Fecha de emisión: 1-octubre-2012

Transcripción

1 Código: I-CIRB-AADC-05 Revisión: 02 Página: 1 de OBJETIVO Establecer de una manera adecuada y correcta la metodología para la realización de las tinciones de médula ósea y/o sangre periférica. 2.- ALCANCE Aplica a todas las muestras de médula ósea o sangre periferica que se recepcionen en el AADC. 3.- DESCRIPCIÓN DE LA OPERACIÓN PEROXIDASA LEUCOCITARIA (MIELOPEROXIDASA) Principio: La demostración de la existencia de esta enzima, se basa en la acción oxidante de la misma sobre el sustrato bencidina en presencia de H2O2. La positividad de la reacción se pone de manifiesto por la aparición de un precipitado amarillento-ocre en el citoplasma. La reacción de la peroxidasa es positiva en las células de serie granulocítica en todos sus estadios de maduración y débil o negativa en los monocitos, y esta determinación se puede usar para diferenciar células de estas líneas, de células linfoides o eritroides que son peroxidasa negativa. Las células del sistema mononuclear fagocitico (monocitos y precursores monocíticos) presentan mucha menor actividad MPO o son negativas. En una Leucemia aguda, si las células blásticas son positivas, puede afirmarse su estirpe mieloide (mieloblástica), pero si la reacción es negativa, esta no puede ser descartada, al menos mediante una sola técnica. Procedimiento: 1. Fijar en fijador universal durante 30 segundos. 2. Lavar con agua corriente 30 segundos. Dejar secar 3. Prepar la siguiente mezcla de tinción: a. 10 ml de buffer de fosfato ph 7.4 b. Diaminobencidina 7.5 mg c. H2O2 al 3% (comercial) 0.03 ml. d. Mezclar perfectamente. 4. Filtre y cubra las laminillas con esta solución durante 5 minutos. 5. Lavar con agua corriente por 1 minuto.

2 Código: I-CIRB-AADC-05 Revisión: 02 Página: 2 de 5 6. Contrateñir con Wright (mismos tiempos). 7. Lavar. Secar. Leer Criterios de positividad: La Muestra con 3% o más de Peroxidasa POSITIVA. en células blásticas, se considera REACCIÓN DEL ÁCIDO PERYÓDICO O DE SCHIFF (PAS) Principio: El fundamento de esta reacción se basa en que el ácido peryódico es un oxidante que rompe los enlaces C-C en varias estructuras cuando están presentes como grupos 1, 2-glicoles (CHOH- CHOH) convirtiéndolos en dialdehidos (CHO-CHO). Los grupos amino ó alquilamino derivados del 1, 2-glicol ó sus productos de oxidación (CHO- CO) son también atacados y convertidos a dialdehido. La propiedad del ácido peryódico es que no oxida los aldehídos resultantes, y estos se combinan con el reactivo de Schiff dando un color rojo. Los grupos carbonilo son también oxidados a grupos carboxilo y preparados para reaccionar subsecuentemente con el reactivo de Schiff. Una gran variedad de compuestos intracelulares reaccionan al PAS, pero en las células de sangre periférica y médula ósea, el glucógeno parece ser el compuesto primariamente responsable, ya que la tinción puede ser bloqueada mediante la digestión de las preparaciones con amilasa. Polisacáridos, mucopolisacárido y mucoproteínas son puestas de manifiesto por la reacción de PAS. Procedimiento: 1. Fijar durante 3 minutos con fijador universal. 2. Lavar con agua corriente durante 5 minutos. 3. Sumergir en solución de ácido peryódico 1% por 20 minutos. 4. Lavar con agua corriente por 5 minutos. 5. Sumergir en reactivo de Schiff 30 minutos en refrigeración. 6. Sumergir en 2 cambios de solución de metabisulfito de sodio al 1% durante 4.5 minutos cada cambio, esto a temperatura ambiente. 7. Lavar con agua corriente por 5 minutos. 8. Contrateñir con hematoxilina de Mayer por 8 a 10 minutos. 9. Lavar con agua corriente durante 5 minutos 10. Dejar secar. Montar. Leer. Interpretación: En la sangre periférica, el citoplasma de los neutrófilos se tiñe intensamente de color rojo o rosa con aspecto granular en algunas células. El citoplasma de los monocitos se puede teñir débilmente de color rosa

3 Código: I-CIRB-AADC-05 Revisión: 02 Página: 3 de 5 y contener algunos gránulos finos o gruesos. Los eritrocitos no se tiñen, y las plaquetas se tiñen intensamente. En la médula ósea normal, los precursores granulococitarios (mieloblastos, mielocitos y metamielocitos) a excepción de los promielocitos que son PAS (+) (promielocitos anormales, principalmente), son PAS (-) y la tinción citoplasmática granular o difusa aumenta de manera proporcional a la madurez de las células mieloides. Los megacariocitos se tiñen difusa o intensamente de rojo o rosa. Los precursores eritroides no se tiñen. En eritroleucemia (LMA M6) y en algunos casos de anemia refractaria, los eritroblastos se tiñen difusa e intensamente, o bien pueden contener gránulos rojos. También son positivos al PAS los eritroblastos en algunas anemias ferropénicas, beta-talasemias, anemia hemolítica grave y en SMD I y II. Las células PAS positivas de la eritroleucemia o de la anemia refractaria son a menudo megaloblastoides; pero los megaloblastos en déficit de vitamina B12 y/o ácido fólico son PAS negativos. En la Leucemia Linfoblastica Aguda, los blastos contienen múltiples gránulos PAS positivos de tamaño variable en su citoplasma (70-80%). Para considerar una leucemia como PAS positiva, debe de presentar 15% o más de células blásticas PAS positivas. Los mieloblastos son PAS negativos. PREPARACIÓN DE REACTIVOS: Reactivo de Schiff.- Llevar a ebullición 100 ml de agua destilada moviéndola durante el calentamiento e inmediatamente agregar 1 g de fuschina básica. Se adiciona primero una cantidad pequeña de colorante agitando suavemente, seguido por la adición del resto del colorante para evitar un burbujeo violento al adicionar una cantidad de partículas al agua cerca de su punto de ebullición. La mezcla se enfría a 60 ºC y se filtra. Se le añaden 2 g de Na2S2O5 (metabisulfito de sodio) y 20 ml de HCl 1N al filtrado. La solución se coloca en un frasco cerrado y se mantiene por horas guardado de la luz. S ele agregan 500 mg o más de carbón activado, se agita y se filtra hasta incoloro, y se guarda en frasco ámbar en refrigeración (4 ºC). La solución se usa hasta que se vuelva ligeramente rosa. Prueba de Schiff: en un tubo de ensayo se colocan unas gotas de reactivo de Schiff + 2 gotas de formaldehido 37%: Color rojo púrpura= Reactivo en buenas condiciones, Color azul intenso= reactivo en malas condiciones Buffer Formalina Acetona (Fijador Universal) 120 ml agua destilada 80 mg de Na2HPO4 400 mg KH2PO4 180 ml de acetona 100 ml de formaldehido 37%

4 Código: I-CIRB-AADC-05 Revisión: 02 Página: 4 de 5 Mezclar perfectamente y ajustar el ph en 6.6 La solución es estable a 4 ºC. Buffer de fosfato ph 7.4 (guárdese en refrigeración) g Na2HPO g KH2PO ml agua destilada Acido Peryódico.- Pesar 0.69 gr de peryodato de potasio (KIO4), añadir 0.3 ml de ácido nítrico concentrado. Los cristales de KIO4 se disuelven por calentamiento. La solución se conserva a temperatura ambiente. 4.- DOCUMENTOS DE REFERENCIA Código Nombre del documento Lugar de almacenamiento N/A Hematología de Williams Laboratorio AADC N/A Manual de técnicas en hematología Laboratorio AADC N/A Atlas color Citología Hemática Laboratorio AADC P-CIRB-AADC-03 Procedimiento para realizar el análisis de muestras y entrega de resultados Sheirpoint 5.- CONTROL DE REGISTROS Identificación Nombre del registro Lugar de almacenamiento Responsable de su protección Tiempo de retención Disposición de los registros F-CIRB- AADC-11 Bitácora de leucemias y M.O Laboratorio Química 3 años Archivo Muerto

5 Código: I-CIRB-AADC-05 Revisión: 02 Página: 5 de GLOSARIO SIGLAS AADC.- Area de apoyo al diagnóstico clinico M.O.- Medula osea PAS.- Ácido peryodico DEFINICIONES Medula Osea.- Tejido que se encuentra en el interior de los huesos largos, vertebras, costilla y esternon. 7.- CONTROL DE REVISIONES Nivel de revisión Sección y/o página Todo el documento Sección 1 Todo el documento Descripción de la modificación y mejora Se modificó el formato Se mejoró la redacción del objetivo Se cambió el formato y se mejoró la redacción de las técnicas. Fecha de modificación 18 de Enero de Agosto Nota: Ésta sección será utilizada a partir de la primera modificación a este documento. La revisión 00, se mantendrá en blanco. Elaboró Revisó Aprobó M en C. Irma Quintal Ortiz Técnico Académico QFB. Gabriela Alonzo Salomón Responsable del AADC Dr. Jorge Zavala Castro Director del CIR Las firmas avalan la responsabilidad de las personas que: elaboran el documento, revisan su adecuación y aprueban para su implementación dentro del Sistema de Gestión de la Universidad Autónoma de Yucatán.