INTRODUCCIÓN A LAS TÉCNICAS DE DETECCIÓN DE ÁCIDOS NUCLÉICOS (N.A.T.)

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1 INTRODUCCIÓN A LAS TÉCNICAS DE DETECCIÓN DE ÁCIDOS NUCLÉICOS (N.A.T.) BIOQ. LILIANA DI TULLIO BUDASSI FAC. CS.BIOQUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS UNIVERSIDAD NACIONAL DE ROSARIO lilianadt2003@yahoo.com.ar

2 INFECCIONES TRANSMISIBLES POR TRANSFUSIÓN Patógenos transmisibles por transfusión Virus Parásitos Virus de la Hepatitis B (HBV) Virus de la Hepatitis C (HCV) Virus de la Inmunodeficiencia Humana 1 y 2 (HIV1/2) Virus Linfotrópico Humano I/II (HTLV I/II) otros: H1N1, virus del Dengue, West Nile Virus Trypanosoma cruzi (Enf. de Chagas-Mazza) otros: Plasmodium malariae, Pl falciparum Bacterias Treponema pallidum (Sífilis) Brucella abortus (Brucelosis) otros Agentes no convencionales-priones 2

3 TAMIZAJE DE INFECCIONES TRANSMISIBLES POR TRANSFUSIÓN EN ARGENTINA (LEY LEY NACIONAL DE SANGRE ) HVB: Enzimoinmunoensayos HBsAg y anti-hbc total HCV :Enzimoinmunoensayo anti- HCV y Ag HCV HIV1/2 : Enzimoinmunoensayo ag-p24 y anti-hiv1/2 HTLV I/II: Enzimoinmunoensayo anti-htlv I/II Chagas : Enzimoinmunoensayo y Hemaglutinación indirecta, ambos anti- Tripanosoma cruzi Sífilis: Test de VDRL anti- Treponema pallidum Brucelosis: Reacción de Huddlesson, anti-brucella abortus 3

4 TAMIZAJE DE INFECCIONES TRANSMISIBLES POR TRANSFUSIÓN Métodos indirectos: detección en la sangre (suero o plasma) del donante de la presencia de una respuesta inmune contra un patógeno dado Diagnóstico serológico mediante diferentes técnicas de laboratorio Ej: análisis en búsqueda de anticuerpos específicos contra HIV en el suero del donante (EIA anti-hiv 0/1/2) Métodos directos: detección directa de la presencia del patógeno (genoma o antígenos) en la sangre del donante Ej: EIA para detectar p24 HIV, HBsAg o HCV ag Técnicas de biología molecular: buscan el DNA o RNA viral 4

5 FACTORES DE RIESGO EN LA TRANSMISIÓN DE INFECCIONES A TRAVÉS DE LAS TRANSFUSIÓN Errores humanos o de laboratorio Problemas en los sistemas de análisis/equipos Insuficiencias en la calidad de los análisis Entrenamiento deficitario Seroconversiones atípicas Variantes o genotipos del patógeno no detectadas Cambios epidemiológicos Periodo de ventana serológico 5

6 PERÍODO VENTANA TIEMPO ENTRE EL MOMENTO DE LA INFECCIÓN Y EL DESARROLLO DE MARCADORES SEROLÓGICOS Período Ventana: NAT Reacción inmune Eclipse Reactivo Serológico Infección Tiempo 6

7 Riesgo de infección por unidad transfundida EVOLUCIÓN DEL RIESGO EN LA PROVISIÓN DE SANGRE 1/100 HCV 1/1000 HBV 1/10,000 1/100,000 HIV 1/180,000 1/1000,000 Ac Anti-HIV Ac Anti-HCV p24 NAT 1/1.600,000 1/1.900, Año 7 Bacterial Contamination of Blood Components: Risks, Strategies, and Regulation Hillyer et al. Joint ASH and AABB Educational Session in Transfusion Medicine. Hematology 2003

8 NUCLEIC ACID TESTING Ventajas de NAT Importante avance teconológico en screening de sangre Altamente sensible & específico dirigido especificamente a las secuencias nucléicas virales Detección directa del RNA or DNA viral Ayuda a la prevención de enfermedades transmisibles por transfusión Provee una etapa adicional de seguridad a la provisión de sangre segura Reduce el Período Ventana desde la infección hasta la detección 8

9 OBJETIVO DE NAT O DGV: DISMINUCIÓN DEL PERÍODO DE VENTANA NAT positivo Eclipse Virus Infección Período Ventana Reactividad Serológica Reacción inmune Tiempo 9 Detección más temprana

10 EJ: EVOLUCIÓN CLÍNICA DE HIV: DÓNDE ACTÚA NAT? 10

11 EVOLUCIÓN EN LA IMPLEMENTACIÓN DE LAS TÉCNICAS EN LOS BANCOS DE SANGRE NAT 1993 se considera formalmente la utilización de NAT para el tamizaje en bancos de sangre, luego que la Food and Drug Administration (FDA) reportara diversos casos de infección por el VHC como consecuencia del uso de inmunoglubulina intravenosa manufacturada Comité Europeo para Productos Medicinales Manufacturados (CPMP) se adhirió a este lineamiento, haciéndolo extensivo a todos los productos medicinales derivados del plasma Organización Mundial de la Salud (OMS) se establecen estándares para el ADN del VHB, el ARN del VHI-1, el ARN del VHC y el ADN del Parvovirus B diferentes países incorporan paulatinamente NAT para HCV y HIV en el tamizaje de donaciones OMS en su documento Recommendations: Screening Donated Blood for Transfusion-Transmisibles Infection sugiere que junto a los ensayos de tamizaje serológicos para VHC, VIH y VHB, dirigidos a los marcadores serológicos de antígenos y/o anticuerpos, se realice la búsqueda de ácidos nucléicos virales para 11 estos patógenos.

12 PERÍODO VENTANA MODEL TESTING DATA Fuente: Busch et al. Transfusion.2005;45(2): Kleinman and Busch. Transfusion. 2006;36:S23-S29. 12

13 VENTAJAS NAT VIRUS Pruebas NAT MP NAT ID serológicas (Minipool) (Individual) VIH (incluye p24) 16 días 10 días 7 días VHC 70 días 9 días 7 días VHB 59 días 49 días 38 días Acortamiento del período de ventana inmunológico Disminución del riesgo residual 13

14 TÉCNICAS BASADAS EN BIOLOGÍA MOLECULAR Involucran tres etapas: 1. Extracción o captura del genoma viral 2. Amplificación 3. Detección Ejemplos: PCR(Polymerase Chain Reaction) RT-PCR (Real Time PCR) NASBA (Nucleic Acid Based on Amplification) TMA (Transcriptional Mediated Amplification) 14

15 PCR Real Time PCR NASBA TMA Nuclisens Easy Q system TMA: pasos principales del ensayo Detección EasyQ Instrument & Reagents Amplificación Desktop computer Strip centrifuge NucliSens EasyQ Incubator NucliSens EasyQ Analyzer Captura del blanco o diana (target) 15

16 MODELOS DE PROCESAMIENTO DE LAS TÉCNICAS NAT Técnicas in house Técnicas comerciales Técnicas Cualitativas Técnicas Cuantitativas Procesamiento de las muestras individuales (ID) o en mini-pools (MP) POOL 48 POOL 24 UNIDADES POOL 24 UNIDADES POOL 8 POOL 8 POOL 8 POOL 8 POOL 8 POOL 8 16

17 NAT DETECTA INFECCIÓN HCV MÁS TEMPRANO QUE EL TEST DE ANTICUERPOS HCV GEq/mL HCV GEq/mL 10,000,000 S/CO 5 10,000,00 7 días 28 días 4 100, , , NAT pool HCV Ac Días Fuente: Susan Stramer, Ph.D., American Red Cross, 1999 NAT ID test 17

18 PUNTOS IMPORTANTES A CONSIDERAR EN CUANTO AL ORIGEN DEL MÉTODO A ELEGIR: Sensibilidad Especificidad Detección de variantes/subtipos Reproducibilidad Trazabilidad de reactivos y resultados Software adecuado Control Interno Control de Contaminación Ensayos discriminatorios/confirmatorios Identificación de su uso: RUO o IVD Marca CE, FDA, ANMAT 18

19 PARA ASEGURAR LA CALIDAD DEL RESULTADO, CADA SISTEMA NAT DEBE POSEER CONTROLES ADECUADOS EN SUS DIFERENTES ETAPAS: Controles de Reactivos: para evaluar la presencia de ADN/ARN foráneo o productos de amplificaciones precedentes. Control Negativo: para evaluar los riesgos de contaminación (en la organización del espacio físico, en los métodos de trabajo, posible aerozolización durante el alicuotado de reactivos) Control Positivo: para controlar la presencia de inhibidores y el buen desarrollo de las diferentes etapas. Control Interno: para verificar la idoneidad de la amplificación y/o la presencia de inhibidores de la misma. 19

20 Marca (s) Formato Muestra Uso habilitado Fabricante Fecha de Aprobación COBAS Ampliscreen HIV-1 Test PCR Plasma Donor Screen Expanded Indications For Use: Source Plasma donors, other living donors, and organ donors Roche Molecular Systems, Inc 12/20/2002 Procleix HIV-1/HCV Nucleic Acid Test (TMA) Plasma UltraQual HIV-1 RT-PCR Assay PCR Plasma Donor Screen Expanded Indications For Use: Source Plasma donors, living organ donors and cadaveric samples Donor Screen Gen-Probe San Diego, CA National Genetics Institute Los Angeles, CA /08/ /18/2001 UltraQual HCV RT- PCR Assay PCR Plasma COBAS AmpliScreen HCV Test COBAS AmpliScreen HBV Test Procleix WNV Assay PCR PCR Nucleic Acid Test (TMA) ID Plasma Plasma Plasma Donor Screen Donor Screen Expanded Indications For Use: Source Plasma donors, other living donors, and organ donors Donor Screen Indications For Use: Source Plasma donors, other living donors, and organ donors Qualitative detection of West Nile Virus (WNV) RNA from volunteer donors National Genetics Institute 09/18/2001 Los Angeles, CA Roche Molecular Systems, Inc 12/3/2002 Roche Molecular Systems, Inc 04/21/2005 Gen-Probe San Diego, CA /01/

21 COMPARACIÓN DE LA SENSIBILIDAD ANALÍTICA DE LOS TEST NAT 95% Límite de Detección (95% CI) Ensayo HIV (IU/ml) HCV (IU/ml) HBV (IU/ml) WNV** (Copies/ml) Procleix TMA* ( ) 2.78 ( ) 7.46 ( ) 3.4 AmpliScreen* Std preparation ( ) 41.9 ( ) ( ) Taq Screen AmpliScreen* Multiprep 78.4 ( ) 28.8 ( ) 4.41 ( ) * Roche s COBAS AmpliScreen US Package Inserts or Procleix Ultrio CE Package Insert ** From Busch et al Transfusion 45,

22 DISEÑO, ACONDICIONAMIENTO E INFRAESTRUCTURA DEL LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR Metas principales para la instalación: Proporcionar el espacio suficiente para el flujo de trabajo y mantenimiento de equipos Evitar la contaminación Mantener la correcta temperatura, humedad y presión del ambiente 22

23 CONDICIONES GENERALES Nivel de seguridad 2 : BSL2 Paredes con pintura resistente a la descontaminación (ácidos o álcalis) Pisos con bordes sanitarios, antideslizante o de vinilo. Presión relativa ambiente: neutra o ligeramente negativa en área de post-amplificación Divisorios: gabinetes modulares a base de metal, con bordes sanitarios y puertas corredizas Mesadas: resistentes a agentes químicos Iluminación: compartimiento estanco Electricidad: UPS de soporte / grupo electrógeno 23

24 ÁREAS DEL LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR Área de preparación de reactivos y muestras Área de pre-amplificación Área de post-amplificación y detección Se definen las diversas áreas mediante barreras físicas o protocolo de barreras entre un área de trabajo y otra. Objetivo: evitar la contaminación entre áreas de trabajo diferentes 24

25 BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE BIOLOGIA MOLECULAR Principal objetivo: minimizar la contaminación a través de Diseño del ensayo Disposición del laboratorio Control del flujo de trabajo 25

26 ÁREAS DEL LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR Pre-Amplificación Post-Amplificación 26

27 GESTIÓN DE LA CALIDAD EN EL LABORATORIO DE BIOLOGIA MOLECULAR Manuales de Gestión de la Calidad Manuales de procedimientos Manual de Bioseguridad Estándares y normativas: Norma ISO 9001:2000 Norma ISO /IEC17025 /1999 Estándar Paul Erlich Institute Organismos internacionales: OMS Collaborative Study Group (provee CCE y establece la unidad de medida: UI/ml) Acreditación 27

28 CONCLUSIONES (1) Disminución del período ventana Otras aplicaciones: tests que permiten una detección directa de otros virus. Ej: WNV, otros virus emergentes Progresar desde analizar mini-pooles a analizar muestras individuales. Lograr la implementación de automatización total de las técnicas de NAT: -disminución de los errores del operador. -mejor estandarización operativa. -optimización de los tiempos de reacción. -trazabilidad de los productos liberados. 28

29 CONCLUSIONES (2) Necesidad de lograr un consenso nacional acerca de temas puntuales referentes a la implementación de NAT en Argentina: la obligatoriedad de las técnicas NAT en Medicina Transfusional, creación de comités de expertos que evalúen la necesidad de legislar el tema definición de la logística de centralización de muestras para lograr un tamizaje de manera uniforme y a un costo razonable evaluación de resultados obtenidos hasta el momento mediante las técnicas in house y comerciales, en pool o ID, con el objeto de definir si la sensibilidad de dichas técnicas y su ejecución son útiles en nuestro sistema de salud consolidación en la formación de los recursos humanos dedicados a la aplicación de NAT. 29