PRINCIPIS DE BIOQUÍMICA I BIOLOGIA MOLECULAR

Transcripción

1 PRINCIPIS DE BIOQUÍMICA I BIOLOGIA MOLECULAR Objectiu: unificar conceptes. PROGRAMA: 1) Conceptes bàsics: DNA recombinant, transformació, clonació, vector. 2) Recombinació de DNA in vitro: tall i unió de molècules de DNA, enzims per a la manipulació d àcids nuclèics (enzims de restricció i lligasses). 3) Vectors de clonació: plàsmids, bacteriòfags, còsmids i YACS. 4) Clonació i aillament de gens: genoteques genòmiques i de cdna, marcatge d àcids nucleics, hibridació d àcids nucleics, altres estrategies de cribatge (doble híbrid, expressió funcional...). 5) Anàlisi de gens clonats: Southern, Northern, PCR, Seqüenciació del DNA: mètode de Sanger, seqüenciació automàtica. 6) Recombinació de DNA in vivo: inserció i substitució a llevat. Transgènia a animals superiors. 7) Expressió de gens clonats: caset d expressió, expressió a E.coli, expressió a cèl.lules de insecte, expressió a cèl.lules de mamífer. Teràpia gènica. BIBLIOGRAFIA Introduction to Genetic Analysis. 7th ed. Griffiths, Anthony J.F.; Miller, Jeffrey H.; Suzuki, David T.; Lewontin, Richard C.; Gelbart, William M. New York: WH Freeman and Co; c1999. Molecular Cell Biology. 4th ed. Lodish, Harvey; Berk, Arnold; Zipursky, S. Lawrence; Matsudaira, Paul; Baltimore, David; Darnell, James E. New York: WH Freeman and Co; c1999. Genomes. 2nd ed. Brown, T. A. Oxford, UK: BIOS Scientific Publishers, Ltd Human Molecular Genetics 2. 2nd ed. Strachan, Tom and Read, Andrew P. Oxford, UK: BIOS Scientific Publishers Ltd; Ingeniería Genética y transferencia Génica. Marta Izquierdo Rojo; Editorial Pirámide Madrid, 2001

2 PROGRAMA: 1) Conceptes bàsics: DNA recombinant, transformació, clonació, vector. 2) Recombinació de DNA in vitro: tall i unió de molècules de DNA, enzims per a la manipulació d àcids nuclèics (enzims de restricció i lligasses). 3) Vectors de clonació: plàsmids, bacteriòfags, còsmids i YACS. 4) Clonació i aillament de gens: genoteques genòmiques i de cdna, marcatge d àcids nucleics, hibridació d àcids nucleics, altres estrategies de cribatge (doble híbrid, expressió funcional...). 5) Anàlisi de gens clonats: Southern, Northern, PCR, Seqüenciació del DNA: mètode de Sanger, seqüenciació automàtica. 6) Recombinació de DNA in vivo: inserció i substitució a llevat. Transgènia a animals superiors. 7) Expressió de gens clonats: caset d expressió, expressió a E.coli, expressió a cèl.lules de insecte, expressió a cèl.lules de mamífer. Teràpia gènica.

3

4 PROGRAMA: 1) Conceptes bàsics: DNA recombinant, transformació, clonació, vector. 2) Recombinació de DNA in vitro: tall i unió de molècules de DNA, enzims per a la manipulació d àcids nuclèics (enzims de restricció i lligasses). 3) Vectors de clonació: plàsmids, bacteriòfags, còsmids i YACS. 4) Clonació i aillament de gens: genoteques genòmiques i de cdna, marcatge d àcids nucleics, hibridació d àcids nucleics, altres estrategies de cribatge (doble híbrid, expressió funcional...). 5) Anàlisi de gens clonats: Southern, Northern, PCR, Seqüenciació del DNA: mètode de Sanger, seqüenciació automàtica. 6) Recombinació de DNA in vivo: inserció i substitució a llevat. Transgènia a animals superiors. 7) Expressió de gens clonats: caset d expressió, expressió a E.coli, expressió a cèl.lules de insecte, expressió a cèl.lules de mamífer. Teràpia gènica.

5

6

7

8

9 PROGRAMA: 1) Conceptes bàsics: DNA recombinant, transformació, clonació, vector. 2) Recombinació de DNA in vitro: tall i unió de molècules de DNA, enzims per a la manipulació d àcids nuclèics (enzims de restricció i lligasses). 3) Vectors de clonació: plàsmids, bacteriòfags, còsmids i YACS. 4) Clonació i aillament de gens: genoteques genòmiques i de cdna, marcatge d àcids nucleics, hibridació d àcids nucleics, altres estrategies de cribatge (doble híbrid, expressió funcional...). 5) Anàlisi de gens clonats: Southern, Northern, PCR, Seqüenciació del DNA: mètode de Sanger, seqüenciació automàtica. 6) Recombinació de DNA in vivo: inserció i substitució a llevat. Transgènia a animals superiors. 7) Expressió de gens clonats: caset d expressió, expressió a E.coli, expressió a cèl.lules de insecte, expressió a cèl.lules de mamífer. Teràpia gènica.

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22 CRE-RECOMBINASE A Cre recombinase ataacttcgtata gcatacat tatacgaagttat loxp B loxp loxp Excision of a loxp flanked region loxp

23 Cloning vector Size of insert Standard high copy number plasmid Bacteriophage λ insertion Bacteriophage λ replacement Cosmid PAC (P1 artificial chromosome) BAC (bacterial artificial chromosome) YAC (yeast artificial chromosome) 0-10 kb 0-10 kb 9-23 kb kb kb up to 300 kb Mb

24 PROGRAMA: 1) Conceptes bàsics: DNA recombinant, transformació, clonació, vector. 2) Recombinació de DNA in vitro: tall i unió de molècules de DNA, enzims per a la manipulació d àcids nuclèics (enzims de restricció i lligasses). 3) Vectors de clonació: plàsmids, bacteriòfags, còsmids i YACS. 4) Clonació i aillament de gens: genoteques genòmiques i de cdna, marcatge d àcids nucleics, hibridació d àcids nucleics, altres estrategies de cribatge (doble híbrid, expressió funcional...). 5) Anàlisi de gens clonats: Southern, Northern, PCR, Seqüenciació del DNA: mètode de Sanger, seqüenciació automàtica. 6) Recombinació de DNA in vivo: inserció i substitució a llevat. Transgènia a animals superiors. 7) Expressió de gens clonats: caset d expressió, expressió a E.coli, expressió a cèl.lules de insecte, expressió a cèl.lules de mamífer. Teràpia gènica.

25

26

27

28

29

30

31

32

33 Tejido Ovocitos Xenopus Ensayo mrna H 2 O mrna Selección por tamaño A B C D H 2 O A B C D Sintesis cdna H 2 O Aislamiento de clones únicos

34

35

36

37 PROGRAMA: 1) Conceptes bàsics: DNA recombinant, transformació, clonació, vector. 2) Recombinació de DNA in vitro: tall i unió de molècules de DNA, enzims per a la manipulació d àcids nuclèics (enzims de restricció i lligasses). 3) Vectors de clonació: plàsmids, bacteriòfags, còsmids i YACS. 4) Clonació i aillament de gens: genoteques genòmiques i de cdna, marcatge d àcids nucleics, hibridació d àcids nucleics, altres estrategies de cribatge (doble híbrid, expressió funcional...). 5) Anàlisi de gens clonats: Southern, Northern, PCR, Seqüenciació del DNA: mètode de Sanger, seqüenciació automàtica. 6) Recombinació de DNA in vivo: inserció i substitució a llevat. Transgènia a animals superiors. 7) Expressió de gens clonats: caset d expressió, expressió a E.coli, expressió a cèl.lules de insecte, expressió a cèl.lules de mamífer. Teràpia gènica.

38

39

40

41

42

43

44

45 PROGRAMA: 1) Conceptes bàsics: DNA recombinant, transformació, clonació, vector. 2) Recombinació de DNA in vitro: tall i unió de molècules de DNA, enzims per a la manipulació d àcids nuclèics (enzims de restricció i lligasses). 3) Vectors de clonació: plàsmids, bacteriòfags, còsmids i YACS. 4) Clonació i aillament de gens: genoteques genòmiques i de cdna, marcatge d àcids nucleics, hibridació d àcids nucleics, altres estrategies de cribatge (doble híbrid, expressió funcional...). 5) Anàlisi de gens clonats: Southern, Northern, PCR, Seqüenciació del DNA: mètode de Sanger, seqüenciació automàtica. 6) Recombinació de DNA in vivo: inserció i substitució a llevat. Transgènia a animals superiors. 7) Expressió de gens clonats: caset d expressió, expressió a E.coli, expressió a cèl.lules de insecte, expressió a cèl.lules de mamífer. Teràpia gènica.

46 RECOMBINACIÓN IN VIVO

47 HOMOLOGOUS RECOMBINATION homology X selection marker homology X targeting construct gene of interest double homologous recombination selection marker inactivated gene

48

49

50 egg ZYGOTE fertilized egg sperm BLASTOCYST cell stage inner cell mass (ICM) Embryonic Stem cells: culture genetic manipulation reintroduce in host-embryo

51

52

53 CRE-LOXP: TISSUE-SPECIFIC GENE INACTIVATION (only one floxed allele indicated, should be homozygous or other allele otherwise inactivated)

54

55

56 PROGRAMA: 1) Conceptes bàsics: DNA recombinant, transformació, clonació, vector. 2) Recombinació de DNA in vitro: tall i unió de molècules de DNA, enzims per a la manipulació d àcids nuclèics (enzims de restricció i lligasses). 3) Vectors de clonació: plàsmids, bacteriòfags, còsmids i YACS. 4) Clonació i aillament de gens: genoteques genòmiques i de cdna, marcatge d àcids nucleics, hibridació d àcids nucleics, altres estrategies de cribatge (doble híbrid, expressió funcional...). 5) Anàlisi de gens clonats: Southern, Northern, PCR, Seqüenciació del DNA: mètode de Sanger, seqüenciació automàtica. 6) Recombinació de DNA in vivo: inserció i substitució a llevat. Transgènia a animals superiors. 7) Expressió de gens clonats: caset d expressió, expressió a E.coli, expressió a cèl.lules de insecte, expressió a cèl.lules de mamífer. Teràpia gènica.

57

58

59 ATG Needs to be in frame TAA T7 promoter Affinity tag cdna Insert in an expression plasmid NH 4 Purify fusion protein via affinity tag Common affinty tags are be 6X-His & GST both protein will bind reversibly with high affinty and specificty to a particular chromatography resin

60

61 Transfection Liposome Electroporation

62

63 Vectors amb promotors induïbles Tet-inducible, two component system. CMV Promoter Tet r-vp16 activation domain +Tet Ras

64

65