Universidad Interamericana De Puerto Rico Recinto De Bayamón Departamento De Ciencias Naturales Y Matemáticas Programa De Biotecnología PRONTUARIO
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- José Díaz Gutiérrez
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1 I. INFORMACIÓN GENERAL Universidad Interamericana De Puerto Rico Recinto De Bayamón Departamento De Ciencias Naturales Y Matemáticas Programa De Biotecnología PRONTUARIO Título del Curso : Purificación y Análisis de Proteínas Código y Número : BIOT 4928 Créditos : tres (3) Término Académico : Profesor : Horas de Oficina : Teléfono de la Oficina : Correo Electrónico : Esta información la incluirá el docente cuando vaya a enseñar el curso. II. III. IV. DESCRIPCIÓN Estudio de los métodos utilizados en la separación, purificación, filtración y secado de proteínas nativas y recombinantes. Se aplicarán las técnicas de cromatografía de columnas, centrifugación, separación por membrana, filtración de flujo tangencial y secado. Se discutirá la estructura de proteínas, el manejo, y análisis de actividad de las mismas. REQUISITOS: BIOL Biología Celular y Molecular; QUIM Bioquímica OBJETIVOS Se espera que al finalizar el curso, el estudiante pueda: 1. Conocer las técnicas utilizadas en la expresión de proteínas recombinantes. 2. Conocer aspectos de la estructura de las proteínas y su determinación. Estudiar principios del doblamiento y la estructura tridimensional de proteínas. 3. Entender los diversos principios de detección, purificación y análisis de proteínas. 4. Identificar y conocer métodos de alta resolución y sensitividad para analizar las proteínas. 5. Aplicar diversas estrategias y técnicas en la purificación de proteínas nativas y recombinantes. 6. Identificar las estrategias para la optimización de bioprocesos en gran escala. 7. Discutir principios científicos básicos de la producción a granel bajo buenas prácticas de laboratorio (GLPs) y buenas prácticas de manufactura (GMP). CONTENIDO TEMÁTICO A. Introducción 1. Repaso de las propiedades físicas y químicas de los amino ácidos y sus cadenas laterales. B. Análisis de la estructura proteica 1. Interacciones de enlace 2. Métodos de rompimiento enzimático y químico Proteasas Hidrólisis ácida 4. Espectrometría de masa Principios básicos Aplicaciones Detección y aislamiento de fosfoproteínas Secuenciación de proteínas y análisis de amino ácidos 5. Métodos de marcaje de residuos funcionales de las proteínas. Marcaje in vivo e in vitro Radioisótopos Residuos fluorescentes y quimioluminicentes 6. Uso de site directed mutagenesis Principios básicos Aplicaciones en el estudio de estructura y función de proteínas Discusión de casos de la literatura científica
2 2 C. Expresión de proteínas 1. Fuentes de proteínas Cultivo celular y cultivo de tejido Análisis a la materia prima y medio de cultivo Origen recombinante 2. Sistemas de expresión de proteínas 3. Promotores y control de la expresión genética 4. Estabilidad y solubilidad de proteínas recombinantes 5. Estrategias de expresión recombinante 5.1 Sistemas regulables 5.2 Marcadores de afinidad Histidina (poly-his) Maltosa (p-mal) Estreptavidina 5.3 Marcadores de secreción 5.4 Proteínas de fusión GST GFP 5.5 Discusión de casos Insulina humana Hormona de crecimiento Citoquinas Anticuerpos monoclonales Vacunas D. Purificación de proteínas 1. Principios de la purificación de proteínas 2. Homogenización, fraccionamiento de tejido, extracción 2.1. Buffers 2.2. Medios físicos 2.3. Sonificación 2.4. Choque osmótico 2.5. Digestión enzimática 2.6. Uso de inhibidores de proteasas 3. Estabilización de proteínas y clarificación del extracto 3.1. Centrifugación 3.2. Diálisis y filtración 3.3. Desnaturalización termal 3.4. Precipitación 3.5. Secado 3.6. Concentración 4. Cromatografía 4.1. Cromatografía líquida de baja presión/fplc 4.2. Cromatografía de alta presión (HPLC) 4.3. Intercambio iónico, cromatografía de filtración de gel, cromatografía de afinidad 5. Métodos de detección, identificación y análisis de proteínas 5.1. Cuantificación de proteína 5.2. Electroforesis: tinción y densitometría 5.3. SDS-PAGE 5.4. Gel-shift assay 5.5. Electroforesis en dos dimensiones 5.6. Métodos inmunológicos Complejo antígeno/anticuerpo Inmunoprecipitación Inmunodetección (Western blot) 5.7. Pruebas para detectar actividad biológica Actividad enzimática Otras 6. Inactivación/estabilización de las proteínas: inactivación química, física y liofilización.
3 3 F. Purificación de proteínas a gran escala industrial: Principios generales 1. GLP, cgmp 2. Producción de proteínas a gran escala 3. Separación de células 4. Disrupción de células 5. Sistema de purificación a gran escala 6. Análisis del producto final 7. Rotulación y empaque del producto final G. Uso de la bioinformática para el análisis de datos y módulos proteicos V. ACTIVIDADES 1. Presentaciones orales 2. Avalúo: Pruebas cortas luego de las conferencias, mapas de conceptos VI. EVALUACIÓN Debe incluirse el valor asignado a cada criterio de evaluación para determinar la nota final en el curso. Por ejemplo: Puntuación % de la Nota Final 3 Exámenes parciales 300 Examen final o evaluación equivalente 100 Laboratorio 100 Total 500 VII. NOTAS ESPECIALES 1) Servicios auxiliares o necesidades especiales Todo estudiante que requiera servicios auxiliares o asistencia especial deberá solicitar los mismos al inicio del curso o tan pronto como adquiera conocimiento de que los necesita, a través del registro correspondiente, en la Oficina del Coordinador de Servicios a los Estudiantes con Impedimentos ubicada en el Decanato de Estudiantes. 2) Honradez, fraude y plagio La falta de honradez, el fraude, el plagio y cualquier otro comportamiento inadecuado con relación a la labor académica constituyen infracciones mayores sancionadas por el Reglamento General de Estudiantes. Las infracciones mayores, según dispone el Reglamento General de Estudiantes, pueden tener como consecuencia la suspensión de la Universidad por un tiempo definido mayor de un año o la expulsión permanente de la Universidad, entre otras sanciones. 3) Uso de dispositivos electrónicos Se desactivarán los teléfonos celulares y cualquier otro dispositivo electrónico que pudiese interrumpir los procesos de enseñanza y aprendizaje o alterar el ambiente conducente a la excelencia académica. Las situaciones apremiantes serán atendidas, según corresponda. Se prohíbe el manejo de dispositivos electrónicos que permitan acceder, almacenar o enviar datos durante evaluaciones o exámenes. VIII. RECURSOS EDUCATIVOS Texto: Janson, JC (ed) (2011) Protein purification: principles, high resolution methods, and applications, 3 rd ed. Hoboken: John Wiley & Sons. - EBRARY Proteins: Biochemistry and Biotechnology. G. Walsh. J.Wiley & Sons, LTD, IX. BIBLIOGRAFÍA Arora, Himanshu (2009) Ane's Illustrated Dictionary of Biotechnology. Boca Raton: CRC Press. Benítez and Aguirre (ed) (2012) Protein Purification. Hauppauge: Nova Science Publishers. Campbell, A., Heyer, L. (2007) Discovering genomics, proteomics, and bioinformatics, 2nd ed. San Francisco: Pearson/Benjamin Cummings.
4 4 Claverie, Jean-Michel. (2007) Bioinformatics for Dummies, 2 nd ed. Hoboken: Wiley Pub. Devlin, Thomas (ed) (2011) Textbook of Biochemistry with Clinical Correlations, 7 th ed. Hoboken: John Wiley & Sons. Drews, G. and Bantscheff, M. (ed) (2012) Chemical Proteomics : Methods and Protocols. New York: Humana Press. Harisha, S. (2007) Biotechnology Procedures and Experiments Handbook. Hingham: Infinity Science Press. Ninfa, A., Ballou, D., and Benore, M. (2010) Fundamental Laboratory Approaches for Biochemistry and Biotechnology, 2 nd ed. Hoboken: Wiley. Seidman, L. (2008) Basic laboratory calculations for biotechnology. San Francisco: Pearson Benjamin Cummings. Watson, J. et al. (2008) Molecular biology of the gene, 6th ed. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Weaver, R. (2008) Molecular biology 4th ed. Boston: McGraw-Hill. Zvelebil, M. Baum, J. (2008) Understanding bioinformatics. New York: Garland Science. Recursos en línea Alterovitz, Benson, and Ramoni (ed) (2009) Automation in proteomics and genomics: an engineering case-based approach. Hoboken: John Wiley. - EBRARY Arias, E. and Lastra, J. (2009) Biotecnología: tecnología enzimática. Santa Fe: El Cid. - EBRARY Barreto, E. (2008) Bioinformática: una oportunidad y un desafío. Bogotá: Universidad Nacional de Colombia. - EBRARY Costa, M. (2009) Producción de enzima fitasa de Aspergillus ficuum con residuos agroindustriales en fermentación sumergida y sobre sustrato sólido. Bogotá: Universidad Nacional de Colombia. - EBRARY DelaCruz, N. (2010) Process monitoring and quality by design for biotechnology products. San Rafael: Morgan & Claypool Life Sciences. - EBRARY González, R. (2007) Diseño de un proceso continuo para la obtención de lactoproteínas a partir del suero dulce de quesería utilizando bioreactores (monografía). Buenos Aires. - EBRARY Lee, M. S. and Zhu, M. (2011) Mass spectrometry in drug metabolism and disposition: basic principles and applications. Hoboken: John Wiley & Sons. - EBRARY Leitao, A. (ed) (2011) Mycofactories. Oak Park: Bentham ebooks - EBRARY Mishra, N. (2010) Introduction to proteomics: principles and applicatiion. Hoboken: Wiley. - EBRARY Moore, J. and Langley, R. (2011) Biochemistry for dummies, 2 nd ed. Hoboken: Wiley Pub. Inc - EBRARY Murray et. al. (2009) Harper's illustrated biochemistry, 28 th ed. New York : McGraw-Hill Medical - NETLIBIX Singh, M. and Srivastava, I. (ed) (2011) Development of vaccines: from discovery to clinical testing. Hoboken: John Wiley & Sons. - EBRARY Universidad Nacional de Colombia (2008) Procedimiento general para purificar a pequeña escala las fimbrias expresadas por cepas porcinas de E. coli enterotoxigénicas. Bogotá: Universidad Nacional de Colombia. EBRARY Recursos Electrónicos Datta, A. and Dougherty, E. (2007) Introduction to genomic signal processing with control. Boca Raton: CRC Press. Lerner, K. L. and Wilmoth, B. (ed) (2007) Biotechnology: changing life through science. Detroit, Mich.: UXL.
5 5 Pabby, Rizvi, and Sanstre (eds) (2009) Handbook of membrane separations: chemical, pharmaceutical, food, and biotechnological applications. Boca Raton: CRC Press. Revistas Nature Nature Biotechnology TRENDS in Biotechnology TRENDS in Microbiology Biotechnology Biochemistry Journal of Cell Biology Molecular and Cellular Biology Science A través del CAI también tiene acceso a las siguientes bases de datos y publicaciones ASM Journals (American Society for Microbiology): Journal of Bacteriology, Applied and EnvironmentalMicrobiology, Eukaryotic Cell, Microbiology and Molecular Biology Reviews Infotrac Gale Group, proveedora de la base de datos Health and Wellness Resource Center and Alternative Health Module Ocenet Medicina PubMed Wilsonweb, proveedora de las bases de datos Applied Science & Technology Index (AST), Biological & Agricultural Index Plus(BAI), General Science Index (GSI)
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