Cinética Enzimática. Enrique Rivera González

Transcripción

1 Cinética Enzimática Enrique Rivera González

2 Importancia Las enzimas son proteínas capaces de catalizar específicamente reacciones bioquímicas. La actividad catalítica de las enzimas depende de su estructura. Pueden requerir: 1) Sólo su secuencia de aminoácidos y su conformación 2) Un cofactor (iones inorgánicos como Fe 2+, Mg 2+, Cu 2+ ) 3) Un grupo prostético (porfirinas) 2

3 Las catálisis enzimática es esencial para sistemas vivos. Permite que procesos químicos no favorables energéticamente se lleven a cabo en condiciones biológicas: Medio acuoso, ph neutro, temperatura y presión bajas. Cuando la enzima se desnaturaliza, pierde su estructura y por lo tanto su actividad catalítica. 3

4 Aequorea victoria Aequorina HO HO O N N O 2, Ca 2+ Aequorina O N NH + CO 2 + hv (466 nm) HO N H HO N 4

5 Sustrato Enzima Una reacción catalizada enzimáticamente se lleva a cabo en el sitio activo, que es el conjunto de residuos de aminoácidos de la enzima que se unen a la molécula que va a transformarse. Complejo enzima - sustrato La molécula que se une al sitio activo se denomina sustrato. Generalmente un sitio activo es específico para un determinado sustrato y al unirse forman un complejo enzima-sustrato Productos 5

6 Energía libre G Factores energéticos Estado de transición no catalizada catalizada Reacción sin catalizar S P Reacción catalizada por enzimas k 1 E + S ES k 2 P + E k 1 Coordenada de reacción 6

7 Cinética de Michaelis-Menten Observaciones experimentales A bajas [S], v 0 incrementa linealmente mientras [S] aumenta v 0 A mayores [S], los incrementos de v 0 se hacen menores mientras [S] aumenta. Después de una cierta [S], v 0 ya no aumenta, alcanzando un máximo V max [S] 7

8 Para explicar este comportamiento cinético, Michaelis y Menten propusieron en 1913 el siguiente mecanismo: 1) La enzima (E) se combina reversiblemente con sus sustrato (S) para formar un complejo enzima-sustrato (ES). 2) En un paso lento el complejo ES da lugar a la enzima libre (E) y a los productos de la reacción (P). sitio activo k 1 E + S ES ES k 2 E + P k 1 8

9 Deducción de la ecuación de velocidad k 1 E + S ES k 2 P + E k 1 Se define la ecuación de velocidad total. v 0 = d[p] dt 0 = k 2 [ES] En la primera reacción se plantea una situación de equilibrio y las velocidades hacia ambas direcciones se igualan. k 1 E [S] = k 1 [ES] K s = k 1 k 1 = E [S] [ES] 9

10 A cualquier tiempo en una reacción catalizada enzimáticamente, la enzima existe en dos formas: E y ES y su concentración total se expresa: [E] 0 = E + [ES] E = ES [E] 0 K s = E [S] [ES] = ( ES E 0)[S] [ES] Despejando [ES]. ES = E 0[S] K s + [S] Sustituyendo [ES] en la expresión de velocidad. v 0 = d[p] dt 0 = k 2 E 0 [S] k 2 ES K s + [S] 10

11 v 0 = k 2 E 0 [S] K s + [S] v 0 1) Cuando [S] es baja S K s v 0 = k 2 K s E 0 S v 0 S 2) Cuando [S] es alta [S] S K s v 0 = k 2 E 0 = V max V max se observa cuando prácticamente toda la enzima se encuentra saturada con su sustrato (formando complejo ES) y un incremento en [S] no tiene efecto en la velocidad de reacción. 11

12 Cinética de Briggs-Haldane Basándose en el esquema de reacción de Michaelis y Menten, en 1925 Briggs y Haldane propusieron que durante las reacciones enzimáticas, la [ES] se mantiene constante hasta que una cantidad significativa de sustrato ha sido consumida. Es aplicable la aproximación de estado estacionario para ES 12

13 Deducción de la ecuación de velocidad k 1 E + S ES k 2 P + E k 1 Se define la ecuación de velocidad total. v 0 = d[p] dt Se plantea la diferencial de ES. 0 = k 2 [ES] d[es] dt = k 1 E S k 1 ES k 2 ES = 0 13

14 La concentración total de la enzima se expresa: [E] 0 = E + [ES] E = ES [E] 0 Sustituyendo [E] en la ecuación de estado estacionario. k 1 E S k 1 ES k 2 ES = 0 k 1 ( ES E 0 ) S k 1 ES k 2 ES = 0 Despejando [ES]. k 1 E 0 S ES = k 1 + k 2 + k 1 S Sustituyendo [ES] en la expresión de velocidad. v 0 = d[p] dt 0 = k 2 E 0 S = k k 2k 2 ES 1 E 0 S kk 1 1 S + + k 2 k 1 + k 2 k 1 + S 14

15 Aproximación al equilibrio: v 0 = k 2 E 0 [S] K s + [S] K s = k 1 k 1 k 1 E + S ES k 2 P + E k 1 Aproximación de estado estacionario: v 0 = k 2 E 0 S = k 2 E 0 [S] k 1 + k 2 + S K m + [S] k 1 K m = k 1 + k 2 Michaelis y Menten asumieron que la unión al sustrato y la disociación del complejo ES ocurrían más rápido que la formación de producto (k 1 k 2 ). Briggs y Haldane no asumieron nada acerca de los valores de k 1 y k 2. k 1 El modelo cinético de M-M es un caso especial del modelo de B-H. 15

16 v 0 = k 2 E 0 [S] K m + [S] V max = k 2 E 0 v 0 = V max[s] K m + [S] Ecuación de Michaelis-Menten De la ecuación cinética de Michaelis-Menten se puede obtener una relación matemática cuando la velocidad inicial es la mitad de V max. v 0 = V max[s] K m + [S] = V max 2 v 0 [S] K m + [S] = 1 2 K m = S cuando v 0 = V max 2 [S] = K m [S] 16

17 Linealización de Lineweaver-Burk Experimentalmente el valor de V max puede no llegar a obtenerse porque la enzima no se haya saturado completamente. La ecuación de Michaelis-Menten puede expresarse algebraicamente de otras formas tales que permitan una práctica determinación de los parámetros cinéticos K m y V max. v 0 = V max[s] K m + [S] 1 v 0 = K m V max [S] + 1 V max 17

18 Linealización de Eadie-Hofstee Es otra técnica similar a la de Lineweaver-Burk para determinar K m y V max. El principal problema de este método es que tanto la variable dependiente como la independiente dependen de v 0 y que un error experimental afectaría a ambos ejes. v 0 = V max[s] K m + [S] V max v 0 = K m + [S] [S] v 0 = K mv 0 [S] + V max 18

19 Interpretación de K m Representa la [S] a la cual la mitad de las moléculas de enzima se encuentran saturadas, formando complejo ES. El valor de K m sugiere la afinidad de la enzima con sus sustrato. Un valor bajo de K m indica mayor afinidad y por lo tanto una mayor velocidad a cualquier [S]. K m es utilizado para identificar isoenzimas, las cuales presentan diferente afinidad por el mismo sustrato. K m es sensible a condiciones como ph y temperatura, lo cual permite identificar cambios estructurales de la enzima. 19

20 Interpretación de k 2 v 0 = k 2 E 0 [S] K m + [S] k 2 también conocida como k cat o número de recambio es la constante de velocidad para el paso determinante de velocidad. k cat se define como el número de moléculas de producto formadas a partir del sustrato por una enzima en una unidad de tiempo. El cociente k cat, denominado como cociente de especificidad permite K m comparar la eficiencia catalítica de diferentes enzimas o de la transformación de dos sustratos diferentes por la misma enzima. 20

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22 Los siguientes datos experimentales fueron obtenidos durante un estudio de la actividad catalítica de una peptidasa intestinal con el sustrato glicilglicina de acuerdo a la siguiente reacción: Glicilglicina + H 2 O 2 Glicina [S] (mm) V 0 (μm/min) Sabiendo que [E]=0.3μM, determina la eficiencia catalítica de la enzima. 22

23 Se determinó la velocidad inicial a varias concentraciones de sustrato para una reacción catalizada enzimáticamente de acuerdo con los siguientes datos: [S] /10 5 (M) V 0 /10 6 (mol/min) a) Menciona si la reacción sigue una cinética de acuerdo al modelo de Michaelis-Menten. b) Si k cat es 8.0 x 10 2, Cuál fue la concentración de enzima utilizada? c) Calcula v 0 cuando [S] = 5.0 x 10 5 y [S] = 5.0 x 10 1 d) Si se duplicara la concentración de la enzima, Cómo se verían afectados los valores de K m, k cat y V max? 23