Retrovirus y VIH. Introducción e importancia. Taxonomía y clasificación. N. Cordeiro, R. Taroco. Página 449

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1 449 Página Retrovirus y VIH N. Cordeiro, R. Taroco Introducción e importancia La familia Retroviridae es una de las familias más interesantes y complejas de los virus animales. El término retro significa hacia atrás, y el nombre hace referencia a que estos virus tienen un modo inverso de replicar el ácido nucleico. Los retrovirus son virus con un genoma constituido por ARN, pero se replican por medio de un ADN intermediario usando la enzima transcriptasa inversa (o reversa). Los retrovirus son interesantes por varias razones: 1. Fueron los primeros en que se demostró la capacidad para causar cáncer habiéndose estudiado ampliamente por sus características carcinogénicas. 2. Un grupo de retrovirus, el causante del SIDA, aunque se conoce solo desde los primeros años de la década de 1980, ha llegado a representar uno de los mayores problemas de salud pública. 3. El genoma de los retrovirus puede integrarse específicamente en el genoma del hospedador gracias al ADN intermediario, proceso que está siendo estudiado. Taxonomía y clasificación Esta familia viral ha sido dividida en tres subfamilias. La primera, Oncovirinae, comprende los siguientes grupos: C, B y D; y un grupo sin nombre donde se encuentra el virus de la leucemia humana de células T (o linfotrópico): VLTH-I y VLTH-II. Todos ellos son virus oncogénicos, producen leucemias, linfomas, tumores mamarios y neuronales. La segunda, Lentivirinae, comprende el grupo de los virus Visna y el VIH. Se parecen a los anteriores en lo que se refiere a su morfología, a la naturaleza de su genoma y a la posesión de una transcriptasa reversa, pero no transforman células. El nombre de la subfamilia alude al largo período de incubación que transcurre entre la infección y la enfermedad clínica, que puede incluso superar los 10 años. La tercera, Spumavirinae, comprende los virus espumantes los cuales se encuentran en cultivo de células de riñón que degeneran de forma espontánea y que provocan la formación de células gigantes vacuoladas y multinucleadas, con un aspecto muy característico.

2 450 Generalidades morfológicas de los retrovirus Comprende una gran cantidad de virus que se caracterizan por presentar una morfología común, un genoma constituido por dos moléculas idénticas de ARN de polaridad positiva, y por poseer una transcriptasa reversa. Los virus de la familia Retroviridae se caracterizan por ser partículas envueltas, con un diámetro entre 80 y 120 nm, que contienen nucleocápside enrollada dentro de una cubierta probablemente icosaédrica. La envoltura contiene glicoproteínas víricas (espículas) y es adquirida al brotar por gemación a través de la membrana plasmática de la célula huésped. Existen varias proteínas en la cubierta de los virus y siete proteínas internas típicas, cuatro estructurales y tres enzimáticas. Las proteínas con actividad enzimática (codificadas por el gen pol) que se encuentran dentro de la partícula vírica son, la transcriptasa inversa, una endonucleasa de ADN (integrasa) y una proteasa. El virión también contiene moléculas específicas de ARNt celular que se usan en la replicación. Características y replicación del genoma de los retrovirus El genoma de los retrovirus contiene dos copias de ARN monocatenario de polaridad positiva. El extremo 5 del ARN presenta cap y el extremo 3 esta poliadenilado, de modo que el ARN es capaz de actuar directamente como ARNm, aunque no es usado como tal. Todos los retrovirus contienen los siguientes genes y en el mismo orden: gag: que codifica proteínas estructurales internas (antígeno especifico de grupo). pol: que codifica la transcriptasa inversa, la proteasa y la integrasa. env: que codifica las proteínas de la envoltura. REPLICACIÓN La replicación de los retrovirus es iniciada por la unión de las espículas a proteínas receptoras específicas de la superficie celular. La presencia de receptores para el virus es el determinante inicial del tropismo para tejidos y huéspedes concretos. El proceso global de replicación del virus se puede resumir en los siguientes pasos: entrada a la célula, transcripción inversa, integración del ADNc (ADN copia) viral en el genoma hospedador, transcripción del ADN vírico originando la formación de ARNm víricos y el ARN de la progenie, encapsidación en el citoplasma y por ultimo, la gemación de viriones con envoltura, con la consiguiente liberación de la célula. La transcriptasa inversa es en esencia una ADN polimerasa que convierte el ARN viral en una copia de ADN lineal y monocatenario en el citoplasma de la célula huésped. Esta enzima muestra tres actividades enzimáticas: 1) síntesis de ADN usando como molde el ARN viral, 2) síntesis de ADN usando como molde ADN, y 3) actividad de ribonucleasa H (degrada la cadena de ARN de un híbrido ARN:ADN). Como todas las ADN polimerasas, la transcriptasa inversa necesita un cebador, que en los retrovirus es un ARN de transferencia específico (ARNt) de origen celular. Usando el ARNt como cebador, se transcribe a ADN un centenar de nucleótidos cercanos al extremo 5 del ARN viral, allí el proceso de transcripción se detiene. Para copiar el resto del ARN viral (que representa la mayor parte), se emplea un mecanismo distinto. Primero se eliminan secuencias terminales redundantes del extremo 5 de la molécula de ARN por medio de la ribonucleasa H. Esto conduce a la formación de un pequeño ADN monocatenario que es complementario al segmento de ARN que esta en el otro extremo del ARN vírico (3 ). Este pequeño trozo de ADN híbrida luego el otro extremo de la molécula de ARN (3 ) donde

3 451 continua la copia de las secuencias del ARN vírico ( cambio de plantilla ), así se crea una cadena negativa de ADN. Aquí vuelve a actuar la ribonucleasa H y elimina toda la cadena positiva de ARN, excepto un pequeño fragmento usado como cebador que es eliminado luego de sintetizarse un pequeño segmento de ADN de polaridad positiva complementario, aquí vuelve a actuar la transcriptasa inversa y se termina de sintetizar la cadena de ADN bicatenario con largas repeticiones terminales (LTRs) en cada extremo. Estas LTRs contienen promotores transcripcionales y están relacionadas con el proceso de integración (figura 1). La integración del genoma viral puede ocurrir en cualquier zona del ADN celular (que una vez integrado se denomina provirus) pasa a ser un elemento genético estable. Así, el provirus puede expresarse o permanecer en un estado latente y no expresarse. Si se activan los promotores en la LTR adecuada, se transcribe el ADN proviral integrado formándose transcriptos que pueden ser encapsidados en partículas víricas o pueden ser procesados y traducidos a proteínas vírales. Cuando las proteínas víricas se acumulan en suficiente cantidad, tiene lugar el ensamblaje de la nucleocápside que luego se mueven hacia la membrana citoplasmática para la constitución final de las partículas víricas con envoltura. Patogenia de los retrovirus La mayoría de los retrovirus afectan a un espectro de huéspedes y especies muy limitado. El espectro restringido de huéspedes y el tropismo tisular limitado han dificultado la consecución de sistemas celulares apropiados para su cultivo. La capacidad para integrarse en los cromosomas y permanecer allí, dificulta su detección, estudio y tratamiento. Sin embargo, los retrovirus han proporcionado un instrumento fundamental para la biología molecular y han permitido el análisis del crecimiento y la diferenciación de las células y de la oncogénesis a través del estudio de los oncogenes víricos. Aunque no todos los retrovirus causan cáncer, son muy comunes los retrovirus tumorales. Algunos conocidos virus tumorales causan sarcomas o leucemia aguda y poseen un alto potencial oncogénico. La infección con uno de estos virus puede originar transformación celular y la formación de tumores. Se cree que estos retrovirus poseen un gen transformante u oncogén que codifica una proteína responsable de la transformación celular. Este gen codifica una fosfoproteína que posee actividad de proteína quinasa, estas catalizan la fosforilación de proteínas, mecanismo que regula la actividad de las proteínas. En las células normales se han encontrado genes similares, los protooncogenes, lo que sugiere que estos genes son importantes en el crecimiento celular. Los retrovirus son capaces de incorporar esas secuencias normales, que luego se alteran o se expresan de modo anormal. En consecuencia, los retrovirus son agentes mediante los cuales tales genes se transfieren de célula a célula. Un retrovirus importante, el VIH causante del SIDA, es un retrovirus no tumoral. VIH - Virus de la inmunodeficiencia humana INTRODUCCIÓN El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) produce una infección/enfermedad (SIDA: síndrome de inmunodeficiencia adquirida) que se caracteriza por una inmunodepresión progresiva que sin acciones terapéuticas y preventivas puede llegar a ser fatal, que conduce al desarrollo de infecciones oportunistas, neoplasias secundarias y manifestaciones neurológicas.

4 452 Figura 1. Esquema de la transcripción inversa del genoma retroviral. a) Síntesis de la hebra de ADN de polaridad negativa. El retrovirus provee la hebra de ARN de polaridad positiva y el primer constituido por un ARNt incluido en el virus, se hibridiza al sitio de unión en el ARN retroviral. La transcriptasa reversa comienza la síntesis de la hebra de ADN de polaridad negativa; al llegar al extremo de la hebra molde se genera una fuerte señal de terminación. La región 5 terminal del ARN es degradada y la región R de la hebra de ADN de polaridad negativa se aparea con el extremo 3 de la segunda hebra del ARN retroviral (primer salto) y la transcriptasa inversa continua la síntesis de la hebra de ADN (-). b) Síntesis de la hebra de ADN de polaridad positiva. En una primera instancia se remueve el primer de ARNt. El ARN es degradado, dejando algunos fragmentos que serviran de cebadores para la síntesis de ADN. Comienza la síntesis de la hebra de ADN de polaridad positiva. La hebra de ADN (+) es transferida al extremo opuesto de la hebra de polaridad negativa (segundo salto) y se completa la síntesis de la hebra de ADN (+). Una vez finalizada esta etapa se termina de sintetizar la hebra de ADN (-). a) b) R U5 U3 R R U5 U3 R A comienzos de los años ochenta, en 1981, se descubrió que un número inusual de varones homosexuales, haitianos, adictos a la heroína y hemofílicos, morían por infecciones oportunistas habitualmente benignas. Sus síntomas definieron una enfermedad, el SIDA. Hoy el SIDA no se limita a esos grupos y representa una epidemia sin precedentes de deficiencia inmunológica para la salud mundial. En Paris en 1983 Montagnier y colaboradores aislaron el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH-1) a partir de cultivos de linfocitos T activados, provenientes de una biopsia de un nódulo linfático de un paciente con poliadenopatías y SIDA. Desde su aparición hasta la actualidad la enfermedad se ha diseminado mundialmente, siendo considerada una pandemia, y su mortalidad sigue siendo de 100% a pesar de los avances farmacológicos, por lo que el SIDA se ha convertido en un problema mundial. Hasta la fecha se han descubierto dos tipos de virus: VIH-1 y VIH-2, este último, se encuentra sobre todo en algunos países africanos y parece estar más relacionado con los virus de la inmunodeficiencia simiana, además parece ser miembro de una familia diferente de lentivirus.

5 453 EPIDEMIOLOGÍA El primer caso de SIDA fue descrito en Estados Unidos, pero en la actualidad el numero de pacientes infectados con VIH se concentra principalmente en los países pobres (95%) y se encuentra en aumento, estimándose que ocurren unas infecciones diarias a nivel mundial. Según datos de la organización mundial de la salud (OMS), a fines del 2003 la cifra aproximada de personas infectadas por VIH es de 40 millones, siendo el África subsahariana la región más afectada (figura 2). La terapia antirretroviral (administrada en nuestro país en el servicio de pacientes infectocontagiosos del Instituto de Higiene) disponible en los países industrializados de América del Norte, Europa occidental y el Pacifico, ha disminuido la progresión de la enfermedad, las muertes y la transmisión vertical; aun así el número de nuevas infecciones se ha mantenido constante. Los casos de VIH/SIDA continúan diseminándose por todas las regiones del mundo en diferentes proporciones. Se ha demostrado que existe un periodo de incubación desde la primoinfección por el virus y el desarrollo del SIDA, que varía en general desde 1 a 15 años. El virus VIH-1, es el más ampliamente estudiado y es el que está más distribuido a nivel mundial. Posee una tasa aproximadamente de 100 % de presentar enfermedad clínica. El ser humano y el chimpancé son las únicas dos especies conocidas donde el VIH produce infección crónica. Infección por VIH en Uruguay: la epidemia de VIH/SIDA es de baja prevalencia, ya que afecta a menos del 1% de la población en general (0,45%). Es una epidemia concentrada en poblaciones vulnerables. Según informaciones brindadas por el ministerio de salud pública (año 2005) el número de nuevos infectados por día se ha duplicado, al igual que el número de casos reportados. Predomina la transmisión sexual (71%) sobre la sanguínea (25,4%), seguida de la perinatal (3,6%). Existe además un porcentaje de casos en los que no se ha determinado la forma de transmisión. Dentro de la transmisión sexual predominan los heterosexuales (casi el 90% en 2004 y 2005) incluyendo la prostitución fememina (3,2%). Le siguen los homosexuales (28,5%) y luego los bisexules (17,4%). La transmisión sanguínea predomina entre usuarios de drogas intravenosas (96,8%). Con respecto a la distribución por sexos, el porcentaje acumulado de casos de SIDA es de 66,5% correspondiente a hombres y 33,5% a mujeres. A pesar de ello, en cuanto a los casos de HIV se ha visto en los últimos años un aumento en el número de casos correspondientes al sexo femenino ( 44% de los casos reportados en 2005) siendo esta por lo tanto una población mas susceptible respecto a los años anteriores. La incidencia de infecciones por VIH en 2005 fue de 576 casos y la de SIDA en el mismo período de 300 casos. TRANSMISIÓN DEL VIH Ocurre en situaciones que facilitan el intercambio de sangre o líquidos orgánicos que contienen el virus o células infectadas por este. Entonces las principales vías de transmisión son: el contacto sexual, la inoculación parenteral y el pasaje vertical madre-hijo. Se definen grupos de alto riesgo de adquirir la infección: Varones homosexuales o bisexuales, actualmente la transmisión en este grupo esta en regresión. Usuarios de drogas intravenosas. Usuarios de drogas no intravenosas (inhalatorias).

6 454 Figura 2. Distribución mundial de adultos y niños infectados por VIH. Las cifras estimadas fueron obtenidas por la OMS y publicadas en Actualización de la epidemia del SIDA, diciembre del El total aproximado de personas afectadas se calcula entre 34 y 46 millones de personas. Hemofílicos. Receptores de sangre y hemoderivados no hemofílicos. Contactos heterosexuales de los miembros de otros grupos de riesgo (constituyendo el 10% de los enfermos). La transmisión sexual es la principal forma de infección en el mundo, responsable de aproximadamente el 75% de todos los casos. La velocidad de propagación por esta vía es superior a cualquiera de las otras, y es máxima en las parejas femeninas de drogadictos por vía intravenosa, lo que hace que aumente muy rápidamente el número de mujeres con SIDA. El virus viaja en el semen, libre y dentro de los linfocitos; además se encuentra en las secreciones vaginales y en las células de la mucosa cervical de las mujeres infectadas. Es bien demostrada la transmisión de varón a varón y de varón a mujer, pero la infección desde la mujer al varón depende mas que nada del tipo de virus y de su virulencia. Normalmente se estima que el riesgo de transmitir VIH de hombre a mujer durante el acto sexual duplica el riesgo de transmitir el virus de mujer a hombre. El virus se transmite de dos formas: 1) a través de las células de Langerhans (células dendríticas) de la mucosa y 2) por la inoculación directa en los vasos sanguíneos rotos por traumatismos, este último es el que interviene en las relaciones sexuales anales, por el que los varones homosexuales fueron en un principio los principales infectados. La coexistencia de otras enfermedades de transmisión sexual, principalmente las asociadas a ulceraciones genitales, favorece la infección. Son de especial importancia la sífilis, el chancro blando y el herpes. En estas enfermedades que cursan con inflamación genital se produce mayor concentración del virus en el semen. La transmisión parenteral se produce principalmente en los usuarios de drogas intra-

7 455 venosas, cuando estos comparten jeringas, agujas y otros objetos contaminados con sangre infectada. La infección a través de transfusiones es muy rara (fue prácticamente eliminada), y el riesgo de que así ocurra es muy bajo gracias a tres medidas de salud: el análisis de los anticuerpos anti-vih en la sangre y plasma donados, el tratamiento con calor de los concentrados de factores de coagulación, y la detección selectiva de donantes a partir de sus antecedentes. Aun así existe un riesgo muy pequeño de infección a través de sangre negativa para los anticuerpos anti-vih, porque la persona se infectó muy recientemente y todavía no ha desarrollado los anticuerpos (período ventana). Actualmente otras metodologías contribuyen a disminuir este período. La transmisión madre-hijo es la causa más importante de SIDA pediátrico. Son tres las vías de transmisión: 1) dentro del útero, mediante propagación transplacentaria, 2) durante el parto, a través del canal del parto infectado y 3) después del nacimiento, por ingestión de leche materna. El riesgo de transmisión vertical se puede reducir con el estudio serológico de VIH durante los controles del embarazo y con el tratamiento oportuno de las madres. Entre el 10 y el 35% de los niños nacidos de madres infectadas no tratadas desarrollan la infección. La misma puede ocurrir intraútero y entonces el desarrollo de SIDA y la muerte ocurren en los primeros años; si la infección es perinatal la instalación del SIDA se retrasa. En el Uruguay la incidencia de la transmisión vertical del VIH ha descendido desde un 28% (1995) hasta un 2% (2002). La infección por el VIH no puede transmitirse por contactos personales casuales, tampoco se ha demostrado que pueda hacerse a través de la picadura de insectos. TAXONOMÍA Y CLASIFICACIÓN El VIH es un virus perteneciente a la familia Retroviridae. Dentro de esta se ubica en la subfamilia lentivirinae. En esta familia están también: el virus de inmunodeficiencia felina, el virus de inmunodeficiencia de los simios, el virus visna de las ovejas y el virus de la anemia infecciosa equina. Se han aislado dos formas genéticamente diferentes: VIH-1 y VIH-2. Aunque son distintos, poseen antígenos comunes, pero existen pruebas especificas para detectarlos a ambos. Basándose en diferencias en el gen env se ha dividido al VIH-1 en tres grupos: M, O (u outlier) y N (o no M/no O). El grupo M a su vez se divide en distintos subtipos que van de A-L; por otra parte el VIH-2 se divide en cinco subtipos (A-E). El grupo M es el responsable de la pandemia SIDA, mientras que el grupo O está restringido a unos pocos países del África occidental. MORFOLOGÍA VIRAL Es un virión esférico de nm de diámetro, contiene una nucleocápside electrondensa en forma de cono, rodeado de una bicapa lipídica que proviene de la membrana de la célula huésped, donde se insertan 80 espículas (proteínas virales) constituidas cada una por varias moléculas de gp120 (glicoproteína externa) unida no covalentemente a una proteína integral de la membrana, gp41. Estas dos glucoproteínas virales son esenciales para que el virus infecte las células. El núcleo del virus contiene: la proteína de la cápside, p24 (p26 en VIH-2); la proteína p7/p9 de la nucleocápside; dos copias de ARN; y tres enzimas virales (proteasa, transcriptasa inversa e integrasa). La proteína p24 es el antígeno más fácil de detectar y son los anticuerpos contra él, los que se utilizan para el diagnostico de infección por VIH por medio de ELISA.

8 456 Figura 3. Morfología y estructura del VIH. La partícula viral envuelta contiene dos cadenas idénticas de ARN, ARN polimerasa, integrasa y dos ARNt emparejados base a base con el genoma dentro del core. Este se encuentra rodeado por proteínas y una bicapa lipídica. Abreviaturas: TM, proteína transmembrana; MA, matriz; CA, cápside; NC, nucleocápside; SU, subunidad 4- 'P 35 'P. #,%/ -! P #! P ")#!0!,)0 $)#!!2. 4RANSCRIPTASA INVERSA.# P P Este núcleo viral esta rodeado por una matriz proteica p17 (p16 en VIH-2) por debajo de la membrana lipídica (figura 3). GENOMA VIRAL Está constituido por dos moléculas de ARN de cadena simple de 9400 pares de bases, unidas por enlaces no covalentes. Los clásicos genes estructurales gag, pol, y env codifican proteínas precursoras que serán divididas luego por la proteasa en proteínas maduras (figura 4). Sobre esta proteasa actúan fármacos muy efectivos, que la inhiben e impiden el ensamblaje viral. El precursor gag es clivado en cuatro proteínas: a) p17-18 para el VIH-1 y p16 para el VIH-2; b) una proteína mayor, parte de la capside, p24-25 en el VIH-1 y p26 en el VIH-2; c) la proteína de la nucleocápside p7 que además promueve la dimerización y encapsidación del ARN. d) por ultimo una proteína p6 cuya función esta en estudio. Se sabe que aquellas partículas virales mutantes que carecen de esta proteína tienen un defecto en el ensamblaje de las partículas virales hijas. El gen pol se divide en: la proteasa que cliva los productos de gag y pol; la transcriptasa reversa y la integrasa. El gen env codifica las glicoproteínas de envoltura, que serán sintetizadas como un gran precursor que luego es clivado dejando una proteína transmembrana (gp41). En esta

9 457 Figura 4. Transcripción y traducción del genoma retroviral (VLTH-1). Nomenclatura: MA, matriz; CA, cápside; NC, nucleocápside; PR, proteasa; SU, componente superficial; TM, componente transmembrana; N, extermo aminoterminal; C, extremo carboxiterminal; p, proteína; Pr, poliproteína precursora; gp, glicoproteína; gpr, poliproteína precursora glicosilada. molécula en su parte externa posee el sitio de unión para la molécula CD4 (gp120). Pero esta proteína posee además otros sitios importantes para la infectividad del virus, el mas conocido es el V3 loop o bucle, que es el principal epítope neutralizante y sitio que promueve otros eventos aun luego de la unión al receptor CD4. Esta glicoproteína transmembrana fija el complejo glicoproteico a la membrana viral y tiene un sitio hidrofóbico, el cual promueve la fusión de las membranas celulares. El genoma del VIH contiene además otros genes: tat, rev, vif, nef, vpr y vpu, encargados de la regulación de la síntesis y de la organización de las partículas virales infecciosas: La proteína Tat actúa aumentando 1000 veces la transcripción de los genes virales, lo que favorece la replicación del virus. La proteína Rev tiene su efecto a nivel postranscripcional, regulando el transporte de ARNm desde el núcleo al citoplasma. El gen vpu parece ser fundamental para la gemación del virus desde las células infectadas. Podría interferir con la unión intracelular del precursor env con CD4. El gen vif es importante para la creación de virus libre con capacidad de infectar otras células. El gen vpr facilita la infección de las células que no están en división (por ej.: macrófagos) y detiene el ciclo celular en fase G2, con esto incrementa al máximo la protección del virus. La proteína Nef parece ser necesaria para el desarrollo de la infección progresiva, produciría la apoptosis de algunas células y una regulación en baja de las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I en las células infectadas por el VIH. La disminución de estas moléculas podría evitar el reconocimiento y la lisis de las células

10 458 diana infectadas por el VIH. En consecuencia Nef podría ayudar a superar la resistencia inmunitaria frente a la infección por VIH. En conclusión, los productos de los genes reguladores son vitales para la patogenicidad del virus y de ahí su importancia para el desarrollo de agentes que puedan bloquear la acción de dichos genes. El análisis molecular de los diferentes virus aislados demuestra que existe una gran variabilidad en algunas partes de su genoma. La mayoría de esas variaciones se agrupan en determinadas regiones de la envoltura glucoproteica. Dado que la respuesta inmune se desarrolla contra la envoltura del VIH, esta variabilidad supone un problema para el desarrollo de una vacuna única. SÍNTESIS E INTEGRACIÓN DEL ADN VIRAL Luego de ingresar a la célula las dos moléculas de ARN son transcriptas en forma reversa en una molécula lineal de ADN de doble cadena. La cadena positiva de ADN tiene dos sitios de origen distintos para su síntesis, en lugar de uno. En todos los retrovirus la cadena positiva es determinada por una secuencia de polipurinas localizadas en 5 en la región U3 de regiones de regulación (long terminal repeat o LTR). El VIH tiene una segunda región en el centro de su genoma que se utiliza como sitio de origen adicional, este sitio parece mejorar el proceso de transcripción reversa. Luego de la síntesis en el citoplasma el ADN viral es transportado al núcleo y se integra a la cedula huésped, esta reacción es mediada por una integrasa codificada por un sector del ADN viral. Cuando ocurre la activación y división de la célula huésped el ADN viral se duplica y comienzan a expresarse las proteínas virales. REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA La región LTR del VIH contiene promotores virales activos que para su transcripción requieren la presencia de activadores celulares. La proteína Tat es requerida para la transcripción y se une a una parte de la región R del LTR (TAR: transactivating response element o elemento transactivador de respuesta) y junto con los activadores transcripcionales de origen celular (SP-1, NF-κB) promueven el inicio de la transcripción y la elongación del transcripto. De esta manera aparecen en la infección aguda tres clases de transcriptos: moléculas de ARN que producen las proteínas gag y pol; moléculas para las glicoproteínas de envoltura; y moléculas para las proteínas reguladoras. El sistema Rev controla la exportación citoplasmática y estabilidad de estos transcriptos. VARIABILIDAD GENÉTICA El alto grado de variabilidad genética del VIH es una de sus características más relevantes. La región más variable del genoma es la que codifica para las glicoproteínas de envoltura. La región mas conservada es la de los genes gag y pol. Esta variabilidad se debe a la existencia de la transcriptasa reversa, esta enzima no tiene la capacidad de corregir errores durante la retrotranscripción. Gracias a esta variabilidad el virus escapa a la respuesta inmune antiviral. Las glicoproteínas de envoltura evaden el sistema inmune porque se originan en regiones hipervariables. MECANISMOS DE PATOGENICIDAD En las personas infectadas con el VIH es habitual la observación de distintas anormalidades inmunológicas: severa linfopenia, principalmente de células T CD4 +, reacciones de hipersensibilidad cutánea retardada disminuidas o ausentes,

11 459 perdida de la función citotóxica de las células natural killer (NK), función anormal de los monocitos, hipergammaglobulinemia policlonal. La molécula CD4 sirve como receptor del VIH, es por ello que el virus no solo infecta a los linfocitos T CD4 +, sino a otras células que también expresan este receptor, como monocitos de sangre periférica, precursores de células T de la medula ósea y el timo, y macrófagos tisulares: entre ellos están las células dendríticas foliculares de los ganglios linfáticos y la piel, las células de Langerhans del timo y las células microgliales en el cerebro. Este virus reduce la capacidad funcional global (disminución de función y de número) de los linfocitos T periféricos y de las células presentadoras de antígeno, e inhibe la producción y maduración de los precursores de la medula. Por tanto, la patogenicidad el VIH se debe a su afinidad por las células CD4+ que lleva a una disminución de las respuestas inmunes normales del huésped, luego, a la destrucción de la inmunidad, y finalmente, a la muerte por infecciones oportunistas. ENTRADA A LA CÉLULA La infección se inicia cuando una partícula viral completa encuentra una célula con receptor CD4. La glicoproteína gp120 se une fuertemente a este receptor. Actualmente se sabe que es necesaria la presencia de otro correceptor para mediar la fusión del virus a la célula, son los denominados receptores para quemoquinas. Las quemoquinas son péptidos pequeños, con función quimiotactica para las células que intervienen habitualmente en los mecanismos de defensa: neutrofilos, macrófagos, linfocitos. En presencia de un proceso inflamatorio, estas células son atraídas hacia el foco de infección o injuria, por medio de sustancias solubles: las quemoquinas. Estas células presentan en su superficie receptores para quemoquinas, los cuales a su vez son correceptores para el VIH. Por lo tanto, no es suficiente la presencia en la superficie de un receptor CD4 que se una a la gp120, sino que para que la célula sea infectada por el VIH, también debe expresar un correceptor al que se unirá la gp41, produciendo entonces la fusión del virus y la célula. Existen dos tipos de correceptores, presentes en tipos distintos de células: CXCR-4: se encuentra en los linfocitos T CCR-5: se encuentra en monocitos y macrófagos Por este motivo diferentes cepas de VIH pueden afectar predominantemente a los linfocitos o macrófagos, de acuerdo al correceptor que utilicen. De este modo las glicoproteínas de membrana - gp120 y gp41 - se unen al receptor CD4 y al correceptor - CXCR4 o CCR5 respectivamente, y así se produce la fusión. Una vez producida esta fusión se liberan dentro del citoplasma las dos copias de ARN viral y las enzimas transcriptasa inversa e integrasa. CICLO VIRAL Una vez dentro de la célula el VIH comienza su ciclo: 1. Retrotranscripción: en el citoplasma celular la enzima transcriptasa inversa convierte en ARN viral en ADNc. Muchas drogas (AZT, ddc, ddi) actúan a este nivel interfiriendo con esta enzima. 2. Integración: el ADN viral así formado migra hacia el núcleo donde es integrado al ADN celular con la ayuda de la integrasa. Una vez incorporado el genoma celular el ADN viral pasa a llamarse provirus. El virus VIH puede permanecer sin multiplicarse en una célula porque en ella su replicación se vio restringida. Estas células infectadas serán activadas luego por diferentes citoquinas, entre ellas el factor de necrosis tumoral (TNF) y la

12 460 interleuquina 6 (IL-6), dando lugar a la formación de la progenie viral lo que lleva a la muerte de las células T infectadas y a la fusión con otras células no infectadas para formar células gigantes multinucleadas. Las células T infectadas y lisadas liberan gran cantidad de partículas virales que infectaran a las células vecinas, pero además se libera la proteína de envoltura externa, soluble, que es capaz de unirse a la molécula CD4 de otras células y hacerlas vulnerables a la lisis por el complemento y a la toxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Por lo tanto cuando un linfocito se pone en contacto con su antígeno, es estimulado y se activa, así comienza a duplicar su ADN y el material genético viral integrado a su genoma. 3. Transcripción: para la producción de nuevos virus se necesita de ARN mensajero, sintetizado en el proceso de transcripción utilizando enzimas de origen celular. Los genes virales controlan este proceso a través de, por ejemplo, el gen tat. Otras infecciones por organismos tales como Mycobacterium tuberculosis pueden acelerar el proceso de transcripción. 4. Traducción: el ARNm procesado en el núcleo es transportado al citoplasma, aquí el gen rev es critico, sin la proteína rev no existirían proteínas estructurales. En el citoplasma el ARNm, utilizando la maquinaria de síntesis proteica celular, sintetiza las largas cadenas de proteínas y enzimas virales. 5. Ensamblaje y brotación: las proteínas del core, las enzimas y el ARN se ubican debajo de la membrana celular, mientras que las proteínas de envoltura viral se agregan a la membrana celular. Esto da origen a formas virales inmaduras (no infecciosas aún) que surgen de la superficie celular adquiriendo una envoltura que incluye proteínas virales y celulares. Las largas cadenas proteicas que conforman esta partícula viral inmadura son clivadas en pequeñas estructuras por una enzima viral, proteasa. Existen drogas inhibidoras de la proteasa como saquinavir, titonavir, indinavir, nelfinavir, que interfieren en este paso del ciclo viral. De este paso resulta una partícula viral infecciosa. Luego, al momento de la activación del linfocito, el material viral se multiplica y tiene lugar la liberación de la progenie viral por dos mecanismos posibles: Nuevas generaciones de partículas infectivas por gemación (figura 5). Se acumulan partículas virales en el interior de la célula infectada, produciéndose la destrucción de ésta, liberándose al exterior esas partículas virales, la mayoría de las cuales son defectivas ya que carecen de la cubierta necesaria. EVENTOS DE LA INFECCIÓN La vía sexual implica la entrada del virus a través de las mucosas: orofaríngea, genital y anal. La efectividad de la transmisión es mayor si es por vía parenteral. En las superficies mucosas, además de las células epiteliales se encuentran las células de Langerhans; las mismas tienen función de células presentadoras de antígenos (CPA). A nivel de las submucosas también se hallan presentes células de Langerhans y macrófagos. Las partículas virales que viajan en las secreciones vaginales o en el semen, atraviesan la barrera mucosa (con mayor facilidad si está lesionada, si bien esto no constituye un factor limitante) y se encuentran en la mucosa o la submucosa con las CPA. Estas células reconocen a la partícula viral como extraña, la incorporan a su superficie o la procesan por medio de fagocitosis, procesando también los antígenos virales para ser presentados a los linfocitos. El macrófago es incapaz de destruir a la partícula viral. Se limita a procesarla, y en el interior de un macrófago es posible encontrar innumerables partículas virales. También a este nivel la partícula viral puede encontrarse además con los linfocitos CD4+. Por lo tanto, el virus una vez atravesada la barrera mucosa puede: a) quedar dentro de un macrófago, b) ser pre-

13 461 Figura 5. Ciclo replicativo del VIH. A) Vista general. B) Transcripción reversa. Durante este paso el ARN viral es retrotranscripto en ADN de doble cadena y las secuencias terminales son parcialmente duplicadas de modo tal que lleva a la formación de regiones de regulación (LTR) compuestos por las regiones U3-R-U5. C) Organización del genoma proviral del VIH-1 y VIH-2. El genoma codifica para proteínas estructurales y enzimas que son empaquetadas en la progenie viral (recuadros rayados) y para proteínas reguladoras o accesorias (recuadros lisos). Virion Envelope Nucleocapsid Adsorption to receptor B RNA A Maduration Penetration and uncoatig R U5 U3 R LRNA Reverse transcription Capsid ensamby Traslation Pre - Integration complex DNA U3 R U5 U3 R U5 Provirus Integration Budding Transcription HIV-1 LTR rev tat vif gag pol LTR nef env vpr vpu HIV-2 LTR vif gag rev tat pol LTR nef env vpx vpr sentado a los linfocitos CD4 por las CPA, o c) adherirse directamente a los linfocitos CD4+ y comenzar a multiplicarse en su interior. Posteriormente, los linfocitos CD4+ y los macrófagos con las partículas virales en su interior, o las partículas virales libres, se dirigen hacia los ganglios linfáticos regionales. En los centros germinales de estos ganglios regionales se encuentran otras células con un papel fundamental en la patogenia del VIH: las células foliculares dendríticas. Estas tienen en su superficie numerosas proyecciones digitiformes con receptores CD4, a los cuales se unirán las partículas virales libres de la circulación, atrapando de esta manera innumerables virus. Estos son presentados por estas células a todos los linfocitos que, circulando por la linfa o la sangre, pasan por dichos ganglios, siendo así infectados. De ese modo, a partir del ganglio regional el virus se disemina a todo el organismo, a todos los tejidos con células que tengan receptores y correceptores que las hagan pasibles de ser infectadas, multiplicando de esta

14 462 manera la infección. Las partículas virales se diseminan por todo el organismo, sembrando varios órganos, particularmente órganos linfoides como nódulos linfoides, bazo, amígdalas y adenoides. Si bien tiene una diseminación sistémica, el blanco fundamental del VIH es el sistema inmune y dentro de éste, los linfocitos CD4+. Una vez en la sangre, se producen los eventos tempranos de la infección por el VIH. En esta etapa temprana, se puede detectar gran cantidad de partículas virales a nivel plasmático. Esto se expresa como carga viral, y en esta etapa temprana de la infección puede llegar a 10 millones o más de partículas por ml de plasma (10 7 /ml). Estas partículas tienen una corta vida media libre en el plasma (aproximadamente unos minutos). Los linfocitos CD4 que están produciendo virus tienen una vida media de 1-2 días. La partícula viral, una vez liberada al plasma, tiene que buscar nuevas células con receptores CD4 para poder infectar y continuar su ciclo de replicación viral. En esta fase aguda el número de células CD4+ en la circulación decrece en 20 a 40%, quizás por muerte celular o por dejar la circulación y dirigirse a los órganos linfoides para preparar la respuesta inmune. Dos a cuatro semanas luego de la exposición, cerca del 70% de las personas sufren síntomas similares a una gripe (síndrome retroviral agudo). El sistema inmune enfrenta la infección mediante las células T killer y los anticuerpos producidos por los linfocitos B, logrando una reducción dramática de los niveles de virus. En el momento inicial de la infección existen muchas partículas libres en plasma. Pero en un periodo de dos a tres meses se van generando una serie de respuestas por parte del sistema inmune del huésped, produciéndose de manera espontánea una drástica caída de la carga viral, sin que medie un tratamiento antiviral. Este nivel de carga viral (setpoint) varía de individuo a individuo y es predictivo de la evolución clínica a largo plazo. Los mismos permanecen bajos (dependiendo del sistema inmune de cada individuo) durante un largo periodo de tiempo, que puede llegar a 10 años o más. En determinado momento, la carga viral plasmática comienza a aumentar nuevamente, coincidiendo con la etapa clínica de SIDA. A esta fase temprana le sigue el período de infección activa inaparente, no obstante lo cual no significa que no haya replicación viral. Si bien la carga viral cae, y no existen síntomas, la replicación viral continúa permanentemente. Se establece un equilibrio, por el cual habría una producción y destrucción de 10 billones de partículas virales por día, así como una producción y destrucción de 2 billones de linfocitos CD4 por día. Este equilibrio se mantiene aproximadamente por 10 años (dependiendo de la carga viral inicial o setpoint, el estado inmunológico de la persona infectada, entre otros). Durante este período la replicación viral no tiene lugar a nivel sanguíneo, la misma se da en los tejidos linfoides profundos: los ganglios linfáticos y el tejido linfoide asociado a las mucosas (gastrointestinal, respiratoria, etc.) Período de enfermedad clínica: existen variaciones en el período de infección sin clínica de enfermedad, distintos factores influyen en la progresión hacia la enfermedad: edad, diferencias genéticas entre los individuos, la virulencia de las diferentes cepas y la coinfección con otros microorganismos. La existencia de mutaciones en los correceptores puede influenciar el curso evolutivo hacia la enfermedad. Por ejemplo una mutación específica en una de las dos copias del gen del correceptor CCR5 tiene como resultado un curso más lento hacia la enfermedad. Varios estudios demuestran que los individuos con alta carga viral circulante (setpoint) desarrollan más rápidamente los síntomas de SIDA y mueren. Las drogas utilizadas para prevenir o tratar las infecciones asociadas al SIDA han permitido prolongar y mejorar la calidad de vida. Las combinaciones de drogas que incluyen un inhibidor

15 463 Cuadro 1. Enfermedades indicadoras de Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA)* Infecciones oportunistas Protozoos Hongos Virus Bacterias Neoplasias Oportunistas Sarcoma de Kaposi Linfoma primario del cerebro Otros linfomas no Hodgkin Otros Síndrome de caquexia por VIH Encefalopatía por VIH Neumonia Intersticial linfoide Toxoplasmosis cerebral Criptosporidiasis con diarrea Isosporidiasis con diarrea Candidiasis esofágica, traqueal y pulmonar Neumonia por Pneumocystis carinii Criptococosis extrapulmonar Histoplasmosis diseminada Coccidiomicosis diseminada Enfermedad por citomegalovirus Infección peristente o diseminada por virus de Herpes simple Leucoencefalopatía multifocal progresiva Infección diseminada por miembros del complejo Mycobacterium avium Infecciones por micobacterias atípicas Tuberculosis extrapulmonar Septicemia recurrente por Salmonella sp Infecciones por micobacterias atípicas Tuberculosis extrapulmonar Septicemia recurrente por Salmonella sp. Infecciones múltiples o recurrentes por bacterias piogénicas de la proteasa con dos inhibidores de la transcriptasa reversa, reducen la carga viral a niveles muy bajos y retrasan la progresión de la enfermedad por períodos muy prolongados. Se considera afectados de SIDA a los pacientes infectados por el VIH que presentan alguna de las 26 complicaciones (infecciones o enfermedades diagnosticas de estadio SIDA - entre ellas la tuberculosis y/o candidiasis esofágica) o que tienen un conteo de linfocitos CD4+ inferior a 200/µL. Queda clara entonces la importancia clínica de la cifra de linfocitos CD4+, independientemente de la existencia o no, de manifestaciones clínicas. Cuando el paciente alcanza el estadio clínico de SIDA, aparecen infecciones oportunistas características y neoplasias asociados a dicha patología (cuadro 1). Los monocitos y macrófagos infectados por el virus, y relativamente resistentes a la muerte celular, viajan por todo el cuerpo llevando el VIH a varios órganos especialmente a los pulmones y al cerebro; 40 a 50% de las personas infectadas con VIH frecuentemente tienen manifestaciones neurológicas. La célula microglial y el macrófago son las células del cerebro infectadas por el VIH de manera habitual, pero también pueden infectarse las neuronas y las células gliales. La liberación de sustancias neurotóxicas o factores quimiotácticos por los monocitos y las células microgliales favorecen el desarrollo de respuestas inflamatorias en

16 464 el cerebro. También es probable que exista un efecto citopático directo del virus sobre las neuronas dando lugar a cuadros como la encefalopatía o complejo de demencia del SIDA. Paradójicamente, aunque el VIH causa inmunodeficiencia, el curso de la enfermedad esta caracterizado por la hiperactivación del sistema inmune con consecuencias negativas. La activación crónica del sistema inmune durante la enfermedad puede resultar en una estimulación masiva de las células B, perdiendo éstas la habilidad de producir anticuerpos contra otros patógenos. Esta activación crónica lleva también a la apoptosis (o muerte celular programada) y al aumento en la producción de citoquinas que no solo estimulan la replicación del VIH, sino que también tiene efectos perjudiciales. RESPUESTA INMUNE La misma es iniciada por la inmunidad mediada por células. La respuesta humoral contra las proteínas virales más importantes (Gag, Pol, Env) aparece entre tres semanas y tres meses luego de la exposición viral. Posee dos componentes: a) Componente celular: Respuesta de los linfocitos T CD8+ citotóxicos que reconocen en la superficie de la célula infectada la presencia de partículas virales unidas a moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) de tipo I; estos linfocitos liberan entonces enzimas contenidas en sus gránulos (por ej.: perforinas), que determinan la destrucción de la célula por un efecto citolítico directo. Los linfocitos T CD8+ pueden actuar también por otro mecanismo, liberando mediadores o linfoquinas (quemoquinas), sustancias solubles con función quimiotáctica, que atraen al foco nuevas células defensivas; pero estas quemoquinas se unen también a los receptores para quemoquinas presentes en las células pasibles de ser infectadas, bloqueando la fusión de nuevas partículas virales a estas células. Los linfocitos T CD4+ reconocen a su vez las partículas virales procesadas por las CPA y presentadas en conjunto a moléculas MHC de tipo II, produciendo así linfoquinas que se unen a sus receptores (de quemoquinas) bloqueando también la unión de nuevos virus a células, pero sobre todo la función principal del linfocito T helper es potenciar (por medio de sus citoquinas estimuladoras) la respuesta de los linfocitos T CD8+, ya que ellos son el principal efector de la respuesta inmune. b) Componente humoral: La misma está dada por los linfocitos B, los cuales reconocen en las CPA la presencia de sustancias antigénicas y reaccionan activándose, transformándose en plasmocitos y produciendo anticuerpos anti-vih. Si bien el sistema inmune es capaz de montar una respuesta de tipo humoral, se ve abrumado por la rapidez con la que el virus, producto de su variabilidad antigénica, continuamente elabora partículas virales hijas capaces de evadir la neutralización. Se da así un ciclo de neutralización seguido por la creación de mutantes de escape, en el cual el suero, en un punto temporal determinado, puede neutralizar el virus circulante contemporáneo, pero no al virus aislado en un momento ulterior. Este fenómeno condiciona, hoy en día, el desarrollo de una vacuna efectiva contra el VIH. No obstante se producen anticuerpos neutralizantes que pueden ser específicos de tipo (específicos para un aislamiento viral determinado) o pueden ser específicos de grupo (capaces de abarcar una gama mayor de aislamientos virales). La mayoría de estos anticuerpos reconocen la región V3 de la proteína gp120, pudiendo impedir el clivaje y cambio conformacional (en el interior de gp120) necesarios para el ingreso del virión para la formación de sincicios. Los anticuerpos neutralizantes

17 465 específicos de grupo reconocen epitopos internos de gp41, y epitopos localizados cerca de la unión de esta proteína con gp120. Cabe mencionar que además se elaboran anticuerpos contra las demás proteínas virales. La producción de anticuerpos puede detectarse de dos a ocho semanas después de la infección, luego de la declinación de la viremia inicial. La seroconversión se inicia con la respuesta IgM anti proteína Gag; la respuesta IgG se produce entre la primera semana y la 41. En tal sentido, los primeros marcadores serológicos en ser evidenciados son IgG anti-p24 e IgG anti-gp120, seguido de IgG anti-gp41. Se ha visto que durante los primeros meses de la infección existe un aumento en el título de anticuerpos anti-p24 en simultáneo a una disminución en el nivel de antígeno p24. Luego de este tiempo el título de tales anticuerpos permanece estable, invirtiéndose esta relación durante la última etapa de la enfermedad (caen los niveles de IgG anti-p24 y suben los de p24) (figura 6). Como se mencionó anteriormente, luego de la infección aguda por VIH sigue una fase de infección activa inaparente con una duración de entre 1 y 15 años, en la cual los pacientes permanecen asintomáticos pero con una declinación lenta y progresiva de su sistema inmune. Aquellas funciones dependientes de las células T CD4+ son las primeras en verse afectadas. Después de este período el sistema inmune, que hasta ese momento había sido capaz de equilibrar la producción y destrucción de las partículas virales, fracasa y ya no logra contener la replicación viral, se dispara nuevamente la carga viral y comienzan las manifestaciones de la etapa SIDA. Las mismas aparecen cuando los linfocitos disminuyen por debajo de 200 por mm 3 (siendo el valor normal: por mm 3, aproximadamente). Figura 6. Curso cronológico y fases de la enfermedad por VIH. Las diferentes fases de la enfermedad por VIH están definidas en función de los niveles de células T CD4+ y la ocurrencia de enfermedades oportunistas.

18 466 La perdida progresiva de linfocitos T CD4+ (calculada entre 60 y 70 linfocitos CD4+ por mm 3 por año), puede atribuirse a una variedad de mecanismos, entre ellos: Muerte celular directa: los virus se multiplican en su interior dando lugar a grandes progenies virales que al liberarse por gemación destruyen la célula. Formación de sincicios: las células infectadas son capaces de fusionarse con otras células infectadas y además con células no infectadas, formando de este modo células gigantes denominadas sincicios. Apoptosis: la presencia de material genético y proteínas virales activan el mecanismo apoptótico del linfocito T CD4+. Por otra parte, células no infectadas también pueden sufrir este proceso por señales inapropiadas recibidas a partir de células infectadas. Observadores inocentes: los linfocitos T CD4+ con partículas virales en su superficie son atacados por los linfocitos T CD8. Anergia: se ha observado en cultivos celulares que existiría alguna señal del VIH capaz de inhibir a las células T CD4+ impidiendo futuras respuestas a la estimulación inmunitaria. Daño a los precursores celulares: algunos estudios sugieren que el virus destruye precursores celulares con funciones inmunes especiales, así como también, partes de médula ósea y de timo necesarias para el desarrollo de tales células. La presencia de híbridos genómicos virales de ADN/ARN resulta tóxica para el linfocito. MÉTODOS DE ESTUDIO El diagnóstico de la infección por VIH tiene distintos objetivos, uno de ellos es el diagnóstico per se de personas que se sospechan pueden estar infectadas y requieren de atención médica, consejo no directivo y educación sanitaria respecto a su estado. Otro de los objetivos del diagnóstico de VIH es la seguridad en las transfusiones, productos hemoderivados y donaciones de órganos. Finalmente, otros objetivos del diagnóstico de la infección por VIH, son la aplicación de programas de vigilancia serológica de esta infección (estudios de incidencia y prevalencia, tendencias en grupos poblacionales, etc.) o en programas de investigación clínica, farmacológica, virológica e inmunológica. El método más comúnmente empleado para el diagnóstico de laboratorio de la infección por VIH se basa en técnicas serológicas que detectan anticuerpos del virus en el suero de las personas infectadas. En este sentido, se dispone de reactivos para pruebas que pueden ser automatizadas, total o parcialmente, y aplicarse paralelamente a un gran número de sueros. Estas pruebas utilizadas para el diagnóstico de una persona individualizada, reciben el nombre de pruebas de diagnóstico de la infección por VIH, pero también pueden utilizarse como un instrumento para desechar o rechazar productos sanguíneos o biológicos contaminados, en cuyo caso se denominan de cribado. Conviene subrayar, que la estrategia a emplear en el cribado rutinario es distinta a la utilizada para el diagnóstico individualizado de la infección por VIH. De forma conceptual, se denominan pruebas diagnósticas a las que se emplean de forma individualizada en el suero de una persona y pruebas de cribado (o tamizaje) cuando se aplican a un conjunto de muestras y su finalidad no es la diagnóstica. Ensayos serológicos de tamizaje Enzimoinmunoanálisis (EIA). La detección de anticuerpos anti-vih con técnicas de EIA es el método más empleado en la actualidad existiendo distintos principios en la detección de los anticuerpos (ELISA indirecto, competitivo, sandwich y captura). La mayoría de los

19 467 ensayos aprobados emplean antígenos de VIH inmovilizados capaces de fijar anticuerpos IgG a partir del suero de un paciente. La sensibilidad del ELISA oscila entre un 93 a un 100%, pudiendo presentarse resultados falsos negativos durante la infección primaria, en pacientes inmunosuprimidos, o por errores de procesamiento (rotulado y manipulación). Por otro lado, la especificidad de esta técnica es del 99%; los resultados falsos positivos se presentan por error humano o enfermedades autoinmunes entre otras. Los ensayos de primera generación utilizan lisado viral obtenido a partir de líneas celulares de linfocitos T humanos. Poseen, sin embargo, una gran capacidad de captación de cualquier tipo de anticuerpos anti-vih presente en la muestra. Las pruebas de segunda y tercera generación utilizan como Ag proteínas recombinantes (PR) o péptidos sintéticos (PS). Son muy sensibles y los resultados son más reproducibles, al utilizar un antígeno más normalizado y purificado. Actualmente, las pruebas de cuarta generación reconocen no solo los anticuerpos señalados anteriormente sino también antígeno p24 viral, permitiendo acortar el período ventana. Existen reactivos comercializados con los antígenos y formatos citados para la detección de anticuerpos anti-vih-1 y anticuerpos anti-vih Para la detección específica de anticuerpos anti-vih-2 solamente se dispone de EIA con péptidos sintéticos o lisado viral y formato indirecto. La confirmación de infección por VIH-2 se realiza con Western Blot y PCR específica. Aglutinación. Estas pruebas están basadas en la aglutinación de antígenos de VIH que previamente han sido fijados a partículas capaces de aglutinarse en presencia de suero que contenga anticuerpos anti-vih. Este tipo de pruebas comenzaron a desarrollarse a mediados de los años 80 como alternativa a los EIA. Pueden utilizar partículas de gelatina o partículas de látex, y como antígenos, lisados virales, péptidos sintéticos o proteínas recombinantes. Son técnicas de manejo muy sencillo, rápidas, de lectura visual, apenas requieren instrumentación y pueden adaptarse a un gran número de sueros. Su sensibilidad parece comparable al EIA, pero su grado de especificidad es mucho menor. Estas técnicas son las indicadas para ser utilizadas en laboratorios con escasa dotación instrumental o con un manejo reducido en cuanto al número de muestras. Pruebas de EIA de membrana (Dot-Blot). En estas pruebas los anticuerpos anti-vih son detectados mediante un método inmunoenzimático. El antígeno, compuesto por proteínas recombinantes o péptidos sintéticos de uno o ambos virus, está fijado a tiras de nitrocelulosa. La mayoría de las pruebas rápidas de detección de anticuerpos emplean este principio. Tienen lectura visual y no requieren instrumentación; su sensibilidad y especificidad aún no están suficientemente evaluadas. Su ventaja y principal indicación es la posibilidad de identificación entre los dos tipos de virus, y su mayor inconveniente (en países como el nuestro) es su elevado costo. Pruebas fluorimétricas. Han sido las últimas en incorporarse a la oferta diagnóstica (a partir de 1990). Los antígenos específicos están ligados a micropartículas y el indicador de la reacción es un fluorocromo que actúa como sustrato. La fluorescencia emitida durante la reacción es medida por un fluorómetro. Tiene por tanto lectura objetiva y requiere un nivel de instrumentación similar a las técnicas de EIA. Dada su reciente introducción en el mercado, hay poca experiencia y aunque la posibilidad de automatización y el procesamiento de gran número de muestras son muy ventajosas, es necesario estudiar su sensibilidad y valorar el costo de su incorporación de forma rutinaria.

20 468 Pruebas de confirmación Dada las implicancias clínicas y sociales de un resultado falso positivo, las pruebas serológicas deben ser confirmadas empleando técnicas con fundamentos distintos y más específicos. Por lo general, se utilizan para la confirmación de sueros positivos, pero en determinados casos pueden emplearse también para continuar el estudio en casos dudosos, dada su mayor sensibilidad en muchos casos. Existen diferentes pruebas de confirmación, entre ellas, las más utilizadas son las basadas en la inmunoelectrotransferencia o Western Blot (WB), la inmunofluorescencia indirecta (IFI) y la radioinmunoprecipitación (RIPA). Western Blot: técnica de inmunoelectrotransferencia, permite una discriminación puntual de anticuerpos frente a las distintas proteínas del virus. Las tiras de nitrocelulosa en las que se han transferido los antígenos virales contienen, generalmente, casi todas las proteínas estructurales del VIH y algunas proteínas precursoras de aquellas. La técnica consiste en la incubación de una de esas tiras con el suero problema durante un tiempo que oscila entre 2 a 4 horas y hasta 18 horas, tras lo cual se revela la presencia de anticuerpos frente a las diferentes proteínas del virus mediante reacciones inmunoenzimáticas distintas, dependiendo del fabricante. El resultado es la aparición de bandas coloreadas de mayor o menor intensidad, en el lugar de la tira de nitrocelulosa en el que están situadas las proteínas del VIH contra las cuales existen anticuerpos en el suero problema. Se identificarán, por su posición en la tira según peso molecular, comparándolas con el control positivo, las bandas especificas de reactividad (gp160, gp120, p66, p55, p51, etc.). Existen distintos criterios de positividad para el Western Blot. El propuesto por la OMS resulta el más sensible cuando se manejan sueros de muy variada procedencia poblacional. Adoptando este criterio un suero es considerado positivo cuando presenta reactividad al menos frente a dos de los siguientes 3 antígenos virales: p24, gp120 y gp4l. El criterio propuesto por el CDC (el utilizado en nuestro país) indica que un suero es positivo cuando presenta reactividad frente a p24 más alguna de las glucoproteínas de superficie (gp160/120, gp41). Los sueros negativos no deberán mostrar reactividad frente a ninguna de las proteínas presentes en la tira. Finalmente los sueros se denominan indeterminados por Western Blot cuando, existiendo reactividad frente a una o más proteínas, no cumple el criterio de positividad adoptado (figura 7). Con el Western Blot pueden darse falsos negativos, posibilidad que debe tenerse en cuenta en individuos con factores de riesgo, o signos de infección por VIH, y en casos de exposición reciente al virus. Se han descrito ensayos indeterminados por Western Blot en personas con factor reumatoideo, lupus eritematoso sistémico (LES), bilirrubinemias elevadas, anticuerpos contra el sistema HLA, en pacientes hemodializados, y otras causas. En otros casos la indeterminación en el Western Blot de VIH-1 puede ser causada por una infección causada por VIH-2 u otros retrovirus (VLTH-I, VLTH-II). En aquellos sueros indeterminados, el seguimiento debe prolongarse durante al menos 6 meses para verificar si existe un cambio en el patrón de anticuerpos, hacia la positividad, o por el contrario, hacia la desaparición de las bandas detectadas inicialmente. Las personas con resultados persistentemente indeterminados al cabo de 6 meses, en ausencia de factores de riego, síntomas o hallazgos clínicos compatibles con la infección por VIH, deben considerarse negativas para anticuerpos anti-vih. Sin embargo, no deberían donar sangre, plasma, semen u órganos y deberán ser informadas correctamente sobre el significado de su situación. Inmunofluorescencia indirecta: la confirmación por esta técnica está basada en la demos-