DHEA ELISA. Inmunoensayo Enzimático de diagnóstico in vitro para la determinación cuantitativa de DHEA en suero humano.

Transcripción

1 Instrucciones de Uso DHEA ELISA Inmunoensayo Enzimático de diagnóstico in vitro para la determinación cuantitativa de DHEA en suero humano. RE C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBL-International.com D Hamburg, Germany Fax: +49 (0)

2 1. USO PROPUESTO Inmunoensayo Enzimático de diagnóstico in vitro para la determinación cuantitativa de Dehydroepiandrosterone (DHEA) en suero humano. 2. IMPLICACIONES CLÍNICAS La deshidroepiandrosterona (DHEA; androstenolona; 3b-hidroxi-5-androsteno-17-uno) es un esteroide C19 producido en la corteza suprarrenal y, en menor medida, en las gónadas. La DHEA sirve como un precursor en la síntesis de testosterona y estrógeno. Debido a la presencia de un grupo 17-oxi (más que hidroxilo), la DHEA tiene una actividad androgénica relativamente débil, que se ha calculado al ~10% de la de la testosterona. Sin embargo, en recién nacidos, niños peripuberales y mujeres adultas, los niveles circulantes de DHEA pueden ser varias veces más altos que las concentraciones de testosterona, y puede producirse la conversión rápida del tejido periférico a andrógenos más potentes (androstenediona y testosterona). Asimismo, la DHEA tiene una afinidad relativamente baja para la globulina fijadora de hormonas sexuales. Estos factores pueden aumentar la biopotencia fisiológica de la DHEA. La función fisiológica de la DHEA no se ha definido en forma concluyente. Se informó una variedad de efectos in vitro, incluidos los efectos antiproliferativos en distintas líneas celulares y los efectos sobre el metabolismo de células enzimáticas. Los estudios in vivo indican que la DHEA puede afectar el metabolismo del colesterol y los lípidos, la sensibilidad y secreción de la insulina y la función inmunitaria. Se informaron niveles anormales de la DHEA en casos de esquizofrenia y obesidad. Se ha propuesto la administración terapéutica de la DHEA para distintas afecciones, incluida la obesidad y la enfermedad cardiovascular. Los niveles de la DHEA en suero son relativamente altos en los fetos y los recién nacidos, bajos durante la niñez y aumentan durante la pubertad. El aumento de los niveles de la DHEA durante la adrenarquía puede contribuir al desarrollo de vello púbico secundario. Los niveles de la DHEA en suero se reducen progresivamente después de los treinta años. No se producen cambios constantes en los niveles de la DHEA en suero durante el ciclo menstrual o el embarazo; sin embargo, la paridad puede reducir los niveles de la DHEA en suero en las mujeres premenopáusicas. La DHEA tiene una rápida tasa de depuración metabólica, en comparación con su conjugado sulfatado, DHEA-S. Debido a esto, los niveles de la DHEA en suero son entre cien y mil veces más bajos que los niveles de DHEA-S. Además, los niveles de la DHEA en suero muestran significativa variación diurna, que depende de la corticotropina (ACTH). Los niveles de la DHEA en suero aumentan en respuesta a la administración exógena de ACTH. La medición de la DHEA en suero es un marcador útil de la síntesis de andrógenos suprarrenales. Los niveles anormalmente bajos pueden producirse en casos de insuficiencia suprarrenal y los niveles elevados se producen en el caso de distintas enfermedades; incluidos el adenoma y carcinoma suprarrenal virilizante, los déficits de 21-hidroxilasa y 3b-hidroxiesteroide deshidrogenasa y, en algunos casos, el hirsutismo en mujeres. Dado que se produce muy poca DHEA en las gónadas, la medición de los niveles de la DHEA puede ayudar en la localización de la fuente de andrógenos en enfermedades virilizante 3. PRINCIPIO DEL ENSAYO El DHEA ELISA es un ensayo en fase sólida de inmunoadsorbción unido a enzimas (ELISA), basado en el principio de unión competitiva. Los pocillos de las placas están recubiertos con un anticuerpo policlonal dirigido contra un foci antigénico en la molécula DHEA. En las muestras de los pacientes DHEA endógena compite con un conjugado DHEAperoxidasa de rábano en la unión al anticuerpo recubierto. Después de la incubación el conjugado no unido se lava. La cantidad de conjugado de peroxidasa unido es inversamente proporcional a la concentración de DHEA en la muestra. Después de la adición de la solución de substrato, la intensidad de color desarrollado es inversamente proporcional a la concentración de DHEA en la muestra del paciente. Version / 5

3 4. ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES 1. Sólo para uso en diagnóstico in-vitro. Sólo para uso profesional. 2. Antes de comenzar el ensayo lea las instrucciones completa y cuidadosamente. Use la versión válida del prospecto que se ofrece con el juego de reactivos. Asegúrese de entenderlo todo. 3. En caso de daño severo del estuche del juego de reactivos, contacte por favor a IBL o a su suministrador en forma escrita antes de transcurrida una semana de la recepción. No utilice los componentes dañados en los ensayos pero guárdelos en forma segura para la reclamación. 4. Tome en cuenta el número de lote y la fecha de caducidad. No mezcle reactivos de diferentes lotes. No use reactivos vencidos. 5. Cumpla con las buenas prácticas de laboratorio y las pautas de seguridad. Use bata de laboratorio, guantes de látex desechables y gafas de protección cuando sea necesario. 6. Los reactivos de este juego que contienen materiales peligrosos pueden causar irritación ocular y cutánea. Vea MATERIAL SUMINISTRADO y las etiquetas para los detalles. Las Hojas de Datos de Seguridad de los materiales para este producto están disponibles en la página de internet de IBL o mediante solicitud directa a IBL. 7. Los reactivos químicos y los reactivos preparados o usados deben ser tratados como desechos peligrosos de acuerdo con las regulaciones nacionales sobre bioseguridad y pautas de seguridad. 8. El personal de limpieza debe ser capacitado por profesionales para el manejo de residuos peligrosos. 9. Evite el contacto con la Solución de Parada. Puede causar irritaciones y quemaduras en la piel. 10. Todos los reactivos de este juego que contienen suero o plasma humano han sido ensayados y encontrados negativos para anti-hiv I/II, HBsAg and anti-hcv. Sin embargo, la presencia de estos u otros agentes infecciosos no puede ser excluída en forma absoluta, por lo que estos reactivos deben ser tratados como potencialmente biopeligrosos a los efectos de su manipulación y eliminación. 5. ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD El juego de reactivos es enviado a temperatura ambiente y debe ser almacenado a 2-8 C. Manteniéndose alejado del calor o de la luz solar directa. El almacenamiento y estabilidad de muestras y reactivos preparados se detalla en los capítulos correspondientes. La placa de microtitulación es estable hasta la fecha de caducidad del juego de reactivos aún cuando la bolsa haya sido abierta, siempre que se vuelva a cerrar herméticamente y se almacene a 2-8 C. 6. TOMA Y ALMACENAMIENTO DE LAS MUESTRAS Suero Se deben observar las precauciones usuales para la venipuntura. Es importante preservar la integridad química de la muestra de sangre desde el momento de su toma hasta el ensayo. No emplee muestras fuertemente hemolizadas, lipémicas o ictéricas. Las muestras que presenten turbidez deben centrifugarse antes de ensayar para eliminar cualquier material particulado. Almacenamiento: 2-8 C -20 C (Alícuotas) Manténgase alejado del calor o de la luz solar directa. Estabilidad: 4 dias 3 meses Evite congelar y descongelar repetidamente. 7. MATERIALES SUMINISTRADOS Cantidad Símbolo Componente 1 x 12 x 8 MTP 1 x 6 x 1 ml CAL A-F 1 x 2 x 1 ml CONTROL 1+2 Placa de Microtitulación Tiras separables. Recubierto con anti-dhea anticuerpos (policlonal, conejo). Estándar A-F 0; 0.37; 1.1; 3.3; 10.0; 30.0 ng/ml Listo para usar. Contenido: DHEA, Suero humano, estabilizadores. Control 1+2 Listo para usar. Contenido: DHEA, alto y bajo, Suero humano, estabilizadores. Por concentraciones exactas vea las etiquetas de las ampollas o el certificado Control de Calidad. Version / 5

4 Cantidad Símbolo Componente 1 x 13 ml ENZCONJ 1 x 100 ml WASHBUF CONC 1 x 15 ml TMB SUBS 1 x 15 ml TMB STOP Conjugado Enzimático Listo para usar. Contenido: DHEA conjugado con HRP, estabilizadores. Solución Buffer de Lavado Concentrado (10x) Contenido: Solución buffer fosfatada, Tween. Solución de Substrato TMB Listo para usar. Contenido: TMB, Solución buffer, estabilizadores. Solución de Parada TMB Listo para usar. 1 M H 2 SO MATERIALES REQUIRIDOS PERO NO SUMINISTRADOS 1. Micropipetas (Multipette Eppendorf o dispositivos similares, < 3 % CV). Volúmenes: 20; 100; 250 µl 2. Vortex 3. Micropipeta multicanal de 8 canales con reservorio de reactivo 4. Frasco lavador, sistema automatizado o semi-automatizado de lavado de placas de microtitración 5. Fotómetro para placas de microtitulación capaz de leer absorbancias a 450 nm (longitud de onda de referencia nm) 6. Agua bidestilada o desionizada 7. Toallas de papel, puntas para las micropipetas y cronómetro 9. INDICACIONES PARA EL PROCEDIMIENTO 1. Cualquier manipulación inadecuada de las muestras o modificación del procedimiento de ensayo puede alterar los resultados. Los volúmenes a pipetear, los tiempos de incubación, las temperaturas y etapas de pretratamientos tienen que ser efectuados estrictamente siguiendo las instrucciones. Use sólo pipetas u otros dispositivos calibrados. 2. Una vez comenzado el ensayo, se deben completar todas las etapas sin interrupción. Asegúrese de que los reactivos, materiales y dispositivos necesarios estén listos en el momento adecuado. Permita que todos los reactivos y muestras alcancen la temperatura ambiente (18-25 C) y agite suavemente por rotación cada vial de reactivo líquido o muestra antes del uso. Evite la formación de espuma. 3. Evite la contaminación de los reactivos, pipetas pocillos y/o tubos. Emplee una punta desechable nueva para cada reactivo, estándar o muestra. No intercambie las tapas. Tape siempre los viales que no estén en uso. No reutilice los pocillos, tubos o reactivos. 4. Se recomienda ensayar las muestras por duplicado para poder identificar errores potenciales de pipeteo. 5. Use un esquema de pipeteo apropiado según las dimensiones de la placa. 6. El tiempo de incubación afecta los resultados. Todos los pocillos deben ser manipulados en el mismo orden y secuencia de tiempo. Para el pipeteo de soluciones en los pocillos se recomienda una pipeta de 8 canales. 7. El lavado de la placa de microtitulación es un paso importante. Los pocillos insuficientemente lavados conllevan a resultados erróneos. Se recomienda emplear una pipeta multicanal o un sistema automático de lavado. No deje secar los pocillos entre incubaciones. Cuide de no dañar el recubrimiento de las placas durante el enjuague y/o la aspiración. Enjuague y agregue los reactivos cuidadosamente. Al enjuagar cerciórese que todos los pocillos estén completamente llenos con la Solución Buffer de Lavado y que no haya residuos en ellos. 8. La humedad afecta los pocillos y tubos recubiertos. No abra la bolsa hasta que alcance la temperatura ambiente. Los pocillos o tubos que no se empleen deben guardarse inmediatamente en la bolsa resellada con desecante. Version / 5

5 10. INSTRUCCIONES PARA LA PREPARACIÓN DEL ENSAYO Preparación de componentes concentrados Diluya / disuelva Componente Diluyente Relación Notas Almacenamiento Estabilidad 100 ml WASHBUF CONC agregue 1000 ml agua bidest. 1:10 Mezcle vigorosamente. 2-8 C 4 semanas Dilución de Muestras Las muestras que se sospeche que contienen concentraciones mayores que la del estándar más alto tienen que ser diluidas con Estándar A. Para obtener los resultados correctos multiplique las mediciones obtenidas por el factor de dilución. 11. PROCEDIMIENTO DE ENSAYO 1. Pipette 20 µl de Estándar, Control y muestra en cada pozo respectivo de la placa de microtitulación. 2. Pipette 100 µl de Conjugado Enzimático en cada pozo. 3. Mezcle bien por 10 segundos. 4. Incubar 60 min a TA (18-25 C). 5. Descarte la solución de incubación. Lave la placa 3x con 250 µl de Solución Buffer de Lavado. Remueva totalmente el exceso de la solución, golpeando cuidadosamente la placa invertida sobre un papel toalla. 6. Pipette 100 µl de Solución de Substrato TMB en cada pozo. 7. Incubar 30 min a TA (18-25 C). 8. Detenga la reacción del sustrato, añadiendo 100 µl de Solución de Paro TMB en cada pozo. Agitar brevemente. El color cambia de azul al amarillo. 9. Mida la densidad óptica con fotometro a 450 nm (longitud de onda referencial: nm) dentro de los 15 min de haber agregado la Solución de Paro. 12. CONTROL DE CALIDAD Los resultados son válidos solamente si el ensayo ha sido realizado de acuerdo a las intrucciones. Además el usuario debe atenerse a las Prácticas de Buen Laboratorio (GLP) u otras normas o leyes comparables. Para la determinación del diagnóstico, el usuario y/o el laboratorio deben de tener un sistema validado de acuerdo con las Buenas Prácticas de Laboratorio (GLP). Los valores de los controles del ensayo deben encontrarse dentro de los rangos de aceptación indicados en las etiquetas y el Certificado QC. Si este criterio no se cumple, el ensayo no es válido y debe repetirse. Cada laboratorio debe emplear muestras conocidas como controles adicionales. Se recomienda participar en los programas de aseguramiento de la calidad adecuados. En caso de detectarse alguna desviación, se debe verificar lo siguiente: Fecha de vencimiento de los reactivos, condiciones de almacenamiento, pipetas, dispositivos, condiciones de incubación y método de lavado. 13. CÁLCULO DE RESULTADOS La DO de los estándares (eje-y, lineal) se plotean contra su concentración (eje-x, logarítmico) ya sea en papel semi-logarítmico o empleando un método automático. Se logra un buen ajuste con cubic spline, 4 Parameter Logistics or Logit-Log. Para el cálculo de la curva estándar, use las mediciones obtenidas de los estándares (es aconsejable no emplear valores duplicados). La concentración de las muestras se puede leer directamente de la curva estándar. Las muestras que presenten una señal mayor a la del estándar mayor tienen que ser diluidas según se describe en INSTRUCCIONES PARA LA PREPARACIÓN DEL ENSAYO y analizadas nuevamente. Conversión: DHEA (ng/ml) x = nmol/l Version / 5

6 Curva de Calibración Típica (Ejemplo. No usar para el cálculo!) Estándar DHEA DO/DO DO max (ng/ml) Medio (%) A B C D E F VALORES ESPERADOS Los resultados por si solos no deben ser la única razón para un tratamiento terapéutico, sino que deben correlacionarse con observaciones clínicas y ensayos de diagnóstico. Los sujetos aparentemente sanos presentan los siguientes valores: DHEA n Mediana (ng/ml) 95% percentil (ng/ml) total Intervalo (ng/ml) Hombres Mujeres Se recomienda que cada laboratorio establezca su propio rango de valores normales. 15. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Los siguientes componentes substancias no tienen un efecto significativo en los resultados hasta las concentraciones declaradas (+/- 20%). Hemoglobina 5 mg/ml NaN % Bilirrubina 3 mg/ml Timerosal 0.01 % Triglicéridos 46 mg/ml ProClin % 16. PRUEBAS FUNCIONALES Especificidad Analítica (Reactividad Cruzada) Substancia Reactividad Cruzada (%) 17α-OH-Pregnenolona Androstenediona Pregnenolona desoxi-Cortisol DHEA-S Corticosterona Nortestosterona Testosterona Estrona Reactividad cruzada de otras substancias testeadas % Sensibilidad Analítica (Límite de Detección) 0.03 ng/ml Señal media (Estándar-Cero) - 2DS Sensibilidad Funcional 0.13 ng/ml Medio Conc. < 20 % CV Precisión Intervalo (ng/ml) CV (%) n Intra-Ensayo Inter-Ensayo Linearidad Recuperación (n=5) Comparación del Método versus LCMS Intervalo (ng/ml) Dilución en Serie hasta Intervalo (%) : Medio (%) Intervalo (%) % Recuperación después del enriquecimiento (Concentración añadida ng/ml) IBL-Assay = 0.96 x LCMS r = 0.99; n = REFERENCIAS SOBRE EL PRODUCTO 1. Thomas Lothar; Labor und Diagnose: Indikation und Bewertung von Laborbefunden für die medizinische Diagnostik, 8. Auflage, Tietz, N.W. Textbook of Clinical Chemistry. Saunders, Version / 5

7 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα REF LOT Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθµός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιµοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθµός εξετάσεων: CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα LYO IVD Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. IBL AFFILIATES WORLDWIDE IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany IBL International Corp. 194 Wildcat Road, Toronto, Ontario M3J 2N5, Canada Tel.: + 49 (0) Fax: IBL@IBL-International.com WEB: Tel.: +1 (416) Fax: Sales@IBL-International.com WEB: LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer s liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer Symbols Version 3.5 /