Ensayos. biotecnológicos

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1 Ensayos biotecnológicos

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3 Ensayos biotecnológicos Salvador Camacho Garrido

4 Salvador Camacho Garrido EDITORIAL SÍNTESIS, S. A. Vallehermoso, Madrid Teléfono ISBN: Depósito Legal: M Impreso en España - Printed in Spain Reservados todos los derechos. Está prohibido, bajo las sanciones penales y el resarcimiento civil previstos en las leyes, reproducir, registrar o transmitir esta publicación, íntegra o parcialmente, por cualquier sistema de recuperación y por cualquier medio, sea mecánico, electrónico, magnético, electroóptico, por fotocopia o por cualquier otro, sin la autorización previa por escrito de Editorial Síntesis, S. A.

5 S Índice 1. Biotecnología Objetivos Mapa conceptual Glosario Biología molecular Tecnología Biotecnología Biotecnología. Toda una historia Biotecnología ayer Biotecnología hoy Biotecnología mañana La biotecnología en España Ventajas de la biotecnología Riesgos de la biotecnología Riesgos para el medio ambiente Riesgos para la salud Preocupaciones éticas y sociales Bioética Principios fundamentales de la bioética Resumen Actividades de autoevaluación El laboratorio biotecnológico Objetivos Mapa conceptual Glosario... 41

6 6 ENSAYOS BIOTECNOLÓGICOS 2.1. El laboratorio biotecnológico Niveles de seguridad de los laboratorios Material y aparatos Reactivos Técnicas de esterilización Cultivo de microorganismos Cultivos puros Preparación de medios Mantenimiento de cultivos microbianos Microorganismos implicados Cultivos celulares Tipos de cultivos celulares Medios de cultivos celulares Mantenimiento de cultivos celulares Buenas prácticas de laboratorio Toma de muestras Exudado nasal ADN Prevención de riesgos Riesgos biológicos Vías de infección Contención Plan de protección Formación Agentes biológicos. Clasificación Normas de asepsia y seguridad Higiene en el trabajo del laboratorio biotecnológico Limpieza y eliminación del material Residuos infecciosos Tratamiento de residuos infecciosos Equipos de protección Equipos de protección en el laboratorio Equipos de protección individual El trabajo en el laboratorio Cuaderno de laboratorio Informes de laboratorio El orden en el laboratorio Legislación Legislación sobre prevención de riesgos laborales Legislación sobre agentes biológicos Legislación sobre organismos modificados genéticamente Legislación sobre riesgos químicos Legislación sobre residuos Legislación sobre radiaciones ionizantes Notas técnicas de prevención Resumen Actividades de autoevaluación... 68

7 ENSAYOS BIOTECNOLÓGICOS 7 3. Técnicas de análisis de macromoléculas Objetivos Mapa conceptual Glosario Introducción Cromatografía Definición Clasificación Cromatografía sobre papel y capa fina Cromatografía en columna Métodos usuales en cromatografía Cromatografía de adsorción Cromatografía de exclusión molecular Cromatografía de afinidad Cromatografía de intercambio iónico Cromatografía de líquidos de alta eficacia Electroforesis Definición Principios básicos Técnicas Electroforesis capilar Espectrofotometría de absorción UV-V Técnicas de dispersión de radiación Turbidimetría Nefelometría Difracción de Rayos X Resonancia magnética nuclear Espectrometría de masas Ultracentrifugación Transferencia Fluorescencia Radiactividad Resumen Actividades de autoevaluación Las proteínas Objetivos Mapa conceptual Glosario Proteínas Definición Clasificación de las proteínas Funciones de las proteínas Aminoácidos Función de los aminoácidos Clasificación y propiedades de los aminoácidos... 98

8 8 ENSAYOS BIOTECNOLÓGICOS Clasificación Propiedades Estructura de las proteínas Estructura primaria Estructura secundaria Estructura terciaria Estructura cuaternaria Propiedades de las proteínas Extracción de proteínas Separación y purificación de proteínas Cromatografía de proteínas Cromatografía de exclusión molecular Cromatografía de intercambio iónico Cromatografía hidrofóbica Cromatografía de afinidad Cromatografía de HPLC Electroforesis de proteínas Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) Tipos de desarrollo Isoelectroenfoque Electroforesis bidimensional Electroforesis en condiciones desnaturalizantes Detergentes SDS-PAGE Ventajas Tinción de proteínas Azul de Coomassie Nitrato de plata Fluorescencia Autorradiografía Transferencia de proteínas a membranas Secuenciación de proteínas Importancia de la secuenciación Métodos Determinación estructural Difracción de rayos X Resonancia magnética nuclear Cuantificación de proteínas Espectrofotometría visible Técnicas dispersivas Método Kjeldahl Espectrometría total Resumen Ejercicios propuestos Práctica n.º Práctica n.º Práctica n.º Actividades de autoevaluación

9 ENSAYOS BIOTECNOLÓGICOS 9 5. Los ácidos nucleicos Objetivos Mapa conceptual Glosario Los ácidos nucleicos Definición Bases nitrogenadas Azúcares Nucleósidos Nucleótidos Polinucleótidos Estructura del ADN Estructura del ARN Ácidos nucleicos víricos Plásmidos Propiedades de los ácidos nucleicos Proporción de bases nitrogenadas Densidad de los ácidos nucleicos Desnaturalización: temperatura de fusión Absorbancia a 260 nm Cinética de renaturalización: Curvas CoT Hibridación de los ácidos nucleicos Extracción de los ácidos nucleicos ADN en solución acuosa ADN genómico ADN plasmídico ARN ARN poliadenilado Purificación de los ácidos nucleicos Centrifugación y ultracentrifugación Bolas magnéticas Cromatografía de los ácidos nucleicos Cromatografía de penetrabilidad Cromatografía de intercambio iónico Cromatografía de adsorción Electroforesis de los ácidos nucleicos Electroforesis en geles de agarosa (AGE) Movilidad electroforética del ADN Electroforesis bidimensional Electroforesis en condiciones desnaturalizantes Electroforesis en campo pulsante (PFGE) Enzimas de restricción Detección de ácidos nucleicos Transferencia a membranas Southern blot Northern blot Northern blot reverso Secuenciación de ADN

10 10 ENSAYOS BIOTECNOLÓGICOS Método de Sanger Método automático de secuenciación Elucidación estructural Revisión histórica Alternativas al modelo de la doble hélice Ácidos nucleicos especiales Cuantificación de ADN Espectrofotometría Fluorescencia Resumen Ejercicios propuestos Práctica n.º Práctica n.º Práctica n.º Actividades de autoevaluación Expresión génica Objetivos Mapa conceptual Glosario Genes Concepto de gen Tipos de genes Número de genes Cromosomas El código genético La información genética Duplicación del ADN Duplicación en procariontes Duplicación en eucariontes Transcripción Transcripción en procariontes Transcripción en eucariontes Traducción Control de la expresión génica Controles transcripcionales Controles postranscripcionales Controles postraduccionales Técnicas de estudio de la expresión génica Inmunolocalización Hibridación in situ Un gen, una proteína? Teoría del operón Otros conceptos aplicados a los genes Transgenes Genes antisentido Silenciamiento génico

11 ENSAYOS BIOTECNOLÓGICOS Otras formas de transmisión de la información genética Transformación Conjugación bacteriana Transducción Transfección Recombinación Resumen Ejercicios propuestos Actividades de autoevaluación Nuevas herramientas en biotecnología Objetivos Mapa conceptual Glosario Introducción Reacción en cadena de la polimerasa Termociclador Reactivos Ciclo de amplificación Verificación y optimización Tipos de PCR PCR en tiempo real Agentes intercalantes Sondas de hibridación específicas Opciones de los equipos de PCR a tiempo real Ventajas de la PCR a tiempo real PCR automatizada en tiempo real Aplicaciones de la PCR Investigación Medicina Paleontología, antropología biológica y ciencias forenses Agronomía y diversidad Marcadores moleculares RFLP. Polimorfismo en el tamaño de los fragmentos de restricción MAAP. Múltiples perfiles arbitrarios de amplificación STS. Sitios etiquetados por la secuencia Biosensores Chip de ADN Fabricación Chips de doble canal Chips de ADN de oligonucleótidos Chips de ADN para genotipificación Secuenciación de ADN Bioinformática Principales áreas de investigación Herramientas Nanobiotecnología

12 12 ENSAYOS BIOTECNOLÓGICOS Tiempos nuevos, paradigmas nuevos Resumen Práctica n.º Actividades de autoevaluación Clonación Objetivos Mapa conceptual Glosario Ingeniería genética Aislamiento del ADN foráneo Enzimas de restricción Definición y tipos Nomenclatura Tipos de cortes Aplicaciones Vectores de clonación Plásmidos Virus Cósmidos Vectores YAC (Yeast Artificial Chromosomes) Vectores BAC (Bacterial Artificial Chromosomes) Unión ADN-vectores de clonación Introducción del vector Métodos biológicos Métodos físicos Medios químicos Limitaciones Métodos de selección Resistencia a antibiótico Inactivación insercional Inserción génica positiva Hibridación de colonias Técnicas genéticas Obtención de genotecas Identificación del clon deseado Sondas moleculares Obtención de sondas moleculares Marcaje Sondas de ácidos nucleicos Sondas de ADN Sondas de ARN Resumen Ejercicios propuestos Actividades de autoevaluación

13 ENSAYOS BIOTECNOLÓGICOS Aplicaciones de la Tecnología del ADN Objetivos Mapa conceptual Glosario Tecnología del ADN Aplicaciones Clasificación de las aplicaciones de la biotecnología Biotecnología roja Biotecnología blanca Biotecnología verde Biotecnología azul Biotecnología gris Organismos modificados genéticamente Bacterias y levaduras transgénicas Plantas transgénicas Animales transgénicos Fermentación Rutas fermentativas Rutas fermentativas para la utilización del piruvato Rutas fermentativas de utilización de aminoácidos Fermentaciones industriales Biorrefinerías Materias primas Productos Resumen Ejercicios propuestos Práctica n.º Actividades de autoevaluación Identificación de proteínas Objetivos Mapa conceptual Glosario Proteómica Análisis MS/MS Ionización por electroespray Uso de las bases de datos Identificación por huella peptídica MALDI-TOF ESI-TOF Otras técnicas usuales Electroforesis automática Electroforesis microfluídica Células artificiales Técnicas inmunológicas El sistema inmunitario

14 14 ENSAYOS BIOTECNOLÓGICOS Inmunización Respuesta inmunológica Disfunciones Antígenos y anticuerpos El sistema linfoide Órganos linfoides primarios Órganos linfoides secundarios Las células del sistema inmunitario Ensayos inmunológicos Anticuerpos policlonales Anticuerpos monoclonales Una clasificación Técnicas de precipitación en gel Inmunodifusión en gel de agar Técnicas de doble difusión Inmunodifusión radial Inmunoelectroforesis Inmunofijación Técnicas de precipitación en disolución Inmunoprecipitación Detección Técnicas de aglutinación Aglutinación directa Aglutinación indirecta Aglutinación indirecta pasiva Test de Coombs Inhibición de la aglutinación Hemoaglutinación por virus Técnicas de inmunofluorescencia Inmunofluorescencia directa Inmunofluorescencia indirecta Inmunofluorescencia con Qdots Técnicas de radioinmunoensayo RIA directo RIA de inhibición RIA de sándwich Técnicas de enzimoinmunoensayo Dot blot y slot blot Inmunoblot Western blot Ensayo Zestem Inmunohistoquímica ELISA Ventajas y desventajas Dispositivos Fases de un ensayo ELISA Tipos de ensayos ELISA Otras técnicas afines Técnicas de citometría Reacción de fijación de complemento

15 ENSAYOS BIOTECNOLÓGICOS Seroneutralizacion Pruebas de protección Test de histocompatibilidad Sistemas comerciales y automatizados Respi-Strip Serodia Sistema Vidas Resumen Práctica n.º Práctica n.º Actividades de autoevaluación Seguridad alimentaria y tipificación de organismos Objetivos Mapa conceptual Glosario Seguridad alimentaria Seguridad Calidad Inocuidad de los alimentos Ensayos de tipo genético Técnicas de ensayos genéticos Metodología de los ensayos genéticos Características de los ensayos genéticos Técnicas moleculares de análisis de alimentos Chip de ADN Los organismos modificados genéticamente Especiación FINS SSCP RFLP PCR en tiempo real Individualización Secuenciación ADN-Fingerprinting Análisis RFLP Análisis STR Análisis por PCR Análisis por AmpFLP Tipado de microorganismos Técnicas clásicas Técnicas inmunológicas Técnicas moleculares Técnicas basadas en la PCR Secuenciación AP-PCR ERIC-PCR REP-PCR

16 16 ENSAYOS BIOTECNOLÓGICOS PCR-ribotipado MLST PCR-Real time Técnicas basadas en la hibridación Southern blot Northern blot Técnicas basadas en la electroforesis Técnica de electroforesis en gel de campos pulsantes Técnica de electroforesis en gel con un gradiente desnaturalizante Técnicas basadas en el ADN-fingerprinter PF REAP AFLP Cuantificación de microorganismos PCR en tiempo real FISH Sistemas comerciales OligoC-Test ADN-Strip Sistema HybriScan Sistemas automatizados fingerprinting Resumen Práctica n.º Actividades de autoevaluación Identificación de agentes tóxicos y mutagénicos Objetivos Mapa conceptual Glosario Toxinas: clasificación Según función de propiedades químicas y origen Según las partes que atacan y sus consecuencias Toxinas vegetales Toxinas animales Toxinas marinas Toxinas microbianas Toxinas en los alimentos Tóxicos: clasificación Clasificación fisiopatológica Clasificación según la vía de entrada Clasificación según el mecanismo de acción Ensayos de toxicidad Efectos del tóxico en las pruebas Especies implicadas Medida de toxicidad Índices de toxicidad Unidades

17 ENSAYOS BIOTECNOLÓGICOS Protección de la toxicidad Clasificación de los ensayos de toxicidad Clasificación Métodos Mutaciones Mutación génica Mutación por sustitución de bases Mutaciones de corrimiento estructural Mutaciones en los sitios de corte y empalme (splicing) Otras clasificaciones Aberraciones cromosómicas Mutaciones cromosómicas Mutaciones genómicas Causas de las mutaciones Mutaciones naturales o espontáneas Mutaciones inducidas Errores de replicación Cambios químicos espontáneos Elementos genéticos transponibles Transposones en bacterias Transposones en plantas Transposones en mamíferos Otros conceptos en las mutaciones Reversión y supresión de mutaciones Tasa de mutación Dominancia y recesividad Polimorfismo Mutación y cáncer Hipermutación somática Efectos de las mutaciones Efectos nocivos Efectos beneficiosos Ensayos de mutagenicidad Tipos de ensayos Métodos Test de Ames Procedimiento general Problemas y modificaciones Resumen Práctica n.º Actividades de autoevaluación

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