Susceptibilidad a los antimicrobianos Metodología de trabajo Lectura e interpretación

Transcripción

1 Susceptibilidad a los antimicrobianos Metodología de trabajo Lectura e interpretación Dra. Patricia Marchiaro JTP, Área bacteriología Departamento de Microbiología Fac. de Cs. Bioquímicas y Farmacéuticas UNR 2015

2 ANTIMICROBIANO (ATM) DEFINICIÓN: Sustancia química producida por un microorganismo o derivada sintética de ella que mata o impide el desarrollo de un microorganismo. (Un ATM debe tener toxicidad selectiva, es decir, deben afectar o destruir una bacteria sin dañar significativamente las células humanas en dosis habituales.) CLASIFICACIÓN (existen diferentes criterios) I. Según el origen: NATURAL: sustancia producida por el metabolismo de organismos vivos. (Ej. penicilina producido por hongos, Penicillum notatum). SINTÉTICO: producido por medios químicos (Ej. nitrofuranos). II. Según el efecto: BACTERIOSTÁTICOS: Inhiben el crecimiento bacteriano. En gral son los que inhiben sínt proteica. Efecto reversible. (Ej. cloranfenicol; macrólidos; clindamicina; sulfonamidas; trimetroprima) BACTERICIDAS: Producen muerte o lisis bacteriana (bacteriolítico). En gral afectan la pared, membrana citopl o metabolismo ADN. Efecto irreversible. (Ej. aminoglucósidos; β-lactámicos; vancomicina; quinolonas; polimixina; rifampicina). III. Según el espectro de acción: AMPLIADO: actúan sobre Gram + y Gram (Ej. ; β-lactámicos, aminoglucósidos). REDUCIDO(Colistina en Gram - y Vancomicina en Gram +)

3 IV. Clasificación según el mecanismo de acción 1) Inhibición de la síntesis de la pared celular 2) Alteración de la función de la membrana celular 3) Inhibición de síntesis proteica 4) Inhibición del metabolismo de ácidos nucleicos 5) Inhibición de la síntesis de precursores de ácidos nucleicos o proteínas 6) Antimicrobianos que bloquean mecanismos de resistencia (Éj. ác. clavulánico, sulbactam, tazobactam inhiben enzimas betalactamasas). (1) (4) (4) (5) (3) (2) (3)

4 RESISTENCIA A LOS ATM. Bases genéticas. La resistencia es la capacidad natural o adquirida de una bacteria de permanecer refractaria a los efectos bactericidas o bacteriostáticos de los ATM. Resistencia según el origen: I. Natural o intrínseca. Estable, transmisión vertical (células hijas). Ej. Familia Proteae y la R a nitrofurantoina, y colistin. II. Adquirida. Las vías de adquisición de la R : Mutaciones en el cromosoma. Espontáneas, estables y de transmisión vertical. Intercambio de genes R por transferencia horizontal : - conjugación (vía plásmidos) - traducción - transformación Resistencia inestable ante la ausencia del ATM.

5 MECANISMOS DE RESISTENCIA BACTERIANA A LOS ANTIMICROBIANOS Enzimas inactivantes Impermeabilidad Alteración de porinas y/o polisacárido. Eflujo (Bombas de expulsión) Modificación del sitio blanco (diana), o hiper producción del sitio blanco. Vías metabólicas alternativas Protección citoplasmática del sitio blanco La resistencia puede ser multifactorial: R a una familia de ATM por más de 1 mecanismo de R. EJ. Enterobacterias y R a β-lactámicos mediado por impermeabilidad, afinidad por PBPs alteradas, eflujo y β-lactamasas.

6 El éxito de la terapia antimicrobiana va a depender: INTERACCIÓN PACIENTE-BACTERIA-ANTIMICROBIANO -Factores bacterianos: tolerancia al antimicrobiano (bacterias susceptibles pero con alta resistencia a la lisis) y efecto inoculo (número de bacterias que causan la infección) -Factores del paciente: comorbilidad y respuesta inmune -Factores del antibacteriano y la interacción que éste establece con el paciente y la bacteria, tales como absorción y distribución, metabolismo y eliminación, unión a proteínas y penetración a tejidos.

7 ESTUDIOS DE SUSCEPTIBILIDAD A LOS ATM OBJETIVOS: - Interés terapéutico: Una de las funciones más importantes del laboratorio de microbiología es medir la sensibilidad a antimicrobianos de una cepa bacteriana que se sospecha es la responsable de una infección. -Interés epidemiológico: seguir la evolución de las resistencias bacterianas. -En estudios de nuevos Antimicrobianos CUANDO REALIZAR ESTUDIOS DE SUSCEPTIBILIDAD? Cuando la sensibilidad antibacteriana del agente etiológico no puede ser preestablecida a partir del género y especie bacteriana, es decir microorganismos con susceptibilidad variable. Los ensayos de sensibilidad han de estar normalizados y sujetos a procesos de control que aseguren su reproducibilidad. Los métodos para realizar estas pruebas de sensibilidad in vitro están definidos por estándares publicados y revisados anualmente por el Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio (CLSI/Clinical and Laboratory Standards Institute, USA). Los estándares definen detalladamente cómo debe realizarse cada método de pruebas de sensibilidad y cómo han de informarse e interpretarse los resultados. Los documentos aportan directrices para la selección de antibióticos que han de probarse frente a microorganismos específicos. La selección de los ATM a probar/informar ha de ser tomada por el laboratorio de microbiología, cuerpo médico, comité de enfermedes infecciosas. CLSI propone distintas normativas de metodologías de susceptibilidad ATM: Bacterias aeróbicas no fastidiosas (Documentos M02-12ed-2015; M07-10ed-2015) Bacterias fastidiosas poco frecuentes (Doc. M45-3ed- 2015) Bacterias anaerobias (Doc. M11-8ed- 2012)

8 Estudios de susceptibilidad a los ATM: metodologías I). ESTUDIOS DIRECTOS DE LA SENSIBILIDAD Medición directa de la actividad de los ATM sobre la bacteria al ser reunidos en un medio in vitro. 1. Método de difusión (cualitativo) ANTIBIOGRAMA POR DIFUSIÓN (Método de kirby- Bauer) 2. Métodos de dilución (cuantitativo) Se obtiene la concentración inhibitoria mínima o CIM del ATM. - Dilución en agar Fueron los primeros procedimientos de - Dilución en caldo pruebas de sensibilidad elaborados. Métodos más usados en los laboratorios clínicos - Métodos epsilométricos - Métodos automatizados. 3. Métodos de medición de la bactericidia. Curva de muerte y concentración bactericida mínima (CBM). II). ESTUDIOS DE PÉRDIDA DE LA SENSIBILIDAD MÉTODOS SUPLEMENTARIOS QUE DETECTAN ALGUNOS MECANISMOS DE R BACTERIANA.

9 1. ANTIBIOGRAMA POR DIFUSIÓN: MÉTODO DE KIRBY-BAUER (K-B) Es la prueba in vitro que se utiliza de rutina en los laboratorios clínicos para la determinación de la susceptibilidad ATM de bacterias de crecimiento rápido (aerobios) y algunas bacterias con requerimientos nutricionales especiales. El CLSI adoptó los pasos básicos descriptos en el método de K-B como Método de Referencia. Documento M02 (12ed, 2015), Performance Standards for Antimicrobial Disk SusceptibilityTests. Se detalla el PROCEDIMIENTO, CONTROL DE CALIDAD E INTERPRETACIÓN. Bacterias no fastidiosas Enterobacterias Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter spp. Burkhorderia cepacia Stenotrophomonas maltophilia Staphylococcus spp. Enterococcus spp. Bacterias con requerimientos nutricionales especiales S. pneumoniae Streptococcus spp β-hemolíticos Streptococcus spp grupo viridans Haemophilus influenzae y H. parainfluenzae Neisseria gonorrhoeae Neisseria meningitidis Algunas limitaciones del método (se citan algunas) - No es recomendado para anaerobios, micobacterias ni microorganismos fastidiosos de crecimiento lento. - No es apropiado para evaluar la sensibilidad disminuida a vancomicina en Staphylococcus spp. - No determina la sensibilidad a polimixinas en enterobacterias y Acinetobacter spp.

10 Antibiograma por difusión K-B: Fundamento Agar MH Zona de inhibición E. coli Consiste en la aplicación de una cantidad determinada de ATM en un reservorio (discos de papel, pastillas con drogas en estado cristalino) sobre la superficie del agar Mueller-Hinton (o medios especiales para bacterias exigentes nutricionales), se formará por difusión un gradiente de concentración del ATM y la sensibilidad del microorganismo estará indicada por el tamaño de la zona de inhibición de la cepa alrededor del disco. Las categorías (S, I, R) surgen de curvas de regresión que relacionan valores de los halos de inhibición (en mm) con su correspondiente equivalencia en valores de CIM para cada ATM.

11 Categorías de interpretación del método de difusión Se miden los halos de inhibición para cada ATM y se interpretan empleando tablas del CLSI correspondientes a la cepa a la que se le realizó el antibiograma. SENSIBLE (S): Indica que una infección dada por la cepa en estudio tratada con la dosis de ATM recomendada para el tipo de infección y la especie infectante tiene buena probabilidad de éxito terapéutico. RESISTENTE (R): Indica que la cepa no va a ser inhibida por las concentraciones séricas normalmente alcanzadas a dosis habituales. INTERMEDIO (I): Incluye cepas que pueden ser inhibidas por concentraciones de ATM más elevadas, siempre que las dosis puedan ser aumentadas (β-lactámicos), o que la droga concentre en el sitio de infección (quinolonas y β-lactámi en orina). NO-SENSIBLE: Se usa para microorganismos que solo se les ha asignado categoría de interpretación sensible debido a la ausencia u ocurrencia poco frecuente de cepas resistentes SENSIBILIDAD DOSIS DEPENDIENTE (SDD): Nueva categoría de interpretación (M100-S24, 2014). Implica que la susceptibilidad de un aislamiento frente un ATM depende del regimen de dosificación del ATM que recibe el paciente.

12 Importante: Respetar la metodología estandarizada!! ANTIBIOGRAMA K-B (CLSI-Documento M2-A11) TABLAS DE INTERPRETACION (CLSI suplemento M100S). Informe Clínico E. coli IMPORTANCIA CLÍNICA DEL ANTIBIOGRAMA Permite informar al médico la terapia más apropiada para una infección específica. Permite conocer tendencias en resistencia a antimicrobianos de diferentes microorganismos tanto hospitalarios como de la comunidad. La elección del ATM a usar depende de varios factores: -Sensibilidad antimicrobiana del microorganismo identificado -Estado clínico del paciente y gravedad de la infección - Costo y disponibilidad del ATM - Toxicidad (baja) - Vía de administración - Concentración del ATM en el sitio de infección (según propiedades farmacocinéticas) - Estado metabólico del paciente (función renal y hepática) -Espectro. Dirigido al microorganismo sin afectar a la microbiota habitual. -Estado inmunológico del paciente (inmunocomprometidos o en inf. graves: ATM bactericidas). - Algunos ATMs están contraindicados durante lactancia, infancia o embarazo.

13 Antibiograma por difusión: Metodología estandarizada I. Preparación y estandarización del inóculo bacteriano II. Inoculación de las placas III. Aplicación de los discos IV. Incubación (tiempo, atmósfera y temperatura) V. Medida de las zonas de inhibición (en mm) VI. Interpretación de resultados (según tablas CLSI, anualmente actualizadas) VII. Realizar controles de calidad periódicos (cada 15 días o a cambio de lote) La reproducibilidad del método depende del seguimiento explícito de la metodología descripta en el documento de la CLSI.

14 I. Preparación del inóculo a. Seleccionar colonias aisladas b. El inóculo estandarizado se prepara logrando turbidez equivalente al patrón de turbidez 0,5 de la escala de Mc Farland. La misma representa 1,5 x 10 8 de bacterias por ml (UFC/ml), y una OD 685nm entre 0,08-0,1. II. Inoculación o siembra de las placas - Dentro de los 15 min de preparado el inoculo sembrar las placas con hisopo estéril. - Antes de sembrar presionar el hisopo sobre las paredes del tubo para sacarle el exceso de líquido. Hisopar la placa en 3 o 4 direcciones para lograr crecimiento confluente, la placa no debe estar mojada. - Espesor del agar: 4 mm (25-30 ml en placas de 10mm de diámetro). Suspensión directa en solución fisiológica Crecimiento previo en caldo (cepas con más de 24hs ; o escasas) Inóculo

15 III. Aplicación de los discos - Aplicar los discos entre los 5 y antes de los 15 min posteriores a la inoculación. Manual Multi-inoculador -No usar más de 6 discos por placa para evitar solapamiento de halos. Selección de los ATM a probar -Decisión del laboratorio, cuerpo médico, comité de infecciones y comité de farmacia. -CLSI propone diferentes grupos de ATM: grupo A, incluyen ATM que deben ser probados de rutina; grupo B, ATM usados en infecciones hospitalarias o por falla al tratamiento con drogas del grupo A; grupo U, ATM de infecciones urinarias; grupo C, alternativos ante R a los de primera elección; grupo O, ATM específicos para microorganismos determinados. IV. Incubación: 35 +/- 2 ºC, atmósfera normal, h o 24 h. - Colocar placas en la estufa dentro de los 15 min de colocados los discos.

16 IV. Medida de las zonas de inhibición a. Leer con regla en la base de la placa sobre fondo negro y luz reflejada. b. Leer el crecimiento confluente y zonas de inhibición uniformes y circulares. c. Consideraciones especiales: c.1. Proteus spp presentan swarming y se observa una zona de turbidez dentro del halo de inhibición por su movilidad, ignorar este efecto. Leer los halos donde la inhibición sea obvia. c.1 c.2 Leer con luz transmitida el halo para la vancomicina en Enterococcus spp y cefoxitina en Staphylococcus spp. c.3. Colonias intra-halo: discriminar entre una sub-pobación resistente o cultivo mixto

17 Antibiograma por difusión (K-B) para bacterias con requerimientos nutricionales y de incubación especiales - Haemophilus spp.: Haemophilus test medium (HTM) 35 ºC +/- 2 ºC; 5% CO2; h Tabla 2E M100 S24 M2-A11 - Neisseria gonorrhoeae: agar base GC + 1% suplementos 36 ºC +/- 1 ºC; 5% CO2; h Tabla 2F M100 S24 M2-A11 - S. pneumoniae: agar M-H + 5% sangre carnero 35 ºC +/- 2 ºC; 5% CO2; h Tabla 2G M100 S22 M2-A11 - Streptococcus β-hemolíticos: agar M-H + 5% sangre carnero 35 ºC +/- 2 ºC; 5% CO2; h Tabla 2H-1 M100 S2 M2-A11 En medio MH con sangre, medir halo de inhibición y no la hemólisis. - Streptococcus grupo viridans: agar M-H + 5% sangre carnero 35 ºC +/- 2 ºC; 5% CO2; h Tabla 2H-2 M100 S24 M2-A11

18 Factores que influyen en el método de difusión Servicio antimicrobianos, INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán. Taller WHONET 2008

19 Antibiograma por difusión : Causas de error Inapropiada preparación del inoculo No medir el ph Uso de placas envejecidas o no refrigeradas Variabilidad en el lote de MH y no control del mismo Conservación inapropiada de los discos. Inapropiada preparación del patrón de turbidez Excesiva siembra del inoculo por NO escurrir el hisopo Excesivo retardo entre el ajuste del inoculo y la siembra Excesivo retardo en la aplicación de los discos e inoculación de placas Incubación a menor o mayor temperatura Retardo en la lectura Errores de lectura Utilizar cepas control de calidad incorrectas o mal conservadas

20 Se enumeran algunos de los factores que influyen en el método de difusión 1) Asociados al Mueller-Hinton (MH) a. Conservación: Controlar la esterilidad incubando una placa 24-48hs a 35ºC ante cada lote. b. Humedad: en heladera hasta 7 días, o ponerlas en bolsas para evitar la desecación. Antes de usar, si se observan gotas en la superficie, secar incubando a 35ºC min. c. ph del MH (7,2-7,4) < Actividad a ph ácido: Aminoglucósidos (ej. GEN, AKN) > Actividad a ph ácido: Tetraciclinas

21 d. Efecto de la timidina o timina del MH El exceso pueden revertir los efectos inhibitorios de las sulfonamidas y trimetroprima produciendo halos más pequeños (resultado: falsa resistencia.) - Para evitar este inconveniente se controla el MH probando el disco de TMS con la cepa control de calidad Enterococcus faecalis ATCC Debe dar halo claro y definido 20 mm. e. Concentración de cationes bivalentes CC de Ca++ y Mg++ afecta aminoglucósidos frente a Ps. aeruginosa: en exceso, reducción del halo (Falsa R); en defecto, aumento del halo (Falsa S) - Para evitar este inconveniente se controla el medio probando estos ATM con la cepa control de calidad Pseudomonas aeruginosa ATCC Aminog. Tetra. timidina/timidina ADN

22 2. Altura del agar en la placa: 4 mm Controlar la altura con calibre o regla. >4mm Falsa R < 4mm Falsa S Mayor Halo Altura correcta 4 mm Menor Halo

23 3. Densidad del inoculo: 1-2 x 10 8 UFC/ml (Falsa S) (Falsa R) Bajo inoculo: -Crecimiento NO confluente -Aumenta el halo (Falsa S) Alto inoculo: Disminución del halo (Falsa R) INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán. Taller WHONET 2008

24 4. Calidad de los discos - Respetar condiciones de almacenamiento (4ºC o -20 ºC). - Sacar del frío 1-2 hs antes de usarlos para que se equilibre la Tª y minimizar la condensación. - Los contenedores de los discos deben tener sustancias desecantes. 5. Tiempo de aplicación de los discos - 5 min después de haber hisopado las placas y no > a 15 min. - No aplicar en placas con superficie húmeda - No reubique un disco una vez que éste ha tocado la superf. del agar. 6. Incubación Temperatura: -35 ºC +/-2ºC. Controlar continuamente esta variable. - Incubar a los 15 min de haber colocado los discos. Atmósfera - Normal. - Tiempo de incubación hs. Algunas combinaciones microorganismo/atm requiere 24 hs (Ej. VAN/Enterococcus spp).

25 Antibiograma por difusión: Control de calidad de la metodología Objetivos - la exactitud y precisión del método de sensibilidad a los antimicrobianos - la calidad de los reactivos usados -el desempeño de las personas que realizan el método y la lectura de los resultados. Control de calidad interno: control estufas control heladeras y freezers control phchímetro control autoclave control metodología: cepas ATCC (American Type Culture Colletion) Microorganismos no fastidiosos : S. aureus ATCC E. coli ATCC E. coli ATCC P. aeruginosa ATCC E. faecalis ATCC (Tabla 4A, documento M100S24) Para microorganismos con requerimientos nutricionales especiales: H. influenzae ATCC H. influenzae ATCC N. gonorrhoeae ATCC S. pneumoniae ATCC (Tabla 4B, documento M100S24)

26 2. Métodos de dilución Concentración Inhibitoria Mínima (CIM) Método cuantitativo de la actividad in vitro de un ATM frente a un microorganismo. Es la mínima concentración que inhibe el crecimiento bacteriano. Los valores cuantitativos pueden convertirse en interpretaciones cualitativas (S, R, I). La interpretación según combinación microorganismo-antibiótico se describe en Tablas CLSI 2016-M100S (Performance Standards for Antimicrob Susceptibility Testing. 26 th ed). Situaciones en que se justifica realizar una prueba cuantitativa (CIM): 1. Si un ATM tiene categoría de intermedio por difusión y es el tratamiento de elección. 2. Falta de estandarización de método de difusión (Ej. BNF como Pseudomonas putida) 3. Uso de nuevos antibióticos 4. Falla inesperada de tratamiento 5. Infecciones severas (meningitis, endocarditis, sepsis) 6. Confirmación de perfiles de R inusuales obtenidos por difusión 7. Susceptibilidad a Glucopéptidos (vancomicina) en Staphyococcus porque no se emplea Difusión.

27 Dilución en caldo/en agar son las metodologías de referencia propuestas por CLSI: - Metodología CLSI: M07-A ed-methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically. - El método se aplica a bacterias no fastidiosas, y con requerimientos nutricionales especiales. - Las tablas de interpretación (S, I, R) son anualmente actualizadas (CLSI 2016-documento M100S ) - Existen otros documentos del CLSI para bacterias anaerobias y fastidiosas (M11 y M45). Macrodilución en caldo Primer tubo límpido CIM 8ug/ml CIM: 1 ATM y 1 microorganismo Se utiliza principalmente en laboratorios de investigación porque son técnicamente engorrosas y no están adaptadas a pruebas con grandes volúmenes de muestras. 1 0, Concentraciones crecientes de un ATM (ug/ml)

28 Dilución en agar Se preparan placas conteniendo cada una diferentes concentraciones de ATM. I- Multinoculador cargando los inóculos bacterianos. II. Siembra en placa de agar MH que contiene una determinada concentración del ATM. III y IV. CIM : placa con mínima cc del ATM donde no hay desarrollo bacteriano. Al igual que la dilución en tubos, se utiliza principalmente en laboratorios de investigación porque son técnicamente engorrosas y no están adaptadas a pruebas con grandes volúmenes de muestras.

29 Otras metodologías más prácticas para obtener CIM en lab. clínicos: MÉTODOS EPSILOMÉTRICOS (E-TEST). Prueba de difusión en gradiente. MÉTODOS AUTOMATIZADOS (Vitek, Phoenix) Método simple: Inóculo, siembra e incubación semejante al K-B. CIM: Donde la elipse de inhibición intercepta la tira (márgenes nítidas) CIM Tira plástica con un ATM en un gradiente de concentración predeterminado y estable. Se inocula una suspensión bacteriana en tarjetas que contienen diluciones estandarizadas de distintos antibióticos correspondientes a los puntos de corte de sensibilidad establecidos por CLSI

30 Concentración Bactericida Mínima (CBM) Método cuantitativo de la actividad in vitro de un ATM frente a un microorganismo. Es la mínima concentración de ATM que mata el 99,9 % de las bacterias del inoculo inicial. No se hace de rutina, se solicita en infecciones graves y sin respuesta al tratamiento. Curva de muerte Mide el decrecimiento bacteriano en función del tpo empleando con distintas concentraciones fijas de antimicrobiano. Determina poder bactericida. Se hace un recuento a las 0, 2, 4, 8, 24 y 48 horas habitualmente. No es de rutina, se emplea en investigación, para evaluar sinergia de 2 ATM, infecciones de mala evolución.

31 DETECCIÓN DE MECANISMOS DE RESISTENCIA BACTERIANA A ANTIMICROBIANOS POR MÉTODOS FENOTÍPICOS Numerosos métodos descriptos, algunos propuestos por el CLSI En Argentina, el LNR (Laboratorio Nacional de Referencia en Resistencia a los Antimicrobianos INEI- ANLIS «Dr. C. Malbrán» ) propone algunas recomendaciones para la detección de mecanismos de R e informe clínico de antimicrobianos, empleando como referencia los documentos del CLSI. Estrategias de detección de mecanismos de R en BGN i. Cefalosporinasa cromosómica inducible Tipo- AmpC en enterobacterias. ii. β-lactamasa de espectro extendido (BLEE) en enterobacterias. iii. Carbapenemasas en enterobacterias, y BNF. iv. Sensibilidad disminuida a quinolonas en enterobacterias. Estrategias de detección de mecanismos de R en CGP v. Meticilino resistencia en Staphylococcus spp. vi. Resistencia inducible a clindamicina (efecto MLSi) en Staphylococcus y Streptococcus. vii. R a β-lactámicos en S. pneumoniae. SE CITAN ALGUNAS METODOLOGÍAS: viii. Método de Nitrocefin: detecta β-lactamasas en Enterococcus spp.

32 i. Cefalosporinasas cromosómicas inducibles (Tipo-AmpC) CROMOSOMICAS (constitutivas) Enterobacter spp., C. freundii, S. marcescens, M.morganii, Providencia spp, P. aeruginosa Fenotipo: -R a AMP, C1G y C2G. -FOX R: Enterobacter spp. o C. freundii; Pae -FOX R/ I/S: M. morganii, Providencia spp. o Serratia spp. -S a C3G (CAZ, CTX), C4G (FEP), y carbapenemes Inducibles(reversible), se pueden derreprimir e hiperproducir: R a C3G (CAZ, CTX) No son inhibibles por inhibidores de uso clínico: Sulbactama, Clavulánico, Tazobactama Se inhiben con Ac Borónico (BOR) y Cloxacilina (CLO): solo para identificación PLASMÍDICAS (adquiridas) Ej. Klebsiella spp, Salmonella spp, Shigella spp o Proteus spp. En gral no son inducibles.

33 i. Cefalosporinasa cromosómica inducible (tipo AmpC): detección Estrategias de detección: 1) PRUEBA DE APROXIMACIÓN DE DISCOS Aproximar (20mm cac) un disco de buen inductor (FOX, IMP) y IMP un mal inductor lábil a la enzima (CAZ, CTX). La combinación más usada IMP-CAZ CAZ IMP TZP Achatamiento 2) SINERGIA DE DOBLE DISCO Aproximar discos de CTX o CAZ o FOX y BOR. CTX CTX Informe de los β-lactámicos en enterobacterias productoras de AmpCi con cefalosporinas de 3ª (CAZ, CTX) Sensibles: C1G, C2G: Resistentes C3G: Sensible, y aclarar probable falla de tratamiento C4G (cefepime): como de en el antibiograma(s/i/ R) CLO CAZ Sinergia BOR CAZ

34 Plasmídicas ii. β-lactamasa de espectro extendido (BLEE): detección Enterobacterias > Pseudomonas spp, Acinetobacter spp. Son inhibibles por Sulbactama, Clavulánico, Tazobactama. Hidrolizan Penicilinas, cefalosporinas (C1G, C2G, C3G, C4G) y monobactamas (aztreonam). No hidrolizan cefoxitina, ni carbapenemes En enterobacterias el CLSI propone: 1) Sospecha en el antibiograma 2) Método confirmatorio DISCOS COMBINADOS: Δ CTX /CTC (cefotaxima con clavulánico) Δ CAZ/CAC (ceftazidima con clavulánico) Δ 5 mm BLEE +.

35 Otra Estrategia de detección de BLEE Doble disco: Colocar próximos (25 mm) discos de C3G (CTX, CAZ, ceftriaxona-cro) e inhibidores de β- lactamasas (amoxicilina/clavulánico-amc). CAZ Sinergia CRO CTX Interpretación: Efecto de sinergia ( huevo ) entre CTX-AMC o CAZ-AMC o CRO-AMC BLEE +. BLEE + Informe de β-lactámicos en una cepa productora de BLEE(según LNR): Penicilinas, cefalosporinas y monobactamas: RESISTENTES, independiente de la sensibilidad observada (son sustratos de las BLEE). AMS, AMC y TZP: como den en el antibiograma (poseen inhibidores de las BLEE). Carbapenemes (imipenem, meropenem, ertapenem): como den en el antibiograma (no son hidrolizados por las BLEE).

36 iii). Carbapenemasas. Nuevas β-lactamasas - Los genes codificantes de algunas de estas enzimas se diseminan entre diferentes BGN (Enterobacterias, Pseudomonas spp., Acinetobacter spp, y otros BNF), por estar asociados a plásmidos: Mec de R de diseminación!! - Se clasifican en Serino-carbabenemasas (SCB: se inhiben con Ac. Borónico-BOR) y Metalo-βlactamasas (MBL: tienen Zn++ en su sitio activo y se inhiben con quelantes como EDTA o dipicolínico-dpa ). -Hidrolizan β-lactámicos de última generación (IMP-imipenem, MER-meropenem, ERTertapenem), junto a penicilinas y/o cefalosporinas. En Arg (LNR): Sospecha de producción de Carbapenemasas Para Enterobacterias: IMP 22 mm, o ERT R/I+TAZ 15 mm Para Pseudomonas spp: MER 23 mm y CAZ 22 mm Para Acinetobacter spp: IMP 21 mm (R/I) Detección de producción SCB (Ej. KPC): Doble disco ERT BOR IMP Detección de producción de MBL (Ej. VIM): Doble disco MER DPA IMP Sinergia efecto huevo : positiva 0.5 cm Sinergia positiva «Alerta epidemiológica. Aislamiento clínico productor de carbapenemasa por metodología fenotípica. Se recomienda extremar las medidas de control de infecciones.

37 iv). Sensibilidad disminuida a quinolonas en enterobacterias - La resistencia ocurre paso a paso por acumulaciones de mutaciones. - Estrategia: colocar un disco de ác. nalidíxico-nal (vieja quinolona) y un disco de ciprofloxacina-cip (nueva quinolona fluorada) NAL CIP E. coli S a ambos ATM (sin mutaciones en sitio blanco) E. coli Nal R, CIP S: mutación en gyra. Sensibilidad disminuida a ciprofloxacina Es importante informar el riesgo de seleccionar mutantes con R a FQ. E. coli Nal R, CIP R: mutación en gyra y parc

38 Halo de NAL 18 mm (I/R) y CIP mm CIP: Salmonella (R 20mm S 31mm) CIP: Enterobacterias (R 15mm S 21mm) Sensibilidad disminuida a ciprofloxacina Como se informa: NAL no se informa En infecciones causadas por enterobacterias informar sensibilidad disminuida a CIP. *En caso de infecciones por Salmonella spp. Informar CIP : Intermedio

39 v) Meticilino u Oxacilino resistencia en Staphylococcus spp. Este género puede adquirir R a β-lactámicos mediado por: -Penicilinasas -Modificación del sitio blanco: las bacterias poseen el gen meca que sintetiza una PBP modificada (PBP2a) con baja afinidad por los β-lactámicos. El mecanismo se detecta empleando β-lactámicos estables a penicilinasas como oxacilina y cefoxitina. Inicialmente se empleaba meticilina (derivado semisintético de la penicilina). Estrategia de detección con discos: Probar disco de FOX (cefoxitina) Interpretación: -En base al halo de FOX (S ó R) se informar Meticilino S (MS) ó Meticilino (MR), no informar FOX. -Existen Puntos de cortes: para Sau y S. lugdunensis, y por otro lado para otros SCN (no S. lugdunensis). FOX S: Considerar S a β-lactámicos combinados con inhibidores de β-lactamasas (AMS, AMC), cefalosporinas, y carbapenemes. Informar S : AMS (aminopenicilina/sulbactama) y CEF (cefalotina) FOX R: Considerar R a todos los β-lactámicos. Informar R: AMS y CEF. Para S. aureus MR (MRSA): debe ensayarse la susceptibilidad frente a una nueva cefalosporina Ceftarolina (Cefalosporina de amplio espectro con actividad bactericida contra MRSA).

40 vi). Resistencia a Macrólidos, Lincosamidas y Streptograminas Efecto MLS inducible (MLSi) (Staphylococcus spp, Streptococcus β hemolíticos y S. pneumoniae e) - Síntesis de una metilasa inducible frente a macrólidos. -Mecanismo de R por modificación del sitio blanco: la enzima modifica el sitio blanco (23S rarn) de los ATM: METILACIÓN RIBOSOMAL.

41 Efecto MLS inducible Estrategia: Colocar discos eritromicina (ERY: macrólido) y clindamicina (CLI- Lincosamida) próximos para ver inducción: a 25 mm (15 a 26 mm) en Staphylococcus spp (MH, hs) a 12 mm en S. pneumoniae y Estreptococos β-hemolíticos (MH-sangre carnero 5%, 20 hs de incubación) CLI ERY En el antibiograma se lee sensible a CLI y resistente a ERY. Se observa achatamiento del halo de CLI en la proximidad del disco de ERY Las infecciones causadas por cepas con resistencia inducible a clindamicina (MLSi), pueden tener falla de tratamiento si se usa como terapia clindamicina (sensibilidad in vitro) por selección de mutantes constitutivas. INFORMAR: ERY y CLI resistentes R

42 vii. R a β-lactámicos en S. pneumoniae Mecanismo de resistencia a β-lactámicos (penicilinas y cefalosporinas) Por alteración en el sitio de acción: PBPs de baja afinidad. No son productores de β-lactamasas. Detección: Disco de OXACILINA Interpretación: OXA 20 mm Informar S a penicilina OXA 19 mm R a penicilina, realizar e informar según CIM a Pen y CTX o ceftriaxona. viii. Método de Nitrocefin (cefalosporina cromogénica) - Detecta penicilinasas plasmídicas (β-lactamasas) en Enterococcus spp. - Un resultado positivo (+) predice R a penicilinas (penicilina, ampicilina, amoxicilina)