Aumento del número de cardiomiocitos, a partir de células de la médula ósea diferenciadas. Aumento del espesor de la pared infartada, disminuyendo la disquinesia y el riesgo de formación de aneurismas o de ruptura ventricular. Efecto anti-remodelado ventricular, incluyendo una disminución de la dilatación. Mejoría de la función diastólica por aumento de la elasticidad de la zona infartada, ya que los fibroblastos son remplazados por mioblastos y miotubos. La magnitud de la mejoría de la función ventricular está en relación directa con el número de células implantadas. DISCUSIÓN La cardiomioplastia celular es una nueva vía biológica destinada a regenerar el miocardio ventricular. La utilización de células mononucleares seleccionadas a partir de extracción de médula ósea o de sangre periférica y la utilización de mioblastos cultivados en suero autólogo está exenta de complicaciones. Sin embargo, los estudios clínicos efectuados con mioblastos cultivados en suero

5 Vol. 13 Nº 1 CARDIOVASCULAR RISK FACTORS TABLA 1. VENTAJAS INCONVENIENTES MIOBLASTOS Resistentes a la isquemia No contráctiles. Denervadas: riesgo de atrofia CÉLULAS MÉDULA ÓSEA No necesitan cultivo in vitro Diferenciación dependiente del sitio receptor (pueden transformarse en fibroblastos) fetal bovino (FBS) demostraron arritmias ventriculares malignas y casos de muerte súbita. Por ese motivo, la mayoría de los protocolos que utilizan ese tipo de cultivos con suero heterólogo deben asociar la implantación definitiva de un desfibrilador automático. Si bien la terapia celular realizada mediante catéter transcutáneo fue realizada como procedimiento único por cardiólogos intervencionistas, la aplicación de células mediante cirugía fue asociada a revascularización coronaria (by pass) en pacientes con insuficiencia cardíaca secundaria a un infarto de miocardio. Esa táctica fue ordenada por diversos comités de ética hospitalarios. Esa asociación de procedimientos terapéuticos dificulta la interpretación de los resultados funcionales y de viabilidad miocárdica. La utilizacion de células madre adultas obtenidas a partir de la médula ósea tiene interés angiogénico y la potencialidad de generar cardiomiocitos. Sin embargo, existe siempre el riesgo potencial de una diferenciación de las células implantadas en fibroblastos, mimetizando la lesión de infarto cicatrizal. Con respecto a los mioblastos esqueléticos estos corren el riesgo de nunca contraerse, ya que no poseen inervación motriz, situación que puede evolucionar hacia la atrofia (Tabla 1). Para evaluar objetivamente la cardiomioplastia celular es necesario realizar a largo plazo estudios randomizados, para poder en un futuro ampliar las indicaciones a otros tipos de disfunción ventricular, como las miocardiopatías dilatadas no-isquémicas, la insuficiencia mitral isquémica y la enfermedad de Chagas. Esos estudios permitirán determinar el papel que desempeña la terapia celular en la regeneración miocárdica. CONCLUSIONES El trasplante de células en el miocardio se plantea como una estrategia que permite la compensación de una pérdida brutal de células cardíacas, después de un evento isquémico o degenerativo. El trasplante de células de origen muscular o de médula ósea se traduce en un beneficio funcional y en una mejoría de la viabilidad miocárdica. La asociación de ambos tipos celulares (de manera simultánea o sucesiva), permitirá realizar una "angiogénesis" y "miogénesis", mejorando la sobrevida de células implantadas. Este asociación de terapia celular será facilitada por el desarrollo de catéteres percutáneos (Tabla 2). Si la utilización de cardiomiocitos fetales no es propuesto actualmente dentro del plan clínico por razones éticas, inmunológicas y de teratogénesis, por el contrario la utilización de células musculares esqueléticas o de médula ósea autólogas es prometedora, asociadas o no a factores de crecimiento y más recientemente electroestimuladas, tratando de buscar un acople electromecánico efectivo. La utilización de células seleccionadas de la médula ósea (AC133) potencialmente cardiogénicas, constituye una nueva vía de investigación. Cuando los mecanismos responsables de los beneficios funcionales TABLA 2. Técnicas de implante celular Abordaje epicárdico Cirugía: convencional o mínimamente invasiva. Toracoscopia. Endoventricular Catéter para administración de células bajo control: Mapeo electromecánico en 3D. Fluoroscopia & ultrasonidos. Catéter compatible con resonancia magnética. Intravascular Catéter intracoronario. Abordaje venoso coronario o intravenoso sistémico. 23

6 CARDIOVASCULAR RISK FACTORS FEBRERO sean mejor conocidos, el trasplante celular intramiocárdico será considerado una estrategia adaptada a patologías, tales como la insuficiencia cardíaca post-isquémica y probablemente a la miocardiopatía dilatada. BIBLIOGRAFÍA 1. Kong GY, Soonpa MH, Klug MG, Field LJ. Long-term survival of AT-1 cardiomyocytes grafts in syngenic myocardium. Am J Physiol 1993; 264: Soonpa MH, Koh GY, Klug MG, Field LJ. Formation of nascent intercalated disks between grafted fetal cardiomyocytes and host myocardium. Science 1994; 264: Gojo S, Kitamura S, Hatano O, Takakusu A, Hashimoto K, Kanegae Y, Saito I. Transplantation of genetically marked cardiac muscle cells. J Thorac Cardiovasc Surg 1997; 113: Chiu RC, Zibaitis A, Kao Rl. Cellular cardiomyoplasty: myocardial regeneration with satellite cell implantation. Ann Thorac Surg 1995; 60, Murry CE, Wiseman RW, Schwartz SM, Hauschka SD. Skeletal myoblast transplantation for repair of myocardial necrosis. 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