Aplicaciones de las Técnicas de Detección de Ácidos Nucléicos en Medicina Transfusional

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1 Aplicaciones de las Técnicas de Detección de Ácidos Nucléicos en Medicina Transfusional BIOQ. LILIANA DI TULLIO BUDASSI FAC. CS.BIOQUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS UNIVERSIDAD NACIONAL DE ROSARIO

2 HIV: screening y diagnóstico de laboratorio, Breve repaso Los métodos de screening se basan principalmente en la búsqueda de anticuerpos anti-hiv (O,1,2). (ELISA o EIA: 1, 2, 3 generación) Existe el test de detección del antígeno HIV: detección del Ag p24 (ELISA 4 generación) Ensayos combinados antígeno-anticuerpo. Al igual que con otros retrovirus, los portadores de anticuerpos son portadores del virus. Los anticuerpos anti-hiv y ag p24 aparecen de manera temprana: existe un período de ventana serológico de 21 días hasta la seroconversión. Los anticuerpos permanecen durante toda la vida. El diagnóstico comprende 2 etapas: tamizaje y confirmación por Inmunoblot (Western Blot) Screening/ Diagnóstico molecular: NAT: TMA o PCR;CV; genotipificación; test de resistencia 2

3 Recomendaciones de la OMS para ITT en donantes de Sangre (1) Los métodos utilizados para identificar la presencia HIV emplearán los siguientes targets Marcadores Serológicos 1. Anticuerpos anti-hiv-1, incluyendo grupo O, + anti- HIV-2 (EIA, CLIA) 2. Antígeno del HIV p24 (p24 Ag) (EIA, CLIA) Ácido nucléico viral: HIV RNA. Fuente:Screening Donated Blood for Transfusion Transmissible Infections. Recommendations. WHO Library Cataloguing-in- Publication Data

4 HIV Evolución clínica de la Infección 4

5 Período Ventana Model Testing Data Fuente: -Busch et al. Transfusion.2005;45(2): Kleinman and Busch. Transfusion. 2006;36:S23-S29 5

6 OBJETIVO DE NAT: Disminución del período de ventana HIV-1 : 5-6 días HIV-1 : 19 días NAT REACTIVO Eclipse Virus Período Ventana Infección Reactividad Serológica Reacción inmune Tiempo Detección más temprana 6

7 7

8 Ácidos Nucléicos Definiciones DNA y RNA son polímeros que almacenan y transmiten información del código genético Nucleótidos son subunidades de DNA o RNA que consisten en un azúcar, un grupo fosfato y una base A, G, C, T or U Las Bases se aparean y se mantienen unidas por puentes de hidrógeno C se une a G A se une a T (sólo DNA) A se une a U (sólo RNA) 8

9 Ácidos Nucléicos Definiciones Oligonucleótidos: Polímeros sintéticos Simple hebra Dos o más nucleótidos De Captura, Cebadores (Primers), o Sondas (target) Target Oligonucleotide 9

10 Ácidos Nucléicos Definiciones Sondas: Oligonucleótidos con un molécula detectora acoplada Detector: molécula de Éster de Acridinio (AE), SYBR Green, Molecular Beacons, etc. Blanco (Target) Molécula Detectora Sonda de oligonucleótidos 10

11 Ácidos Nucléicos Definiciones Amplicones: Copia sintética de una secuencia de DNA o RNA Durante la amplificación, hay un incremento exponencial del número de copias hecho a partir de un fragmento de RNA o DNA 11

12 TÉCNICAS BASADAS EN BIOLOGÍA MOLECULAR Involucran tres etapas: 1. Extracción o captura del genoma viral 2. Amplificación 3. Detección Ejemplos: PCR(Polymerase Chain Reaction) RT-PCR (Real Time PCR) NASBA (Nucleic Acid Based on Amplification) TMA (Transcriptional Mediated Amplification) 12

13 REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) PCR es un proceso enzimático en el que una región específica del DNA se replica para producir muchas copias de una secuencia particular. Utiliza ciclos repetidos, cada uno de los cuales consiste de tres pasos: 1. Extracción y purificación de los ácidos nucléicos del microorganismo de la muestra biológica. 2. Amplificación de un segmento seleccionado del genoma del microorganismo mediante reacción en cadena de la polimerasa, es decir, la PCR propiamente dicha. 3. Detección de los fragmentos amplificados en la PCR (amplicones) por electroforesis en gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio 13

14 PCR - Conceptos básicos Especificidad Generación de un único producto de amplificación Eficiencia Máxima producción de amplificación en función del número de ciclos. Fidelidad Número de errores que comete la DNA polimerasa durante la copia. Sensibilidad Mínima cantidad de ADN que se necesita para obtener una gran cantidad de copias 14

15 Ciclos de la PCR 15

16 Perfil básico de la PCR Los ciclos (30-35) comprenden tres etapas: Desnaturalización Alineamiento (annealing) Extensión 16

17 17

18 18

19 PCR Real Time Los procesos de amplificación y detección de una PCR convencional se producen de manera simultánea en un mismo vial cerrado. Mediante detección por fluorescencia se puede medir durante la amplificación la cantidad de ADN sintetizado en cada momento. La emisión de fluorescencia producida en la reacción es proporcional a la cantidad de ADN formado. Esto permite registrar la cinética de la reacción de amplificación. 19

20 PCR Real Time Los termocicladores para llevar a cabo la PCR a tiempo real incorporan un lector de fluorescencia y están diseñados para poder medir, en cualquier momento, la fluorescencia emitida en cada uno de los viales donde se realice la amplificación. Los sistemas de detección por fluorescencia empleados en la PCR a tiempo real pueden ser de dos tipos: agentes intercalantes sondas específicas marcadas con fluorocromos 20

21 21

22 TMA: Transcription Mediated Amplification El ensayo de TMA comprende tres etapas principales que tienen lugar en un sólo tubo: 1. Preparación de la muestra: captura selectiva del target 2. Amplificación selectiva del ARN del HIV-1 y del HCV así como del ADN del HBV por amplificación mediante transcripción (TMA) 3. Detección de los productos de la amplificación (amplicón) por el ensayo de protección de la hibridación. 22

23 Pasos Principales del Ensayo Detección Amplificación Captura del blanco o diana (target)

24 Paso de Amplificación- TMA Transcripción-mediada por amplificación (TMA): produce amplicones RNA Transcriptasa Reversa hace copias de DNAc del IC y del ácido nucléico viral RNA Polimerasa inicia la transcripción para producir productos de amplificación (amplicones) (7) RNA polymerase copies (8) (9) (3) (4) (5) (6) RNA amplicon Primer 2 RNAse H activities Transcription-mediated amplification (1) (TMA) Target Promoterprimer (2) Promoterprimer DNA RNA DNA Primer 2 DNA Template (12) (11) RNAse H activities (10) IVD Technology. Volume 6, No. 7, Nov/Dec 2000.

25 Detección - Ensayo de Cinética Dual (DKA) La emisión de luz es capturada y medida en Relative Light Units (RLU) RLU (Relative Light Units) Interval 25 0/0 1 Sec/25 readings 2 Sec/50 readings

26 TMA: Proceso de Ensayo e Instrumentación Pipeteo Captura del Blanco Amplificación (TMA) Detección (HPA) Resultados (DKA) wtcr Calibradores, Muestras, Controles Lisis Viral Captura del blanco Lavados, Rvo. Amp, Aceite, y Enzima Hibridización de sondas Selección Lectura automática URL PIPETEO MANUAL TECAN BAÑOS DE AGUA, SISTEMA DE CAPTURA DEL BLANCO Semi-Automación PIPETAS DE REPETICIÓN, BAÑOS DE AGUA BAÑOS DE AGUA LUMINOMETRO HC+

27 SEMI- AUTOMATIZACIÓN 27

28 AUTOMATIZACIÓN 28

29 Algoritmo de trabajo para el screening molecular de donantes 29

30 Estudios complementarios para muestras RR HIV-NAT Si es MP-NAT, abrir pool y resolver individualmente, luego dhiv-nat (ensayo discriminatorio) Si es ID-NAT ejecutar ensayos discriminatorios Test BM cualitativos Genotipificación Test BM cuantitativos (Carga Viral meq/ml o Copias/ml) Test de Resistencia Viral (TTO) 30

31 31

32 Comparación entre el rendimiento de NAT-HIV esperado (gris) vs. observado (blanco) por millón de donaciones testeadas. Laperche et al. Vox Sanguinis (2007) 2,

33 Gracias por su atención!!! 33

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