1. INTRODUCCIÓN HISTÓRICA Y CONCEPTOS ACTUALES DEL CULTIVO DE CÉLULAS MADRE

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1 TÉCNICAS Indice de materias 1. INTRODUCCIÓN HISTÓRICA Y CONCEPTOS ACTUALES DEL CULTIVO DE CÉLULAS MADRE 2. MÉTODOS DE CULTIVO a. Aislamiento i. Células Madre embrionarias ii. Células Madre adultas iii. Células Madre fetales b. Derivación c. Diferenciación 3. CARACTERIZACIÓN 4. BIOLOGÍA DE LA CÉLULA EN CULTIVO. CONDICIONES DE CULTIVO a. El medio de cultivo i. Medio ii. Hormonas y factores de crecimiento iii. Inhibidores del crecimiento de contaminantes b. El substrato i. Plástico ii. Soportes celulares c. Métodos de disgregación celular i. Mécanicos ii. Químicos iii. Enzimáticos 5. EL LABORATORIO DE CULTIVO CELULAR a. Cabinas de flujo laminar b. Incubador de CO2 c. Placas calefactoras. d. Instrumentos ópticos de observación: microscopio de contraste de fases invertido e. Congeladores e instalacion de criogenia (depósito de N2 liquido) f. Equipo de esterilización i. Equipo de filtración ii. Autoclave iii. Mechero Bunsen g. Otros instrumentos i. Pipeteadores ii. Centrífugas iii. Equipos de purificación de agua iv. Magdem v. Contador electrónico de células 1

2 1. INTRODUCCION HISTÓRICA Y CONCEPTOS ACTUALES DEL CULTIVO DE CÉLULAS MADRE Catorce años después del aislamiento inicial de las Células Madre de los blastocitos de ratón, Thompson y colaboradores, en la Universidad de Wisconsin (Madison, WI) establecieron por primera vez, Células Madre embrionarias de primate a partir de blastocitos de monos Rhesus. Después, en 1998, fueron capaces de derivar Células Madre Embrionarias humanas (hescs) de blastocitos humanos. Desde entonces, la derivación de hescs de la ICM de blastocitos preimplantados se ha convertido en un procedimiento muy utilizado por la mayoría de científicos en todo el mundo. Actualmente, el principal objetivo de la investigación de Células Madre (SC) consiste en su derivación como soporte para la creación de células pre o diferenciadas para su posterior aplicación en medicina regenerativa. Los campos de aplicación incluyen ensayos clínicos y farmacológicos de enfermedades neurodegenerativas, cardiovasculares y diabetes, la generación de células donantes universales y la ingeniería tisular. Todas las lineas de hescs aprobadas actualmente con fondos federales en los EEUU son derivadas sobre soportes celulares de ratón (feeder layers) y son expuestas a una variedad de productos de origen animal escasamente definidos. Actualmente, una de las principales preocupaciones es la exposición de las hescs a componentes animales, debido al riesgo de contaminaciones por retrovirus y otros patógenos que pudieran ser transmitidos al paciente (lineas celulares de calidad terapéutica). En los últimos años se han ido usando feeders humanos (placenta, piel, etc ) para evitar estas posibles contaminaciones. Las directrices europeas (2003/94/EC, 2004/24/EC) son muy estrictas en el seguimiento de las condiciones de las GMPs para la derivación y propagación de las hescs. La investigación en SC embrionarias y adultas está en desarrollo y la mejora de nuestro conocimiento sobre su biología puede abrir nuevas perspectivas de futuras terapias para una variedad de enfermedades como la diabetes tipo I y el Parkinson. Algunas terapias basadas en el uso de SC están en fase de clínica en animales. En piel y células hematopoyéticas, la investigación está en una segunda fase, en la cual la corrección de genes en combinación con la terapia celular es usada para remitir enfermedades hereditarias. En los próximos 2 a 5 años, se prevee que más terapias basadas en SC entrarán en ensayos clínicos, sobre todo en el área de la regeneración muscular y el daño óseo (Stem Cell Research-Status, Prospects, Prerequisites; European Molecular Biology Organization). 2

3 2. MÉTODOS DE CULTIVO a) Aislamiento: i. Células Madre embrionarias: Los embriones humanos que son utilizados para obtener las SC son producidos en clínicas de Fertilización In Vitro (donados o desechados), donde son deshidratados, congelados y enviados a los centros de investigación de SC para su utilización. Los embriones son, entonces, descongelados y rehidratados al baño maría en placa calefactora, durante 50 segundos a 37ºC. Estos embriones, listos para ser cultivados (derivados), se dejan desarrollar hasta fase de morula en el día 4 y forman el blastocito el día 6. Fig. 1. Aislamiento y diferenciación de Células Madre embrionarias humanas. El blastocito es aislado y cultivado sobre una capa de células feeder. El blastocito se fija a las células feeder y la Masa Celular Interna (ICM) queda expuesta, permitiendo su extracción y disociación mecánica de los blastocitos con número de células y morfología adecuadas (derivación). Otra técnica para la obtención de SCs es la transferencia nuclear, consistente en la introducción del núcleo de una célula somática en un huevo fertilizado cuyo núcleo original ha sido eliminado. El ambiente del huevo fertilizado tiene el efecto de reprogramar el núcleo transferido a su estado primordial, continuando normalmente con la división del huevo. ii. Células Madre adultas: Células Madre Hematopoyéticas: Las Células Madre Hematopoyéticas pueden diferenciarse como cualquier tipo celular sanguíneo: eritrocitos, linfocitos B, T y natural killer, neutrófilos, basófilos, eosinófilos, monocitos, macrófagos y plaquetas. 3

4 Fig. 2. Diferenciación de células hematopoyéticas y de estroma. Tomado de Stem Cell Information, National Institutes of Health. Células Madre Mesenquimales: Provienen de tejidos conectivos embrionarios inmaduros. Se diferencian en una gran variedad de tipos de células, como osteocitos, condrocitos, adipocitos y otras clases de células de tejidos conectivos, como tendones. Células Madre Neurales: Se encuentran en el tejido neural adulto y, en el cerebro, se diferencian en sus tres mayores tipos celulares: neuronas, y dos categorías de celulas no neuronales, como son astrocitos y oligodendrocitos. Células Madre Epiteliales: Se desarrollan en criptas profundas del tracto digestivo y se diferencian en varios tipos celulares: células de absorción, endocrinas, etc. Células Madre de la piel: Se desarrollan en las láminas basales de la epidermis y en la base de los folículos pilosos. Las Células Madre Epidérmicas pueden diferenciarse en queratocitos, que migran a la superficie de la piel y forman una lámina protectora. Las Células Madre Foliculares se pueden diferenciar tanto en tejido folicular como epidérmico. iii. Células Madre Fetales: Aisladas de embriones muertos y sangre del cordón umbilical. b) Derivación: Las colonias formadas a partir de las Células Madre aisladas o de las ICMs, en el caso de SC embrionarias, son disgregadas y sometidas a pases sucesivos hasta obtener líneas celulares estables. c) Diferenciación: Es el proceso mediante el que una célula no especializada se transforma en cualquier tipo celular (cardíaco, pulmonar, pancreático, etc...) por la activación o desactivación de determinados genes, regulada por distintos mecanismos celulares (microrna, activación de receptores, factores de crecimiento, etc). 4

5 3. CARACTERIZACIÓN Durante el proceso de cultivo y diferenciación de Células Madre, se producen cambios en la composición antigénica de superfície, las proteínas intracelulares y los factores de transcripción. La detección inmunológica o por PCR de estos marcadores es ampliamente utilizada para caracterizar el estado de pluripotencia de las Células Madre humanas y de ratón, los carcinomas embrionarios, así como su estado de diferenciación en los diversos linajes celulares. Existen varios marcadores característicos de la Células Madres embrionarias indiferenciadas: - Glicolípidos de superfície: glycolipid surface Stage Specific Embryonic Antigens: SSEA-1, SSEA- 3, SSEA-4 - Tumour related antigen TRA-1-60 and TRA Octamero-4, relacionado con el mantenimiento de la pluripotencia. - Factores de transcripción, como Sox-2 and Germ Cell Nuclear Factor (GCNF), Rex1 y Nanog. Posteriormente, las Células Madre embrionarias dan lugar a las tres capas germinales embrionarias que constituyen la fuente de todo los tejidos de un organismo: - Marcadores de ectodermo: ASH1, CNPase, Dopamina B hidrolasa, EN1, GBX, LIM-1/ISLET- 1, LHX3, NFH - Marcadores de endodermo: antitripsina, alfa-fetoproteína, allbúmina, amilasa, quimotripsina. - Marcadores de mesodermo: actinina, cardiotina, CD34 clasei, II y II, troponina, miosina, renal cell carcinoma. Como se ha comentado anteriormente, se han identificado Células Madre en tejidos y órganos específicos. Los marcadores para estos tipos celulares son: - Células Madre neurales y linaje neural o Celulas indiferenciadas: nestina, Sox2 o Neuronas: Beta-tubulina II (newborn neurons), Map2, Neurofilamento H, L y M, Neural specific enolase, Sinaptofisina, Sinaptobrevina, Transportadores nicotínicos, gabaérgicos y de acetilcolina. o Astrocitos: GFAP, S100 o Oligodendrocitos. A2B5, Ng2 condriotin sulfato proteoglicano. - Células Madre Hematopoyéticas. Está ampliamente aceptado que la glicoproteína de superficie CD34 es expresada por la mayor parte de las células hematopoyéticas pluripotentes, que son negativas para CD45. Para células de ratón se utiliza, sobre todo, CD38. - Células Madre Mesenquimales: Integrina beta1, colágeno 1, CD54 y fibronectina. Estas células dan origen a cardiomiocitos (actina cardíaca+), osteocitos (osteopontina+) y condriocitos (colágeno 1 y 2). Estudios recientes demuestran que los micrornas (mirna) desempeñan un papel crucial en la división de las Células Madre y su autorrenovación, así como en la regulación de su estado de diferenciación y el linaje al que darán lugar (Sempere et al, 2006; Shu et al, 2004). Los micrornas son pequeños ARNs de nt que no codifican proteínas y con una estructura secundaria de horquilla específica. Los mirnas controlan negativamente la expresión de genes a nivel postranscripcional. Se han identificado mirnas específicos en Células Madre y cuyos perfiles de expresión van disminuyendo a medida que las células se diferencian. La identificación de nuevos mirnas y su mecanismo molecular puede contribuir a clarificar el potencial de Célula Madre para su posterior aplicación en medicina regenerativa (Zhang et al, 2006). Durante el cultivo y diferenciación, además de caracterizar cambios en la expresión de diferentes marcadores celulares, es necesario el análisis del estado de proliferación celular, los perfiles de muerte y 5

6 viabilidad celular, la activación de señales intracelulares, así como las características morfológicas y funcionales (motilidad celular, extensión neurítica, etc). En este sentido, el desarrollo de estrategias para el análisis multiparamétrico en formato multipocillo permite obtener resultados fiables con poco material de partida. 6

7 4. BIOLOGÍA DE LAS CÉLULAS MADRE EN CULTIVO. CONDICIONES DE CULTIVO Desde la derivación hasta la diferenciación de Células Madre, cada tipo celular tendrá unos requerimientos distintos de sustrato, pasando desde células en suspensión hasta adheridas, así como de nutrientes y factores de crecimiento. Fig. 3. Diferenciación Celular. a) El medio de cultivo: El cultivo celular se realiza en medios artificiales, preparados mediante la mezcla de componentes purificados o de soluciones orgánicas complejas, en el interior de instrumentos que mantienen las condiciones físico-químicas adecuadas y sobre soportes o recipientes que los contienen y aíslan del medio exterior. Por ello, consideraremos que el medio de cultivo estará formado por cuatro elementos: la naturaleza del sustrato o fase en que crecen las células, las condiciones físico-químicas y fisiológicas del medio, la naturaleza y composición de la fase gaseosa y las condiciones de incubación, especialmente la humedad y la temperatura. i. Medio de cultivo: En la fase de proliferación de Células Madre se suelen utilizar medios de cultivo suplementados con factores de crecimiento y en ausencia de suero, que les permiten no pasar a la fase de diferenciación. 7

8 En la fase de diferenciación, se usan medios de cultivo suplementados con suero y en ausencia de factores de crecimiento Los principales medios empleados en Células Madre son: DMEM/F12 DMEM IMDM Para aplicaciones terapéuticas se han desarrollado medios de cultivo libres de componentes de origen animal. ii. Hormonas y factores de crecimiento (suero): En los medios no definidos suele aportarlos el suero. En algunas aplicaciones de Células Madre, se suelen aportar individualmente para evitar el uso de sueros. Los tipos de suero empleados son suero de ternera ("calf serum", CF), suero bovino fetal ("fetal calf serum", FCS) y suero humano ("human serum", HuS). La utilización de suero es problemática pues siempre existe la posibilidad de que contenga contaminaciones (micoplasmas y virus), aunque últimamente las distintas casas comerciales han desarrollado sueros testados especialmente para Células Madre o sustitutivos del suero. iii. Inhibidores del crecimiento de los contaminantes (antibióticos y antifúngicos): Con el fin de evitar el crecimiento de contaminantes en el cultivo, éste se suele suplementar con sustancias antibióticas de diferente espectro de acción. La adición de antibióticos debe controlarse estrictamente para evitar efectos nocivos sobre el cultivo. Es importante tener especial cuidado cuando se combinan dos o más antibióticos. Las mezclas de uso más común son: Penicilina (100 U/mL) / Estreptomicina (100 µg/ml). Combinación antimicrobiana. Penicilina (100 U/mL) / Estreptomicina (100 µg/ml) / Fungizona. Combinación anti-microbiana y anti-fúngica. Existen diversos métodos para detectar posibles contaminaciones en los cultivos. Para más información, seguir el link Las contaminaciones. b) El sustrato de cultivo: En función de si la línea celular precisa o no unirse al sustrato para proliferar, se la denomina como dependiente (adhesión) o independiente (suspensión) de anclaje: i. Plasticos: El material más utilizado como sustrato es el plástico desechable, en forma de diferentes tipos de recipientes. Los más comunes son: Placas de Petri (ventiladas). Disponibles en 3 tamaños: 3 5, 6 0 y 10 cm de diámetro. Son las más empleadas cuando se trata de crecer las células para usar directamente en experimentos. Debido a su escasa 8

9 estanqueidad, no es recomendable su utilización para el mantenimiento de líneas. (Foto: Catálogo de Corning distribuido por Cultek) Multiplacas. Es una variante de las placas de Petri. Placas de varios pocillos, desde 6 a 96 pocillos. (Foto: Catálogo de Corning distribuido por Cultek) Frascos de Roux (botellas ventiladas o no). Disponibles en diferentes tamaños, son recomendables para el mantenimiento de las líneas y la producción de células, así como para el crecimiento de células en suspensión. (Fotos: Catálogo de Corning distribuido por Cultek) El plástico más empleado es el poliestireno, de buena calidad óptica. Debido a que este plástico es hidrofóbico, requiere un tratamiento mediante irradiación-gamma, químico o mediante descargas eléctricas que produzcan una superficie hidrofílica. 9

10 El tratamiento es característico de los diferentes suministradores, y por ello los productos varían en calidad de uno a otro. En aquellos casos en que las células tengan requerimientos especiales para adherirse, se han desarrollado nuevas superficies que aumentan la hidrofilicidad mediante tratamientos con plasma en condiciones de vacío. Fig. Ejemplo de Células Madre Neurales de rata crecidas en condiciones de baja adherencia (izquierda). Las células mantienen su capacidad de autorrenovación y forman neuroesferas en suspensión. Células crecidas en condiciones de adherencia comienzan su diferenciación (derecha). Imágenes cedidas por R. Miñana (J. Neurosci. Research, 2006). Para el caso de Células Madre que requieren estar en suspensión para evitar su diferenciacion (ej. Hematopoyéticas o neuroesferas), se suelen usar sustratos plásticos tratados para disminuir la posibilidad de fijación. ii. Soporte celular o Feeder Layers: Hay otras lineas de Células Madre que requieren crecer sobre monocapas de otros tipos celulares (Feeder Layers). Estas monocapas previas se esterilizan o se inhibe su crecimiento (normalmente por irradiación X o gamma). Actualmente, las monocapas mas empleadas para crecimiento de hescs son los fibroblastos humanos. c) Métodos de disgregación celular: Durante el cultivo de las células es necesaria su disociación para separar las células entre sí y del sustrato, manteniendo la viabilidad celular. Para conseguirlo, se debe romper la malla de proteínas que forman la matriz extracelular que las mantiene unidas, mediante procesos que separen las moléculas proteicas de esta matriz extracelular o bien romper proteolíticamente las mismas proteínas. Generalmente, los métodos empleados se pueden clasificar en tres categorías: i. Mecánicos: (Scrapers, Lifters, Magdem ) En cultivos celulares se emplean con frecuencia los métodos de rascado ( scrapping ) de la placa para arrancar las células adheridas. Actualmente, el rascado manual puede ser sustituido por un rascado automático, que se realiza mediante imanes que son colocados en el interior del frasco de cultivo. Son realizados por los equipos denominados Magdem. ii. Químicos: Se llevan a cabo mediante la adición de soluciones en las que no 10

11 hay iones divalentes o bien de agentes quelantes de estos iones. En cualquier caso, se reduce la concentración de los iones que estabilizan las uniones de las proteínas de la matriz extracelular y de éstas con los receptores celulares. iii. Enzimáticos: Tratamiento del cultivo celular con soluciones de proteasas activas (colagenasa, dispasa, tripsina, elastasa, papaína, pronasa, hialuronidasa, etc...). Existen otros productos sustitutivos de las enzimas de orígen animal, que permiten realizar la misma función pero sin afectar a las proteínas de la membrana. Son las denominadas HyQTasas. Soluciones de orígen no mamífero en D-PBS con EDTA. (Foto1: Scrapers catálogo de Corning) (Foto2: Magdem catálogo de Consul AR) La elección de uno u otro procedimiento dependerá, fundamentalmente, de la naturaleza o cantidad del cultivo disponible y del uso previsto de las células obtenidas. 11

12 5. EL LABORATORIO DE CULTIVO CELULAR La característica principal que define a estos laboratorios de cultivo celular es el mantenimiento de la asepsia. La tasa de crecimiento de las células en cultivo es muy inferior al de los contaminantes habituales: hongos, levaduras, bacterias y micoplasmas. Por ello, para el mantenimiento del cultivo, será vital evitar la aparición en éste de cualquier microorganismo indeseado. El área de trabajo para realizar cultivos debe instalarse en una zona tranquila del laboratorio, alejada de las vías de paso y, a ser posible, dedicada exclusivamente al cultivo de las células. La solución ideal es disponer de una habitación aislada del resto de zonas del laboratorio. Las aparición de cabinas de flujo laminar redujo las necesidades de aislamiento del área de trabajo pero, aún así, es recomendable mantener un gradiente de esterilidad, desde el medio exterior o laboratorio general, al interior de las cabinas de flujo donde se manipularán los cultivos y del incubador donde se mantendrán. En un laboratorio de cultivo de Stem Cells se encuentran los siguientes tipos de instrumentos: a) Cabinas de Flujo Laminar: Su función es la de mantener un área libre de partículas, especialmente de posibles contaminantes (bacterias, levaduras,...), que puedan acceder al cultivo. Esto se consigue mediante un dispositivo mecánico que fuerza el paso del aire a través de un filtro de gran superficie (filtro HEPA) situado o bien en el techo (flujo vertical) o en la pared frontal (flujo horizontal) y que, con una eficiencia del %, retiene las partículas por debajo de un cierto calibre (generalmente de 0,2µm). El flujo del aire es laminar, sin turbulencias en las que puedan quedar retenidas partículas contaminantes. El flujo laminar se asegura tanto por la gran superficie del filtro HEPA como por la velocidad constante del aire y por la ausencia de fuentes intensas de calor (mecheros bunsen) en el interior de las cabinas, generadores de intensas corrientes de convección. Habitualmente, la cabina utilizada en esta aplicación es la denominada Clase Bio IIA: o o o Protección personal: protección del personal que está manipulando el cultivo. Protección del producto, experimento o cultivo que se encuentra en el interior de la cabina de los contaminantes exteriores o de la contaminación cruzada con otros productos o cultivos situados en la misma cabina. Protección medioambiental: evitar la salida al medio ambiente de productos o agentes contaminantes. Fotos extraídas del catálogo de cabinas Faster distribuidas por Cultek 12

13 Cabina de flujo laminar horizontal Cabina de flujo laminar vertical Dependiendo de la importancia que se le conceda a cada uno de estos factores en el diseño de la cabina, ésta se podrá clasificar como de clase I, II ó III. o Cabina de clase I. Se trata de una unidad de contención parcial adecuada para la manipulación de agentes de bajo riesgo, donde existe una necesidad de protección del operario y del medio pero no del producto. Este es el tipo de cabinas normalmente denominadas "de gases", y no son de uso común en el laboratorio de cultivo de tejidos. o Cabina de clase II. Este tipo de cabinas protegen el producto, al personal y al medio ambiente. En general las cabinas de clase II se describen como un equipo de protección con un panel frontal de acceso y que mantienen un flujo laminar estable en el interior, con una filtración HEPA para el aire recircularizado en cada ciclo y una filtración HEPA del aire exhausto (de salida al medio). Los sucesivos diseños que se han realizado para cubrir necesidades diferentes permiten clasificar asimismo las cabinas de tipo II en tres subclases: Tipo A. En este tipo, el 30% del aire es eliminado en cada ciclo y el 70% es recircularizado. El escape al medio de los agentes potencialmente peligrosos se previene mediante una corriente de aire entrante en una rejilla frontal. Tipo B. Se trata de una cabina de flujo laminar para uso general y en ella se recirculariza sólo el 30% del aire en cada ciclo, eliminándose el 70% del aire restante. Tipo 100% exhausto. Se trata de una cabina en la que el 100% del aire de cada ciclo es eliminado hacia dispositivos que puedan retener los posibles agentes peligrosos. Este tipo de cabinas se emplean fundamentalmente en laboratorios de toxicología en los que se requieren áreas de contención limpias y eliminación del aire posiblemente contaminado. Las diferencias entre estos tres subtipos se refieren especialmente a la protección del usuario, superior en el caso del tipo A, y a la eliminación de la cabina de posibles contaminaciones de tipo aerosol, no retenibles por el filtro HEPA. La tipo A, que es la más adecuada para el trabajo con agentes patógenos particulados (filtrables), es la menos adecuada para el trabajo con vapores o aerosoles peligrosos. Asimismo, se debe tener en cuenta que el funcionamiento correcto para la protección del producto y del personal depende de una correcta calibración del instrumento, especialmente de las velocidades respectivas de entrada de aire en el 13

14 sistema y de flujo vertical. El punto de calibración o ajuste es dependiente del instrumento y debe ser realizado por personal especializado cada 6 ó 9 meses de funcionamiento para asegurar la protección al usuario. o Cabina de clase III. Se trata de una cabina de seguridad, estanca, para el trabajo con agentes biológicos de alto riesgo. Permite mantener al agente patógeno en un ambiente completamente estanco. Permiten controlar tanto los contaminantes particulados como aerosoles y contaminantes gaseosos mediante sistemas de filtración y disolución de éstos. b) Incubador de CO2: El mantenimiento de la temperatura en una atmósfera con una tensión controlada de CO2 y adicionalmente de humedad elevada es el objetivo del incubador de CO2. Un incubador moderno dispone de: o Dispositivos de control de temperatura, con un termostato de seguridad que desconecta la función en caso de anomalía. La estabilidad de la temperatura es una característica esencial del incubador. o Dispositivo de inyección de una mezcla de aire y CO2, en la proporción deseada, entre el 4 y el 7%. El CO2 de elevada pureza se suministra en botellas presurizadas, y se mezcla en el dispositivo de inyección. El control de la mezcla se realiza fundamentalmente mediante un dispositivo IRGA ("infra-red gas analyzer"). En incubadores modernos este dispositivo analiza constantemente el porcentaje de CO2 presente en la cámara de incubación, y realiza las correcciones necesarias. Un problema usual del dispositivo de medida de CO2 es la pérdida de calibración que se produce periódicamente. Para evitarlo, algunos fabricantes dotan al sistema de un mecanismo de autocalibración periódica (basado en la toma de una muestra de aire exterior que se considera tiene un valor determinado de CO2). o Dispositivo de control de la humedad ambiente. Para mantener el cultivo se requiere una humedad ambiente elevada, a fin de reducir la evaporación de agua del medio de cultivo. En los incubadores menos sofisticados esto se consigue mediante bandejas de agua en el fondo del incubador. Este recurso es peligroso pues son una fuente importante de contaminaciones al convertirse a los pocos días en caldos de cultivo. En los instrumentos más modernos se dispone de dispositivos que controlan la humedad atmosférica, inyectando agua estéril y filtrada. o Dispositivo de recirculación de aire. Es importante una correcta recirculación del aire en el interior del incubador, a fin de homogeneizar la temperatura en su interior. Si además en el circuito de circulación de aire se intercala un filtro HEPA, se consiguen eliminar las posibles partículas contaminantes y se asegura la esterilidad del ambiente. Las condiciones del cultivo (temperatura, humedad atmosférica y niveles de CO2) son características de cada línea celular. El nivel de CO2 se establece para mantener el equilibrio carbonato-bicarbonato en el medio de cultivo, habitualmente al 5%. 14

15 Fotos extraídas del catálogo de incubadores CO2 de la marca RS Biotech Existen en el mercado incubadores de CO2 de pequeño tamaño que permiten el cultivo de pocas placas, o en su caso, el cultivo de un determinado tipo de SCs que se vayan a diferenciar a una misma línea celular. Los equipos más pequeños (14 litros) pueden ponerse en el interior de las cabinas de flujo. De esta manera, eliminamos el transporte desde la cabina al incubador con el riesgo de contaminación que conlleva. Fotos extraídas del catálogo de incubadores CO2 de la marca RS Biotech 15

16 c) Placas calefactoras: Actualmente los laboratorios de investigación con Células Madre, así como los distintos Bancos de Líneas Celulares que realizan el paso de Derivación, tienen la necesidad de utilizar placas calefactoras en el interior de las cabinas de flujo, para descongelar los embriones provenientes de los Centros de Fecundación In-Vitro. Para ello, existen unas campanas especialmente diseñadas en las que existe un área de la superficie de trabajo calefactada, además de poder acoplar distintos dispositivos de visión microscópica (microscopio invertido, lupas, etc. ) así como mini-incubadores para poder mantener el material en buenas condiciones de CO 2, temperatura y humedad, evitando dispositivos mas aparatosos e incómodos como los inyectores de CO 2 por burbujeo. d) Instrumentos ópticos de observación: microscopio de contraste de fases invertido: El control morfológico del cultivo se realiza mediante el uso de un microscopio. El hecho de que las muestras a observar se encuentren en recipientes de un cierto grosor (más de 3 cm en el caso de frascos de Roux de 250 ml) hace que un microscopio convencional no sea adecuado (por su pequeña distancia frontal), por lo que se han desarrollado microscopios de diseño original, en los cuales la fuente de iluminación y los objetivos se encuentran invertidos respecto a la platina de un microscopio óptico convencional. La segunda característica que condiciona el instrumento óptico es su ausencia de color, es decir, se trata de muestras vivas y con poco contraste. El microscopio se equipa con el dispositivo de contraste de fases (diafragmas anulares a nivel del condensador y placa de fases entre las lentes del objetivo). De esta forma, el contraste de la imagen aumenta y la calidad obtenida es muy superior. Es de gran utilidad disponer, asimismo, de un dispositivo de captación de imágenes, fotográfico o de video acoplado al microscopio a fin de documentar el estado de los cultivos. Microscopio Invertido 16

17 e) Congeladores e instalación de criogenia (depósito de N2 líquido): Es recomendable que los congeladores y la instalación de criogenia estén en recintos separados a la unidad de cultivo propiamente dicha, pues los ventiladores y compresores son una fuente importante de turbulencias y suciedad en el laboratorio. Es preciso el almacenamiento de soluciones y células a diferentes temperaturas, para lo que se requiere: o Neveras (4ºC) para el almacenamiento de medios, PBS,... o o o Congeladores de -20ºC para el almacenamiento de suero, aditivos (glutamina, antibióticos) y soluciones enzimáticas (tripsina, colagenasa, ) Congeladores de -80ºC para el almacenamiento a largo plazo de los aditivos del medio (suero, glutamina, antibióticos,...) y de sustancias especialmente sensibles (factores de crecimiento, mitógenos, inductores,...). Unidad de almacenamiento en nitrógeno líquido (-196ºC) para el almacenamiento de las líneas celulares. Sistemas de almacenamiento de muestras. f) Equipo de esterilización: La necesidad de asepsia para el cultivo se extiende no sólo al medio en que se realiza el trabajo, sino muy especialmente a los recipientes en que se realiza, a los medios líquidos o sólidos y a los instrumentos que puedan entrar en contacto con éste en algún momento de su manipulación (pipetas, puntas de pipeta automática, pinzas, tubos, material variado de vidrio...). Para esterilizar todo este material, de variada naturaleza, se emplean una serie de métodos: irradiación con radiación gamma o rayos X, esterilización por gas, autoclavado, filtración,... En el laboratorio general de cultivo se suele disponer de un equipo de filtración y autoclave. La esterilización por gas y la irradiación son técnicas propias de grandes instalaciones, por ejemplo hospitalarias o industriales. 17

18 i. Equipos de filtración: En la actualidad se dispone de unidades de filtración estéril muy recomendables para el trabajo rutinario. Sin embargo, su elevado coste por unidad hace que en muchos casos aún se empleen unidades reutilizables. Estos equipos de filtración constan, bien de una fuente de vacío conectada a un kitasato dotado de una unidad de filtración esterilizada por autoclavado, o bien de una bomba peristáltica que fuerza el flujo de solución a través de una unidad de filtración hermética. En ambos casos, la esterilización se produce al atravesar la solución un filtro de poro de 22 µm. Fotos: Sistemas de filtración. Catálogo de Corning ii. Autoclave: Un autoclave es un instrumento que permite la esterilización por calor tanto de sólidos como de líquidos. La esterilización se realiza habitualmente a 121ºC, 1 atmósfera de sobrepresión durante un tiempo superior a 20 min. Un autoclave de uso normal en el laboratorio de cultivo de tejidos suele disponer de temporizador y regulador de presión y, en algunos casos, de un ciclo de secado para permitir secar el material sólido (material de vidrio, instrumentos quirúrgicos, tubos,...) 18

19 iii. Mechero Bunsen: Equipos de esterilización por llama que tienen la característica de poder regular el tiempo que mantiene la llama encendida. Funcionan mediante un sistema piezoeléctrico controlado por un sensor frontal. Cuando pasamos la mano por delante, se activa el sistema y la llama se enciende. Al concluir el tiempo programado, la llama se apaga automáticamente activando los sistemas de seguridad para evitar accidentes. Puede conectarse a conducciones de gas natural que haya en los laboratorios o acoplarle cartuchos de gas butano individuales. Este tipo de mecheros sí pueden ser totalmente válidos para su trabajo dentro de cabina de flujo, ya que la permanencia de la llama se reduce a un tiempo bastante limitado de uso (generalmente 3-5 segundos) Fotos obtenidas del catálogo para esterilización de Integra Biosciences g) Otros instrumentos: Además del equipo antes citado, el laboratorio deberá estar equipado con otros instrumentos que, o bien no son imprescindibles para un laboratorio de tamaño pequeño (por ej. el contador electrónico de células), o bien son instrumentos que forman parte de un laboratorio de uso más general (centrífugas, equipo de purificación de agua, balanzas, phmetro, pipeteadores...). i. Pipeteadores: Se trata de dispositivos o instrumentos para el trasvase o medición de fluidos. Los de uso común en el laboratorio como las pipetas automáticas y las pipetas, pero con la salvedad del uso de bombas acopladas a la pipeta, manuales o eléctricas que permiten la aspiración mecánica del fluido. Importante para mantener la asepsia y al mismo tiempo para la protección del operador. El aire bombeado es filtrado previamente. 19

20 Fotos obtenidas del catálogo para manejo de líquidos de Integra Biosciences ii. Centrífugas: En el laboratorio de cultivo es necesario disponer de una centrífuga refrigerada, preferentemente con posibilidades de usar en ella desde tubos de pequeño volumen (1 a 2 ml) a botellas de gran capacidad (250 a 500 ml). Normalmente, para la mayor parte de las aplicaciones bastará con un instrumento que desarrolle hasta 2000 g. La centrífuga se debe instalar, en la medida de lo posible, alejada de las cabinas de flujo laminar para evitar las turbulencias de aire que genera. iii. Equipo de purificación de agua: Es de gran importancia en la preparación de los medios, de los aditivos, o en cualquier solución que pueda estar en contacto con el cultivo, una absoluta esterilidad y ausencia de sustancias que puedan provocar alguna alteración al cultivo. Por ello, se utiliza siempre agua de la máxima calidad (tipo MilliQ) obtenida mediante equipos de doble destilación o de intercambio iónico y filtración. Es muy importante la eliminación de apirógenos, y restos de materia orgánica. iv. Magdem: Equipo desarrollado para automatizar los procedimientos manuales que se usaban para el tratamiento en los cultivos celulares. Se produce una estandarización del sistema. El equipo está compuesto de dos partes: a) Un generador de campo magnético b) Scrapers móviles (FLYcons) Los FLYcons están fabricados en un plástico inerte biológico con un ratio de partículas paramagnéticas que le confieren la capacidad de ser desplazados por el campo magnético generado por el equipo. El tamaño que tienen les permite moverse por toda la superficie que se ha de scrapear. Como son estériles e inertes, pueden permanecer en el cultivo por cierto tiempo, sin interferir en el mismo. 20

21 v. Contador electrónico de células ("cell counter"): Un contador electrónico de células es un instrumento capaz de contar y medir partículas en suspensión. Este instrumento fue comercializado por Coulter Electronics, y a pesar que posteriormente se han desarrollado métodos alternativos es aún hoy en día el mecanismo más empleado. El sistema está formado por los siguientes elementos: Dos electrodos, uno en el interior de un tubo con un pequeño orificio que se introduce en la suspensión de partículas a contar, y un segundo electrodo que se introduce directamente en dicha suspensión. El tubo con el orificio está conectado a un manómetro de mercurio y a una bomba. El manómetro controla mediante el desplazamiento del mercurio la conexión y desconexión de los electrodos. Un amplificador electrónico de la señal, un analizador de altura de los pulsos, y una escala, conectados a los electrodos. Cuando la válvula que controla el manómetro se abre 0.5 ml de la suspensión entran en el interior del tubo por el pequeño orificio. Durante ese tiempo, los electrodos están conectados y registran y transmiten al equipo de amplificación y análisis de la señal las oscilaciones de resistencia que detectan. Cada vez que una célula atraviesa el orificio se produce una variación de la resistencia proporcional al tamaño. Estos datos se registran para ser analizados posteriormente. 21