DETERMINACIÓN DE AMILASA EN SUERO Y EN ORINA

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1 DETERMINACIÓN DE AMILASA EN SUERO Y EN ORINA I. INTRODUCCIÓN La amilasa es una enzima que hidroliza el almidón, se encuentra en plantas y animales, de acuerdo a si liberan alfa o beta maltosa, se las clasifica en alfa y beta amilasa. La amilasa salival y pancreática humana está dentro del grupo de las alfa. La alfa amilasa escinde los enlaces α 1,4 glicósidos de los polisacáridos (almidón y glucógeno). La amilosa presenta enlaces α 1,4 glicosídicos, comprende sólo el 20% del almidón ye s soluble en agua, la otra fracción, amilopectina es insoluble en agua, esta última difiere de la amilosa porque contiene además enlaces α 1,6 glicosídicos. La Km para la amilasa de origen pancreático y salival es de 0,8 y 0,25, el ph óptimo es de 6 a 7 y el cloruro es requerido para su activación. La amilasa normalmente se encuentra en orina, la que constituye su vía de eliminación; sufre variaciones en relación con los niveles sanguíneos. La actividad de la amilasa en orina es una prueba más sensitiva, y las elevaciones tienden a persistir más tiempo que las elevaciones séricas. La amilasa se encuentra elevada en el suero de pacientes con pancreatitis alcanzando los valores más elevados entre las 24 y 30 horas posteriores al ataque, declinando luego para volver a los niveles normales entre las 24 a 48 horas siguientes. También se ve aumentada en este caso la excreción urinaria de la enzima, persistiendo la hiperamilasuria 3 a 5 días, luego de que la actividad sérica ha alcanzado los niveles normales. Es posible también encontrar valores aumentados de amilasa en cualquier caso de abdomen agudo o intervenciones quirúrgicas en regiones próximas al páncreas. Las parotiditis bacterianas y paperas se asocian también con elevaciones en los niveles de amilasa sérica. Así también la elevación puede ocurrir en otras condiciones, que incluyen úlcera duodenal o gástrica perforada, enfermedad séptica aguda del colédoco, trombosis mesentérica, obstrucción intestinal, peritonitis, encefalitis viral, cirrosis, después de un trauma cerebral, embarazo ectópico y neumonía. Fundamento del Método.- El sustrato, almidón tamponado, se incuba con la muestra, produciéndose hidrólisis enzimática. Esta se detiene por el agregado del reactivo de yodo, que al mismo tiempo produce color con el remanente de almidón no hidrolizado. La disminución de color respecto de un sustrato color (sin muestra = suero) es la medida de la actividad enzimática, que se expresa en unidades amilolíticas/decilitro (UA/dL), comparables con las unidades sacarogénicas/decilitro. II. OBJETIVOS Determinar la amilasa sérica y urinaria en personas normales y/o con procesos patológicos. III. MATERIALES Y REACTIVOS - Suero sanguíneo y orina (muestra) - Tubo de ensayo 13 x 100 mm - Amilokit (sustrato 1 y reactivo de yodo 2) - Gradilla Q.F. FREDY MARTOS RODRÍGUEZ 1

2 - Pizeta 500 ml con agua destilada - Baño María 37 C - Probeta de 200 ml - Espectrofotómetro y cubetas semimicro - Micropipeta μl - Micropipeta μl - Pipeta de 10 ml - Puntas amarillas y azules p/micropipeta IV. DIAGRAMA EXPERIMENTAL - Armar el siguiente sistema: Componentes Tubos C D Sustrato 1 1 ml 1 ml Preincubar en baño María a 37 C Muestra - 20 μl Incubar a 37 C por 7 minutos y medio exactos, agregar rápidamente: Reactivo de yodo 2 1 ml 1 ml Mezclar por agitación suave Retirar los tubos del baño María y agregar. Agua destilada 8 ml 8 ml - Mezclar por inversión. - Leer en espectrofotómetro a 640 nm, llevando a cero el equipo con agua destilada. - El color de la reacción es estable durante 1 hora por lo que la absorción debe ser leída durante este lapso. Cálculos: C - D Amilasa (UA/dL) = x 1000 C Valores de referencia: Condición clínica Valores de referencia Suero (UA/dL) Orina (UA/h) Normal Pancreatitis aguda 300 a Más de 900 Pancreatitis crónica Hasta 200 Más de 300 Parotiditis 200 a a 750 Parotiditis con complicación pancreática Más de 350 Más de 750 Procesos abdominales agudos (sin pancreatitis) Normal Normal Unidades.- Una unidad amilolítica (UA) es la cantidad de enzima contenida en 100 ml (1 dl) de muestra, que puede hidrolizar 10 mg de almidón en 30 minutos, en las condiciones de reacción. En esta técnica se incuban 20 μl de muestra con 0,5 mg de almidón contenidos en 1 ml de sustrato 1 durante 7,5 minutos, lo que equivale a incubar 100 ml de suero con mg de almidón durante 30 minutos. Si todo el almidón fuera hidrolizado, la actividad amilásica de la muestra sería de 1000 Q.F. FREDY MARTOS RODRÍGUEZ 2

3 UA/dL. Para obtener las unidades de actividad amilásica, la fracción de almidón digerido se multiplica por V. RESULTADOS VI. DISCUSIÓN Q.F. FREDY MARTOS RODRÍGUEZ 3

4 VII. CONCLUSIONES VIII. BIBLIOGRAFÍA Q.F. FREDY MARTOS RODRÍGUEZ 4

5 ESQUEMA DEL PROCEDIMIENTO DE LA PRÁCTICA Q.F. FREDY MARTOS RODRÍGUEZ 5