Anti-HIV 1+2 (Ag/Ac) Imuno-ELISA

Transcripción

1 BIBLIOGRAFIA/ BIBLIOGRAPHY/ BIBLIOGRAFÍA 1. Fagan, E.A. and Harrison, T.J.: Acquired Immunodeficiency Syndrome. Bios Scientific Publishers Limited, Brust, S., Duttmann, H. et al: Shortening of the diagnostic window with a new combined HIV p24 antigen and anti-hiv-1/2/o screening test. J Virol Meth, 90: , Saville, R.D., et al.: Fourth-generation enzyme-linked immunosorbent assay for the simultaneous detection of human immunodeficiency virus antigen and antibody. J Clin Microb, 39 (7): , Fiebig, E.W., Wright, D.J., Rawal, B.D., Garret, P.E., Schumacher, R.T., Peddada, L., Heldebrant, C., Smith, R., Conrad, A., Kleinman, S.H., Busch, M.P.: Dinamics of HIV viremia and antibody seroconversion in plasma donors implications for diagnosis and staging of primary HIV infection. AIDS, 17: , World Health Organization Department of Essential Health Technologies: HIV assays: Operational Characteristics, report 15. WHO, Centers for Disease Control and Prevention Quality Assurance Standards for HIV Counseling, Testing, and Referral Data. Atlanta, GA: U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention; MS Imuno-ELISA Anti-HIV 1+2 (Ag/Ac) Kit de 4ª Geração para determinação qualitativa de Antígenos e Anticorpos Contra o Vírus da Imunodeficiência Humana (Anti-HIV) 1 e 2 no soro ou plasma humano, por enzimaimunoensaio (ELISA). 4th Generation kit for the qualitative determination of Antigen and Antibodies against Human Immunodeficiency Virus (Anti-HIV) 1 and 2 in human serum or plasma, by enzyme linked Immunosorbent Assay (ELISA). Kit de 4ª Generación para la determinación cualitativa de Antigenos y Anticuerpos contra el virus Inmunodeficiência Humana (Anti-VIH) 1 y 2 en suero o plasma humano, por ensayo inmunoenzimático (ELISA). R E F R E F E - 96 determinações / determinations / determinaciones E determinações / determinations / determinaciones Edição I: Rev. 10/2012 WAMA Diagnóstica Rua Aldo Germano Klein, CEAT CEP São Carlos - SP - Brasi Fone / Fax SAC

2 01 18 PORTUGUÊS IMPORTÂNCIA CLÍNICA A Síndrome da Imunodeficiência Humana é causada pelo vírus HIV (Vírus da Imunodeficiência Humana), o qual foi determinado como agente etiológico nos anos 80 pelos trabalhos de Luc Montagnier, no Instituto Pasteur de Paris, e Robert Gallo, no Instituto Nacional do Câncer nos Estados Unidos. O HIV é um membro da família retroviridae, um tipo D de retrovírus que pertence à subfamília dos lentivirus. Incluídos nesta família estão os oncovírus HTLV-I e HTLV-II que primariamente induzem a formação de tumores. Há dois distintos tipos de HIV, o HIV-1 e o HIV-2. O HIV-1 está dividido dentro de 9 subtipos, Grupo M (subtipo A H), Grupo N e Grupo O, enquanto o HIV-2 está dividido dentro de 2 subtipos (Grupo A e B). O HIV-1 é composto de uma membrana lipídica, proteínas estruturais e glicoproteínas que se projetam. O genoma viral consiste de 3 importantes componentes estruturais: pol, gag e env. Eles codificam vários produtos: pol produz DNA polimerase e endonuclease, gag codifica p24, p17, p9 e p7, e env codifica gp41 e gp120. O HIV-2 tem um diferente envelope e ligeiramente diferentes proteínas core. As proteínas importantes no sorodiagnóstico do HIV são: para o HIV-1, a gp41 e gp160/120 do envelope (gene env) e a p24 do core (gene gag). Para o HIV-2, a gp34 e gp140 do envelope (gene env) e a p26 do core (gene gag). Os genes que codificam e os respectivos antígenos que podem induzir a produção de anticorpos após uma exposição ao vírus são: gene gag (antígenos p55, p24 e p17), gene pol (antígenos p66 e p51), gene sor (antígeno p24), gene env (antígeno gp160, gp120 e gp41) e gene 3'orf (p27). A homologia entre o HIV-1 e o HIV-2 é de 60% entre os genes gag e 30-40% entre os demais genes. Os testes imunoenzimáticos de 1ª geração utilizavam lisados de antígenos virais, os quais apresentavam reação cruzada, com altas taxas de falso-positivos. Os de 2ª geração passaram a utilizar proteínas recombinantes. Os de 1ª e 2ª gerações eram baseados em um ELISA indireto e somente detectavam anticorpos IgG. Os testes de 3ª geração utilizam polipeptídeos e proteínas recombinantes altamente purificadas, baseado em uma metodologia de duplo antígeno sanduíche, podendo detectar vários anticorpos anti-hiv na amostra (IgG, IgM, IgA, etc.). Já os de 4ª geração utilizam a mesma capacidade de detectar anticorpos de um de 3ª geração, além do antígeno p- 24, reduzindo o período da janela imunológica. O Imuno-ELISA HIV 1+2 (Ag/Ac) da WAMA é um teste imunoenzimático de 4ª geração, tipo duplo sanduíche, que utiliza proteínas recombinantes gp120 e gp41 do HIV-1, gp36 do HIV-2 e anticorpos anti-p24 do HIV, com a finalidade de triagem de doadores de sangue ou como um auxiliar ao diagnóstico clínico da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS). PRINCÍPIO DO MÉTODO As cavidades da placa de microtitulação são cobertas com proteínas recombinantes do vírus HIV-1 (gp-41 e gp- 120), HIV-2 (gp-36) e anticorpos monoclonais anti-p24 do HIV (fase sólida). Na primeira fase do teste, conjugado anti-p24 do HIV marcado com biotina é adicionado às cavidades da placa junto com a amostra do paciente. Se anticorpos anti-hiv e/ou antígeno p-24 estão presentes na amostra eles serão capturados pelos antígenos recombinantes e/ou anticorpos anti-p24 da fase sólida. Nesta fase, haverá a formação de um imunocomplexo representado pelo anticorpo anti-p24 da fase sólida, o antígeno p-24 da amostra e o anticorpo anti-p24 marcado com biotina (1º sanduíche). O material não ligado é removido por lavagem. Um conjugado antígenos HIV 1 e 2 marcado com peroxidase conjugada a avidina é adicionado e será capturado pelos anticorpos anti-hiv-1 e/ou anti-hiv-2 da amostra ligados às proteínas recombinantes da fase sólida. Haverá a formação de um 2º imunocomplexo, representado pelos antígenos recombinantes, anticorpos anti-hiv 1 e/ou 2 e antígenos HIV 1 e 2 marcado com peroxidase (2º sanduíche). Um substrato cromógeno (TMB e peróxido de hidrogênio uréia) é adicionado à mistura, o qual revelará uma cor azul nas cavidades onde a enzima peroxidase estiver presente. Uma solução stop ácida para bloqueio da reação enzimática é adicionada, a qual mudará a cor da solução para amarela. A absorbância é então medida a 450 nm. A concentração de anticorpos anti-hiv e/ou antígeno p-24 é diretamente proporcional a intensidade da cor da reação. APRESENTAÇÃO DO KIT R E F E 96 Determinações 1. Microplaca com cavidades cobertas com proteínas recombinantes do HIV 1 e 2, e anticorpos anti-p24 (12 tiras removíveis com 8 cavidades cada) 2. Solução de lavagem - 20 x concentrada (1 x 50 ml) 3. Conjugado proteínas recombinantes do HIV 1 e 2 marcadas com peroxidase ligada à avidina (1 x 12,0 ml) 4. Conjugado anticorpos anti-p24 ligado à biotina (1 x 3,5 ml) 5. Substrato Cromógeno Solução A (Peróxido de Hidrogênio) (1 x 6,0 ml) La precisión interensayo se determinó analizando 2 muestras de sueros, un positivo y un negativo, en 20 replicas, por operadores diferentes. Muestras positivas Número de Veces Promedio de absorbancia Desviación Estándar Positivo 20 1,145 0,08 5,9 % Negativo 20 0,33 0,027 8,2 % LIMITACIONES DE USO Lo test Imuno-ELISAHIV 1+2 (Ag/Ac) de WAMA fue desarrollado para obtener la más alta sensibilidad y especificidad. También tenga en cuenta que que los anticuerpos pueden ser indetectables en las etapas iniciales de la enfermedad y, en algunos individuos inmunodeprimidos. Resultados repetidamente reactivos deben interpretarse con la información clínica del paciente con otro resultado de las pruebas de laboratorio. Ejemplos de reactivos que se convierten en no reactivo al repetir la prueba debe considerarse no reactivo. Debido a la alta sensibilidad de la ELISA, los resultados falsos positivos pueden ocurrir debido a diversas razones, muchos de los cuales están relacionados, pero no se limitan a paso de lavado inadecuado. Cuando los factores de riesgo son bajo una prueba confirmatoria (Western Blot, NAT - Amplificación de Ácidos Nucleicos Las Pruebas ) se deben realizar para confirmar del diagnóstico. Resultados falsos negativos pueden ocurrir durante los períodos de llamada ventana "serologica", es decir, el tiempo entre la infección por VIH y la aparición de anticuerpos en concentración que permita ser detectado por la prueba (seroconversión); generalmente por encima de 8 semanas de infección. Las pruebas 4ª generación de ELISA, en la que se utiliza la investigación de antígenos p-24 y anticuerpos anti-vih, reduce lo "período de ventana" en aproximadamente una semana en comparación con la prueba de 3ª generación (29 días). La prueba no se distingui la infección causada por VIH-1 de los causados por VIH-2. La prevalencia de la enfermedad en la población evaluada afectará el valor predictivo de la prueba. PRECAUCIONES Y ADVERTENCIAS 1. Los reactivos deben conservarse entre 2 8 ºC. 2. La fecha de caducidad se refiere al último día del mes indicado en las etiquetas del frasco y de la caja del kit. 3. Evite la exposición de los reactivos a altas temperaturas y la luz solar directa. 4. No congele el reactivo, ya que esto puede causar daños irreversibles. 5. Lo Imuno-ELISA Anti-HIV 1+2 de WAMA contiene materiales de origen humano, que se han ensayado, con resultados negativos para anticuerpos anti-vih 1 y 2 (excepto el suero control positivo), antígeno de superficie de la Hepatitis B (HBsAg) y anti-vhc. Como ninguna prueba puede ofrecer completa seguridad, en la ausencia de éstos y otros agentes infecciosos, se recomienda para el tratamiento de todos los reactivos como materiales potencialmente infecciosos, y tener el mismo cuidado en la eliminación de estos materiales. 6. Solución Stop contiene 2,0 M de ácido sulfúrico (H2SO4). Manejar con cuidado. Corrosivo. En caso de contacto con la piel, lavar abundantemente en agua corriente. 7. No utilizar reactivos o microplacas de lotes diferentes. 8. Dejar que los reactivos adquieran la temperatura ambiente (20 25 ºC) antes de iniciar los tests. 9. Los reactivos deben ser homogeneizados suavemente por inversión y cubiertos de forma inmediata después de su uso. 10. No dejar que los pocillos de la microplaca se sequen durante el ensayo. 11. Evitar pipetear repetidamente los reactivos en stock, pues esto puede causar contaminación. 12. Las muestras que serán testeadas y los sueros controles deben ser utilizados al mismo tiempo para mantener las mismas condiciones del test. 13. No utilice el reactivo después de la fecha de caducidad. 14. Desechar el material siguiendo regulaciones locales. 15. Utilice las Buenas Prácticas de Laboratorio (BPL) en el almacenamiento, la manipulación y eliminación de los materiales. TERMINO GARANTÍA WAMA Diagnóstica garantiza el cambio del kit de diagnóstico, siempre que estea dentro de la fecha de caducidad y que ha sido probado por su apoyo técnico que no hubo errores técnicos en la ejecución, la manipulación y el almacenamiento de este producto. WAMA y sus distribuidores no se responsabiliza por fallas en el rendimiento de los kits en estas condiciones

3 17 02 control negativo no se ajusta a la especificación, la prueba debe ser considera no válida y debe repetirse. Ejemplo: Valor DO de la de los controles negativos = 0,055-0,125-0,057 Entonces, el DO de 0,125 deben ser desechados y el promedio de la DO de los controles negativos es (0, ,057 ) /2 = 0,056 Por lo tanto, Cut-off = 0, ,12 = 0,176 VALIDACIÓN DEL TEST: El test es válido si: La D.O. del blanco, que contiene solamente Sustrato Cromógeno A y B y Solución Stop, debe ser inferior a 0,080 a 450 nm. Lo valor de la D.O. de lo control negativo es inferior a 0,100 a 450/630 nm o a 450 nm después de sustraer el "blank". Lo valor de la D.O. de lo control positivo deve ser igual o mayor a 0,900 a 450/630 nm o a 450 nm después de sustraer el "blank". INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS Divida el valor de DO de la muestra del paciente por lo valor de Cut-off. La prueba se considera: REACTIVO : Si el valor es igual o superior a 1,1. INDETERMINADO (Borderline) : Si el valor está entre 0.9 y 1.1. NO REACTIVO : Si el valor es inferior a 0,9. ADVERTENCIA: SIEMPRE SE RECOMIENDA REPETIR LA PRUEBA EN LAS MUESTRAS REACTIVAS. SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD DE LO TEST En un estudio de 850 muestras de suero y plasma obtenidas de un laboratorio de referencia y un panel de suero comercial, de los cuales 154 eran positivos y 696 negativos, se determinó la sensibilidad y especificidad de Imuno-ELISA HIV 1+2 de WAMA. Sensibilidad = Positivos Verdaderos / Positivos Verdaderos + Falsos Negativos) x 100 Especificidad = Verdaderos Negativos / (Verdaderos Negativos + Falsos Positivos ) x 100 Verdadero Falso Verdadero Falso Sensibilidad Especificidad Positivos Positivos Negativos Negativos RESULTADOS ,85 ESPECIFICIDAD ANALÍTICA No hubo reacción cruzada en sueros de pacientes infectados por el virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, Citomegalovirus, VIH y Treponema pallidum. Durante las pruebas, no se observó efecto "hook" en altas concentraciones de anticuerpos ni se observó interferencia por factor reumatoide. La característica de rendimiento de la prueba no se ve afectado por las altas concentraciones de bilirrubina y hemoglobina. La sensibilidad analítica de la Imuno-ELISA HIV 1+2 (Ag/Ac) para detección de antígeno p-24 del VIH es aproximadamente 5 pg/ml. PRECISIÓN DEL TEST: a. Precisión Intraensayo La precisión intraensayo se determinó analizando 2 muestras de sueros, un positivo y un negativo, en 20 replicas. Muestras positivas Número de Veces Promedio de Desviación absorbancia Estándar Positivo 20 1,462 0,08 5,4 % b. Negativo Precisión Interensayo 20 0,342 0,026 7,75 % 6. Substrato Cromógeno Solução B (TMB) (1 x 6,0 ml) 7. Solução Stop (1 x 6,0 ml) 8. Controle Negativo (1 x 1,0 ml) 9. Controle Positivo-1 (1 x 1,0 ml) 10. Controle Positivo-2 (1 x 1,0 ml) 11. Controle Positivo-3 (1 x 1,0 ml) 12. Instruções para uso R E F E 192 Determinações 1. Microplaca com cavidades cobertas com proteínas recombinantes do HIV 1 e 2, e anticorpos anti-p24 (24 tiras removíveis com 8 cavidades cada) 2. Solução de lavagem - 20 x concentrada (2 x 50 ml) 3. Conjugado proteínas recombinantes do HIV 1 e 2 marcadas com peroxidase ligada à avidina (2 x 12,0 ml) 4. Conjugado anticorpos anti-p24 ligado à biotina (2 x 3,5 ml) 5. Substrato Cromógeno Solução A (Peróxido de Hidrogênio) (2 x 6,0 ml) 6. Substrato Cromógeno Solução B (TMB) (2 x 6,0 ml) 7. Solução Stop (2 x 6,0 ml) 8. Controle Negativo (2 x 1,0 ml) 9. Controle Positivo-1 (2 x 1,0 ml) 10. Controle Positivo-2 (2 x 1,0 ml) 11. Controle Positivo-3 (2 x 1,0 ml) 12. Instruções para uso PREPARAÇÃO E ESTABILIDADE DOS REATIVOS MICROPLACA (1): Retirar do envelope a quantidade de tiras que serão usadas e deixá-las atingir a temperatura ambiente (20-25 ºC). As tiras que não forem utilizadas devem retornar ao envelope laminado, com dissecante, e mantidas entre 2-8 ºC. TAMPÃO DE LAVAGEM 20 x concentrado (2): tampão salino-fosfato (PBS), ph=7,4, contendo tween-20 como detergente. Diluir o volume do concentrado completando para 1000 ml com água destilada ou deionizada (diluição 1:20). Se houver presença de cristais no tampão concentrado, eles devem ser dissolvidos a 37 ºC antes da diluição. Durante cada ciclo de lavagem, cada cavidade deve ser completada com aproximadamente 350 µl. Manter entre 2-8ºC. Deixar atingir a temperatura ambiente (20-25 ºC) antes de usar. CONJUGADO PROTEÍNAS RECOMBINANTES DO HIV 1 E 2 MARCADAS COM PEROXIDASE LIGADA À AVIDINA (3): pronto para uso. Estável entre 2-8 ºC até a data do vencimento impressa na etiqueta do frasco. Não congelar. Deixar atingir a temperatura ambiente (20-25 ºC) antes de usar. CONJUGADO ANTICORPOS ANTI-p24 LIGADOS À BIOTINA (4): pronto para uso. Estável entre 2-8 ºC até a data do vencimento impressa na etiqueta do frasco. Não congelar. Deixar atingir a temperatura ambiente (20-25 ºC) antes de usar. SUBSTRATO CROMÓGENO SOLUÇÃO A (PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO) (5): estabilizado e pronto para uso. Estável entre 2-8 C até a data de vencimento impressa na etiqueta do frasco. Não congelar. Deixar atingir a temperatura ambiente (20-25 ºC) antes de usar. SUBSTRATO CROMÓGENO SOLUÇÃO B (TMB) (6): solução estabilizada de tetrametilbenzidina. Pronta para uso. Estável entre 2-8 ºC até a data de vencimento impressa na etiqueta do frasco. Não congelar. Deixar atingir a temperatura ambiente (20-25 ºC) antes de usar. O TMB é não mutagênico e não carcinogênico. SOLUÇÃO STOP (7): pronta para uso. Contém ácido sulfúrico (H2SO4) 2,0 M. Manusear com cuidado. É corrosivo. Em caso de contato com a pele lavar abundantemente em água corrente. Deixar atingir a temperatura ambiente (20-25 ºC) antes de usar. Estável até a data do vencimento impressa na etiqueta do frasco. SORO CONTROLE NEGATIVO (8): controle diluído em tampão estabilizador de proteínas, negativo para HIV 1 e 2. Pronto para uso. Usar puro, ou seja, não diluído. Estável entre 2-8 ºC até a data do vencimento impressa na etiqueta do frasco. Contém ProClin 300 0,1% como conservante. CONTROLE POSITIVO-1 (9): controle diluído em tampão estabilizador de proteínas, positivo para anticorpos anti- HIV-1. Pronto para uso. Usar puro, ou seja, não diluído. Estável entre 2-8 ºC até a data do vencimento impressa na etiqueta do frasco. Contém ProClin 300 0,1% como conservante. CONTROLE POSITIVO-2 (10): controle diluído em tampão estabilizador de proteínas, positivo para anticorpos anti- HIV-2. Pronto para uso. Usar puro, ou seja, não diluído. Estável entre 2-8 ºC até a data do vencimento impressa na etiqueta do frasco. Contém ProClin 300 0,1% como conservante. CONTROLE POSITIVO-3 (11): controle diluído em tampão estabilizador de proteínas, positivo para antígeno p24. Pronto para uso. Usar puro, ou seja, não diluído. Estável entre 2-8 ºC até a data do vencimento impressa na etiqueta do frasco. Contém ProClin 300 0,1% como conservante.

4 03 16 Obs.: O kit mantém o mesmo desempenho após a primeira utilização, e é estável até a data de validade descrita no rótulo, desde que mantido na temperatura indicada (2-8ºC). AMOSTRAS Usar amostra de soro ou plasma livre de hemólise, lipemia e contaminação. A amostra de plasma pode ser colhida com EDTA, citrato de sódio ou heparina. A amostra pode ser conservada em geladeira entre 2-8 ºC por 48 horas. Para longo tempo, devem ser mantidas no freezer a -20 ºC. Amostras congeladas devem ser homogeneizadas antes do teste. Evitar formação de espuma. Evitar repetidos congelamentos e descongelamentos, pois isto pode causar falsos resultados. MATERIAL NECESSÁRIO, MAS NÃO FORNECIDO Micropipeta de 50µl e ponteiras. Água destilada ou deionizada para diluição do tampão de lavagem. Agitador de microplaca. Incubador com temperatura de 37 ºC. Leitor de microplaca com filtro de 450 nm. Lavador de microplaca Papel absorvente. Recipiente para descarte de material. PROCEDIMENTO IMPORTANTE: Medidas de absorbância bicromática usando um filtro de referência com comprimento de onda de 630 nm é recomendado quando disponível. Nesta condição, o uso do blank deve ser desconsiderado, uma vez que ele somente deve ser usado quando utilizado um único filtro de 450 nm. 1. De acordo com o plano estabelecido de distribuição na placa, usar 3 cavidades para o controle negativo (8) e 3 cavidades para os controles positivos 1 cavidade para o controle positivo-1(9), 1 cavidade para o controle positivo-2 (10) e 1 cavidade para o controle positivo-3 (11). Usar 1 cavidade para o blank, o qual conterá somente 50µl do substrato cromógeno Solução A (5) e 50µl do substrato cromógeno Solução B (6) e solução stop (7). 2. Dispensar 20µl do conjugado anti-p24 ligado à biotina (4) em cada cavidade, exceto no Blank. 3. Dispensar 100µl dos controles positivos e negativos (sem diluir) conforme o estabelecido no item 1, e 100µl das amostras nas outras cavidades a serem testadas. Usar ponteiras individuais para cada pipetagem, evitando com isso contaminação. 4. Homogeneizar levemente, batendo com os dedos nas bordas da placa ou por vibração mecânica (agitador de placa) por 30 segundos. 5. Cobrir a placa com folha adesiva e incubar a 37 ºC por 60 minutos. 6. Descartar o conteúdo da microplaca dentro de um recipiente contendo solução desinfetante, tendo o cuidado de evitar contaminação entre as cavidades. 7. Lavar a placa 5 vezes com a solução de lavagem diluída (2) (ver Preparação e Estabilidade dos Reativos). Aspirar o conteúdo da microplaca, dispensar 350µl de tampão de lavagem diluído (2) em cada cavidade, aguardar 30 segundos e esvaziar o conteúdo das cavidades. Repetir 4 vezes este procedimento (total de 5 ciclos). Recomenda-se o uso de uma lavadora de microplaca manual ou automática. ATENÇÃO: O correto procedimento de lavagem é fundamental para uma boa performance do ensaio. 8. Após a última lavagem, inverter a placa e batê-la sobre papel absorvente para remover todo o líquido residual. 9. Dispensar 100µl do conjugado HIV 1 e 2 marcado com peroxidase ligada à avidina (3) em todas as cavidades, exceto no blank. 10. Homogeneizar levemente, batendo com os dedos nas bordas da placa ou por vibração mecânica (agitador de placa) por 30 segundos. 11. Cobrir a placa com folha adesiva e incubar a 37 ºC por 30 minutos. 12. Repetir as etapas 6, 7 e Dispensar 50µl do substrato cromógeno Solução A (5) e 50µl do substrato cromógeno Solução B (6) em cada cavidade da microplaca, inclusive no blank. Haverá o desenvolvimento de cor azul onde a enzima peroxidase estiver presente. Homogeneizar levemente, batendo com os dedos nas bordas da placa ou por agitação mecânica (agitador de placa) por 30 segundos. 14. Incubar a 37 C por 15 minutos, protegendo da luz. 15. Bloquear a reação dispensando 50µl da solução stop (7) em cada cavidade da microplaca, inclusive no blank. A cor da solução mudará para amarela. Homogeneizar levemente, batendo com os dedos nas bordas da placa ou por agitação mecânica (agitador de placa) por 30 segundos. 16. Ler a absorbância (D.O.) em um leitor de microplaca com filtro de 450 nm, contra o blank do substrato, dentro NOTA: Mediciones de absorbancia bicromático utilizando un filtro de referencia con longitud de onda de 630 nm filtro se recomienda cuando disponible. IMPORTANTE: El procedimiento de lavado es fundamental para el desempeño del test. Un mal lavado dará lugar a lecturas inexactas o absorbancias falsamente elevadas. Se recomienda la realización de los tests por duplicado, aunque no sea obligatorio. El pipeteo de las muestras y los controles no debe exceder 30 minutos. RESUMEN DEL PROCEDIMIENTO 1. Dispensar 20μl de conjugado anti-p24 ligado a biotina (4) en cada pocillo, a excepción de lo blank. 2. Dispensar 100 µl de los controles negativos (8) (3 pocillos) y controle positivo-1 (9) y control positiv-2 (10) y control positiva-3 (11) en la microplaca. Dispensar 100µl de la muestra en otros pocillos. 3. Homogeneizar por 30 segundos e incubar a 37 C por 60 minutos. 4. Descartar el contenido de la placa en un recipiente con solución desinfectante y enjuague 5 vezes con solución de lavado (2). 5. Descartar completamente el contenido del último lavado, eliminando todo el residuo líquido. 6. Dispensar 100μl del conjugado (3) en cada pocillo de la placa, excepto el blank. 7. Homogeneizar por 30 segundos e incubar a 37 C por 30 minutos. 8. Repetir los pasos 4 al Dispensar 50μl del sustrato cromógeno Solución A (5) y 50μl del sustrato cromógeno Solución B (6) en cada pocillo de la microplaca, inclusive el blank (lo cual debese contener solamiente estes reactivos). El color de la solución se volverá azul donde sea detectada la presencia de peroxidasa. 10. Homogeneizar por 30 segundos e Incubar en la oscuridad a 37 C por 15 minutos. 11. Pipetear 50μl de la Solución Stop (7) en cada pocillo de la microplaca. La solución va a cambiar el color a amarillo. 12. Homogeneizar por 30 segundos. 13. Leer la absorbancia (D.O.) en un lector de microplacas con un filtro de 450 nm, contra el blank del sustrato o en una doble onda (450/630 nm), en un plazo de 15 minutos. EJEMPLO DEL DIAGRAMA DE DISTRIBUICIÓN EN LA MICROPLACA A Blank A2 B Controle Neg. A3 C Controle Neg. A4 D Controle Neg. A5 E Controle Pos.-1 A6 F Controle Pos.-2 G Controle Pos.-3 H A1 CÁLCULO DE LOS RESULTADOS Determinar para cada test y sueros controles la densidad óptica (D.O.), cuyo valor final se obtiene restando de la lectura de la D.O. el valor del blank. Si dupla longitud de onda dual se utiliza, lo "blanco" se omite, y por lo tanto las lecturas de D.Os. se utilizan sin sustracción. Si más de una placa que se utiliza debe ser considerado por separado para el cálculo y la interpretación de los resultados. Determinar lo valor de Cut-off: Cut-off = medio de D.O. de Controle Negativo Advertencia: Si el valor de DO de uno de los controles negativos no se encuentra dentro del rango de control especificado en la validación de las pruebas, la D.O. de este este control debe ser desechada. Si más de un

5 15 04 vencimiento descripta en la etiqueta, siempre que se mantenga a la temperatura indicada (2-8ºC). ESPECÍMENES Usar muestras de suero o plasma libres de hemólisis, lipemia y contaminación. La muestras de plasma pueden ser colectadas con EDTA, citrato de sodio o heparina. La muestra puede ser almacenada tapado en el refrigerador a 2-8 C durante 48 horas. Para un período mayor, deben guardarse en freezer a -20 ºC. Muestras congeladas deberán homogeneizarse antes del test. Evite la formación de espuma. Evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación, ya que esto puede producir resultados falsos. MATERIAL NECESARIO, PERO NO SUMINISTRADO Micropipettas (50µl) y puntas de pipeta Agua destilada o desionizada, para dilución de tampón de lavado. Agitador de microplaca. Incubadora con una temperatura de 37 º C Lector de micro placa con filtro de 450 nm. Lavador de microplaca Papel absorbente. Recipiente para descarte de material. PROCEDIMIENTO IMPORTANTE: Mediciones de absorbancia bicromático utilizando un filtro de referencia con longitud de onda de 630 nm filtro se recomienda cuando disponible. En esta condición, el uso de "blanco" debe ser descartado, ya que solo se utilizan cuando se utiliza un solo filtro de 450 nm. 1. De acuerdo con el plan establecido de distribución en la placa, usar 3 pocillos para control negativo (8) y 3 pocillos para controls positivo, un pocillo para o control positivo-1 (9), y un pocillo para control positivo-2 (10) y un pocillo para control positivo-3 (11). Usar 1 pocillo para el blank, el cual contendrá solamente 50μl del sustrato cromógeno Solución A (5) y 50μl del sustrato cromógeno Solución B (6) y Solución Stop (7). 2. Dispensar 20μl de conjugado anti-p24 ligado a biotinaa (4) en cada pocillo, a excepción de lo blank. 3. Dispensar 100μl de los controles positivo y negativo (sin diluir) conforme a lo establecido en el ítem 1 y 100μl de las muestras en otros pocillos que serán testeados. Usar puntas de pipeta individuales para cada pipeteo, evitando la contaminación. 4. Homogeneizar suavemente, tamborileando con los dedos sobre los bordes de la placa o por vibración mecánica (agitador de placa) por 30 segundos. 5. Cubrir la placa con papel adhesivo e incubar a 37 C por 60 minutos. 6. Descartar el contenido de la placa en un recipiente con solución desinfectante, teniendo cuidado de evitar la contaminación entre pocillos. 7. Lavar la placa 5 vezes con la solución de lavado diluida (2) (ver Preparación y Estabilidad de los Reactivos). Aspirar el contenido de la microplaca, dispensar 350μl de solución de lavado diluida (2) en cada pocillo, esperar 30 segundos y vaciar el contenido de los pocillos. Repetir 4 veces este procedimiento (total de 5 ciclos). Se recomienda el uso de una lavadora de microplacas, automática o manual. ADVERTENCIA: Es fundamental, para un buen desempeño del ensayo, que los procedimientos de lavado sean adecuados. 8. Después del último lavado, invertir la placa y golpearla sobre papel absorbente para eliminar cualquier residuo líquido. 9. Dispensar 100μl de conjugado VIH 1 y 2 ligado a avidina (3) en todos los pocillos, excepto el blanco. 10. Homogeneizar suavemente, tamborileando con los dedos sobre los bordes de la placa o por vibración mecánica (agitador de placa) por 30 segundos. 11. Cubrir la placa con papel adhesivo e incubar a 37 C por 30 minutos. 12. Repetir los passos 6, 7 y Dispensar 50μl del sustrato cromógeno Solución A (5) y 50μl del sustrato cromógeno Solución B (6) en cada pocillo de la microplaca, inclusive el blank. Aparecerá un color azul donde esté presente la enzima. Homogeneizar suavemente, tamborileando con los dedos sobre los bordes de la placa o por vibración mecánica (agitador de placa) por 30 segundos. 14. Incubar a 37 C durante 15 minutos, protegerlo de la luz. 15. Bloquear la reacción dispensando 50μl de la solución Stop (7) en cada pocillo de la microplaca, inclusive el blank. La solución se cambiará al color amarillo. Homogeneizar suavemente, tamborileando con los dedos sobre los bordes de la placa o por vibración mecánica (agitador de placa) por 30 segundos. 16. Leer la absorbancia (D.O.) en un lector de microplacas con un filtro de 450 nm, contra el blank del sustrato, en un plazo de 15 minutos. de 15 minutos. NOTA: recomenda-se usar um duplo comprimento de onda utilizando um filtro de referência de 630 nm quando disponível. IMPORTANTE: O procedimento de lavagem é crítico para o desempenho do teste. Lavagens insuficientes resultarão leituras pouco precisas ou absorbâncias falsamente elevadas. A realização dos testes em duplicata, embora não obrigatória, é recomendada. O tempo levado para pipetagem das amostras e controles não deve exceder 30minutos. RESUMO DO PROCEDIMENTO 1. Pipetar 20µl do conjugado anti-p24 ligado à biotina (4) em cada cavidade, exceto no blank. 2. Pipetar 100µl dos controles negativos (8) (3 cavidades) e controles positivo-1 (9), positivo-2 (10) e positivo-3 (11) na microplaca. Pipetar 100µl da amostra nas outras cavidades. 3. Homogeneizar por 30 segundos e incubar a 37 C por 60 minutos. 4. Descartar o conteúdo da microplaca dentro de um recipiente contendo solução desinfetante e lavar 5 vezes com tampão de lavagem (2). 5. Descartar completamente o conteúdo da última lavagem, removendo todo o líquido residual. 6. Pipetar 100µl do conjugado (3) em cada cavidade da placa, exceto blank. 7. Homogeneizar por 30 segundos e incubar a 37 C por 30 minutos. 8. Repetir as etapas 4 a Pipetar 50µl do substrato cromógeno Solução A (5) e 50µl do substrato cromógeno Solução B (6) em cada cavidade da placa, inclusive no blank (deverá conter somente estes reativos). A cor da solução fica azul onde houver peroxidase. 10. Homogeneizar por 30 segundos e Incubar no escuro a 37 C por 15 minutos. 11. Pipetar 50µl da solução stop (7) em cada cavidade da microplaca. A cor da solução ficará amarela. 12. Homogeneizar por 30 segundos. 13. Ler a D.O. em um leitor de microplaca com filtro de 450 nm contra o blank, ou um duplo comprimento de onda (450/630 nm), dentro de 15 minutos. EXEMPLO DE ESQUEMA DE DISTRIBUIÇÃO NA PLACA A Blank A2 B Controle Neg. A3 C Controle Neg. A4 D Controle Neg. A5 E Controle Pos.-1 A6 F Controle Pos.-2 G Controle Pos.-3 H A1 CÁLCULOS DOS RESULTADOS Determinar para cada teste e soros controles a densidade óptica (D.O.), cujo valor final é obtido subtraindo da leitura da D.O. do blank. Se duplo comprimento de onda é usado o blank é omitido e, portanto, as leituras das D.Os. são usadas sem subtração. Se mais do que uma microplaca é utilizada elas deveriam ser consideradas separadamente para cálculos e interpretação dos resultados. Determinar o valor do Cut-off: Cut-off = média das D.Os. dos Controles Negativos + 0,12 Atenção: Se o valor da D.O. de um dos controles negativos não atender a faixa controle especificada para

6 05 14 validação do teste, a D.O. deste controle deveria ser descartada. Se mais do que um controle negativo não atender, o teste deve ser considerado inválido e deve ser repetido. Exemplo: Valor das D.Os. dos Controles Negativos = 0,055 0,125 0,057 Então, D.O. de 0,125 deve ser descartada e a média das D.Os. dos controles negativos é (0, ,057)/2 = 0,056 Portanto, Cut-off = 0, ,12 = 0,176 VALIDAÇÃO DO TESTE: O teste é válido se: A D.O. do blank, que contém somente Substrato Cromógeno A e B e Solução Stop, é menor do que 0,080 a 450 nm. O valor da D.O. dos controles negativos é menor do que 0,100 a 450/630 nm ou a 450 nm após subtrair o blank. O valor da D.O. dos controles positivos é igual ou maior do que 0,800 a 450/630 nm ou a 450 nm após subtrair o blank. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS Dividir o valor da D.O. da amostra do paciente pelo valor do Cut-off. O teste é considerado: REAGENTE : se valor igual ou maior do que 1,1. DUVIDOSO (Borderline) : se valor entre 0,9 e 1,1. NÃO REAGENTE : se valor menor do que 0,9. ATENÇÃO: É SEMPRE RECOMENDADO REPETIR O TESTE NAS AMOSTRAS REAGENTES. SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE DO TESTE Em um estudo realizado com 850 amostras de soro e plasma obtidas de um Laboratório de referência e painel de soro comercial, das quais 154 eram positivas e 696 negativas foram determinadas a sensibilidade e especificidade do kit Imuno-ELISA HIV 1+2 (Ag/Ac) da WAMA. Sensibilidade = Verdadeiros Positivos / (Verdadeiros Positivos + Falsos Negativos) x 100 Especificidade = Verdadeiros Negativos / (Verdadeiros Negativos + Falsos Positivos) x 100 Verdadeiros Falsos Verdadeiros Falsos Sensibilidade Especificidade Positivos Positivos Negativos Negativos RESULTADO ,85 ESPECIFICADADE ANALÍTICA Não foi observada reação cruzada em soros de pacientes infectados por vírus da hepatite A, vírus hepatite B, vírus da hepatite C, HTLV, citomegalovírus e Treponema pallidum. Durante os testes realizados, nenhum efeito Hook para altas concentrações de anticorpos foi observado nem interferência com fator reumatoide foi verificada. A performance característica do teste não é afetada por concentrações elevadas de bilirrubina e hemoglobina. A sensibilidade analítica do Imuno-ELISA HIV 1+2 (Ag/Ac) para a detecção do antígeno p-24 do HIV é de aproximadamente 5 pg/ml. PRECISÃO DO TESTE a. Precisão Intra-Ensaio A precisão intra-ensaio foi determinada ensaiando 2 amostras de soros, uma positiva e outra negativa, em 20 replicatas. Amostras Positivas Número de Vezes Média das Absorbâncias Desvio Padrão Positiva 20 1,462 0,08 5,4 % Negativa 20 0,342 0,026 7,75 % b. Precisão Inter-Ensaio 6. Sustrato Cromógeno Solución B (TMB) (1 x 6,0 ml) 7. Solución Stop (1 x 6,0 ml) 8. Control Negativo (1 x 1,0 ml) 9. Control Positivo (1 x 1,0 ml) 10. Control positivo-2 (1 x 1,0 ml) 11. Control positivo-3 (1 x 1,0 ml) 12. Instrucciones de uso E 192 determinaciones 1. R E FMicroplacas con pocillos cubiertos con proteínas recombinantes de VIH y anticuerpos anti p-24 (24 tiras removibles con 8 cavidades cada una) 2. Solución de lavado - 20 x concentrada (2 x 50 ml) 3. Conjugado de proteína recombinante de VIH 1+2 marcados con peroxidasa ligada a avidina (2 x 12,0 ml) 4. Conjugado de anticuerpo anti-p24 ligada a biotina (2 x 3,5 ml) 5. Sustrato Cromógeno Solución A (Peróxido de Hidrógeno) (2 x 6,0 ml) 6. Sustrato Cromógeno Solución B (TMB) (2 x 6,0 ml) 7. Solución Stop (2 x 6,0 ml) 8. Control Negativo (2 x 1,0 ml) 9. Control Positivo (2 x 1,0 ml) 10. Control Positivo-2 (2 x 1,0 ml) 11. Control Positivo-3 (2 x 1,0 ml) 12. Instrucciones de uso PREPARACIÓN Y ESTABILIDAD DE REACTIVOS MICRO PLACA (1): Retirar de la sobre la cantidad de tiras que se utilizarán, y dejar que alcancen a temperatura ambiente (20-25 C). Las tiras que no se utilicen deben regresar al sobre laminado, con desecante, y se mantendrá a 2-8 C. SOLUCIÓN DE LAVADO (20x concentrado) (2): Solución tamponada de fosfato (PBS), ph=7,4, que contiene Tween-20 como detergente. Diluir el volumen del concentrado, llenando hasta 1000 ml con agua destilada o desionizada (dilución 1:20). Si hay cristales en el tampón concentrado, deben disolverse a 37 C antes de la dilución. Durante cada ciclo de lavado, cada pocillo debe lavarse con, aproximadamente 350 μl. Mantener a 2-8 C. Dejar que alcance la temperatura ambiente (20-25 C) antes de usarlo. CONJUGADO DE PROTEINAS RECOMBINANTES DE LO VIH 1 Y 2 MARCADOS CON PEROXIDASE LIGADA A AVIDINA (3): Listo para usar. Estable entre 2-8 C hasta la fecha de vencimiento impresa en el envase. No congelar. Dejar que alcance la temperatura ambiente (20-25 C) antes de usar. CONJUGADO ANTICUERPOS ANTI-p24 LIGADA A BIOTINA (4): Listo para usar. Estable entre 2-8 C hasta la fecha de vencimiento impresa en el envase. No congelar. Dejar que alcance la temperatura ambiente (20-25 C) antes de usar. SUBSTRATO CROMÓGENO SOLUCIÓN A (PERÓXIDO DE HIDRÓGÊNO (5): estabilizado y listo para su uso. Estable a 2-8 C hasta que fecha de vencimiento impresa en el envase. No congelar. Dejar que alcance la temperatura ambiente (20-25 C) antes de usar. SUSTRATO CROMÓGENO - SOLUCIÓN B (TMB) (6): Solución estabilizada con tetrametilbencidina. Listo para usar. Estable a 2-8 C hasta que fecha de vencimiento impresa en el envase. No congelar. Dejar que alcance la temperatura ambiente (20-25 C) antes de usar. Lo TMB no es mutagénico ni carcinogénico. SOLUCIÓN STOP (7): Listo para usar. Contiene 2,0 M de ácido sulfúrico (H2SO4). Manejar con cuidado. Corrosivo. En caso de contacto con la piel, lavar abundantemente en agua corriente. Dejar que alcance la temperatura ambiente (20-25 C) antes de usar. Estable C hasta la fecha de vencimiento impresa en el frasco. SUERO DE CONTROL NEGATIVO (8): Suero humano diluido en tampón de proteína estabilizado, positivo para VIH 1 y 2. Listo para usar. Usar puro, en otras palabras, no diluido. Estable entre 2-8 C hasta la fecha de vencimiento impresa en el envase. Contiene ProClin 300 0,1 % como conservante. CONTROL POSITIVO-1 (9): Control diluido en tampón proteína estabilizado, positivo para anticuerpos anti VIH- 1. Listo para usar. Usar puro, en otras palabras, no diluido. Estable entre 2-8 C hasta la fecha de vencimiento impresa en el envase. Contiene ProClin 300 0,1 % como conservante. CONTROL POSITIVO-2 (10): Control diluido en tampón proteína estabilizado, positivo para anticuerpos anti VIH-2. Listo para usar. Usar puro, en otras palabras, no diluido. Estable entre 2-8 C hasta la fecha de vencimiento impresa en el envase. Contiene ProClin 300 0,1 % como conservante. CONTROL POSITIVO-3 (11): Control diluido en tampón proteína estabilizado, positivo para antigeno p-24. Listo para usar. Usar puro, en otras palabras, no diluido. Estable entre 2-8 C hasta la fecha de vencimiento impresa en el envase. Contiene ProClin 300 0,1 % como conservante. Nota: El kit mantiene el mismo rendimiento después de la primera utilización, y es estable hasta la fecha de

7 13 06 ESPAÑOL IMPOTÊNCIA CLÍNICA El Síndrome de Inmunodeficiencia Humana es causada por el VIH (Virus de Inmunodeficiencia Humana), que se determinó como agente etiológico en los años 80 por trabajos de Luc Montagnier en el Instituto Pasteur de París y Robert Gallo en el Instituto Nacional del Cáncer en los Estados Unidos. El VIH es un miembro de la familia Retroviridae, un retrovirus de tipo D que pertenece a la subfamilia de los lentivirus. Se incluyen en esta familia los oncovirus HTLV-I y HTLV-II que principalmente induce la formación de tumores. Hay dos tipos distintos de VIH, el VIH-1 y VIH-2. VIH-1 se divide en 9 subtipos, Grupo M (subtipo A - H), Grupo N y Grupo O, mientras que el VIH-2 se divide en dos subtipos (Grupo A y B). VIH-1 se compone de una membrana de lípidos, proteínas estructurales y glicoproteínas que sobresalen. El genoma viral consiste de tres componentes estructurales principales: pol, gag y env. Ellos codifican productos diversos: pol produce ADN polimerasa y endonucleasa, gag codifica p24, p17, p9 y p7, y env codifica gp41 y gp120. VIH-2 tiene una envoltura diferente y ligeramente diferentes proteínas del core. Las proteínas importantes en el diagnóstico serológico de VIH son: para VIH-1, la gp41 y gp160/120 del envoltura (gen env) y p24 del locore (gen gag). Para el VIH-2, la gp34 y gp140 de la envoltura (gen env) y p26 de lo core (gen gag). Lo genes que codifican y sus respectivos antígenos que puede inducir la producción de anticuerpos después de la exposición al virus incluyen:gag (antígenos p55, p24 y p17), gen pol (antígenos p66 y p51), gen sor (antígeno p24), gen env (antígeno gp160, gp120 y gp41) y gene 3'orf (p27). La homología entre VIH-1 y VIH-2 son 60% entre los genes gag y 30-40% entre otros genes. Los ensayos inmunoenzimaticos de 1ª generación utilizavam lisados de antígenos virales, que mostraron reactividad cruzada, con altas tasas de falsos positivos. La segunda generación comenzaran a utilizar proteínas recombinantes. La primera y segunda generaciones se basaran en un ensayo ELISA indirecto y que sólo detectaran los anticuerpos IgG. Pruebas de 3ª generación utilizam polipéptidos y proteínas recombinantes altamente purificada, basada en una metodología de "sandwich de doble antígeno" y puede detectar varios anticuerpos anti-vih en la muestra (IgG, IgM, IgA, etc.). Los ensayos de 4ª generación utilizan la misma capacidad para detectar anticuerpos de 3ª generación, además de lo antígeno p-24, reduciendo la duración de lo "período de ventana inmunológica". El Imuno-ELISA HIV 1+2 de WAMA es un test imunoenzimático de 4ª generación, tipo "soble sandwich" que utiliza proteínas recombinantes gp120 y gp41 de VIH-1, gp36 de VIH-2, y anticuerpos anti-p24 del VIH, para tamizaje de donantes de sangre o como una ayuda en el diagnóstico clínico del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). PRINCIPIO DEL MÉTODO Los pocillos de la placa de microtitulación se recubren con proteínas recombinantes del VIH-1 (gp-41 y gp-120), VIH-2 (gp36) y anticuerpos monoclonales p-24 del VIH (fase sólida). En la primera fase de la prueba, conjugado de VIH anti-p24 marcado con biotina se añade a los pocillos de la placa junto con la muestra del paciente. Si anticuerpos anti-vih y/o antígeno p-24 están presentes en la muestra, serán capturada por antígenos recombinantes y/o anticuerpos anti-p24 de la fase sólida. En esta fase, es la formación de un inmunocomplejo representado por lo anticuerpo anti-p24 de la fase sólida, lo antígeno p-24 de la muestra y lo anticuerpo anti-p24 marcados con biotina (primero sandwich). El material no ligado se elimina mediante lavado. Un conjugado de antigenos VIH 1 y de 2 marcados con peroxidasa conjugada a avidina se añadirá y será capturado por el VIH-1 y/o anti-anticuerpos anti-vih-2 en la muestra de proteínas recombinantes adjunta a la fase sólida. Habrá la formación de un segundo imunocomplejo, representado por antígenos recombinantes, anti-vih 1 y/o 2 y anticuerpos VIH 1 y 2 antígenos marcados con peroxidasa (segundo sandwich). Un substrato (TMB y peróxido de hidrogênio de urea) es adicionado, el cual revela un color azul en los pocillos que enzima peroxidasa está presente. Una solución ácida de parada para bloquear la reacción enzimática es adicionada, que va a cambiar el color de la solución a amarillo. Entonces, la absorbancia se mide a 450 nm. La concentración de anticuerpos anti-hiv y/o antigeno p-24 es directamente proporcional a la intensidad de color de la reacción. PRESENTACIÓN DEL KIT E 96 determinaciones 1. R E FMicroplacas con pocillos cubiertos con proteínas recombinantes de VIH y anticuerpos anti p-24 (12 tiras removibles con 8 cavidades cada una) 2. Solución de lavado - 20 x concentrada (1 x 50 ml) 3. Conjugado de proteína recombinante de VIH 1+2 marcados con peroxidasa ligada a avidina (1 x 12,0 ml) 4. Conjugado de anticuerpo anti-p24 ligada a biotina (1 x 3,5 ml) 5. Sustrato Cromógeno Solución A (Peróxido de Hidrógeno) (1 x 6,0 ml) A precisão inter-ensaio foi determinada ensaiando 2 amostras de soros, uma positiva e outra negativa, em 20 replicatas, com operadores diferentes. Amostras Positivas Número de Vezes Média das Absorbâncias Desvio Padrão Positiva 20 1,145 0,08 5,9 % Negativa 20 0,33 0,027 8,2 % LIMITAÇÕES DE USO O teste Imuno-ELISA HIV 1+2 (Ag/Ac) da WAMA foi desenvolvido para se obter a mais alta sensibilidade e especificidade. Ressalta-se também que os anticorpos podem ser indetectáveis nos estágios iniciais da doença e em alguns indivíduos imunossuprimidos. Resultados repetidamente reagentes devem ser sempre interpretados com as informações clínicas do paciente e com os resultados de outros testes laboratoriais. Amostras reagentes que se tornam não reagentes quando retestadas devem ser consideradas não reagentes. Devido à alta sensibilidade dos testes ELISA, falsos resultados positivos podem ocorrer devido a várias razões, muitas das quais estão relacionadas, mas não limitadas, à inadequada etapa de lavagem. Quando os fatores de risco forem baixos um teste confirmatório (Western Blot, NAT Nucleic Acid Amplification Testing) deve ser realizado para confirmação diagnóstica. Podem ocorrer falsos resultados negativos nos períodos da chamada janela sorológica, ou seja, período entre a contaminação pelo HIV e o surgimento de anticorpos em concentração que permita ser detectado pelo teste (soroconversão); geralmente acima de 8 semanas do contágio. Os testes ELISA de 4ª geração, que utilizam a pesquisa do antígeno p-24 e dos anticorpos anti-hiv, reduzem a janela imunológica em cerca de uma semana quando comparado com os de 3ª geração (29 dias). O teste não distingui infecção causada pelo HIV-1 das causadas pelo HIV-2. A prevalência da doença na população avaliada afetará o valor preditivo do teste. PRECAUÇÕES E ADVERTÊNCIAS 1. Os reagentes devem ser conservados entre 2 8 ºC. 2. A data de validade corresponde ao último dia do mês assinalado nos rótulos dos frascos e da caixa do kit. 3. Deve ser evitado expor os reagentes a temperaturas elevadas, bem como diretamente ao sol. 4. Não congelar nenhum reagente, pois isto causará deterioração irreversível. 5. O Imuno-ELISA anti-hiv 1+2 (Ag/Ac) da WAMA contém materiais de origem humana, os quais foram testados, com resultados negativos para anticorpos anti-hiv 1 e 2 (exceto o Soro Controle Positivo), antígeno de superfície da hepatite B (HBsAg) e anti-h. Porém, como nenhum método diagnóstico oferece completa segurança, na ausência destes e de outros agentes infecciosos, recomenda-se tratar todos os reagentes como materiais potencialmente infecciosos, bem como ter o mesmo cuidado no descarte destes materiais. 6. Solução STOP contém ácido sulfúrico (H2SO4) 2,0 M. Manusear com cuidado. É corrosivo. Em caso de contato com a pele lavar abundantemente em água corrente. 7. Não utilizar reagentes ou microplacas de lotes diferentes. 8. Deixar os reagentes adquirir a temperatura ambiente (20 25 ºC) antes de iniciar os testes. 9. Os reagentes devem ser homogeneizados levemente por inversão e tampados imediatamente após o uso. 10. Não deixar os cavidades da microplaca secar durante o ensaio. 11. Evitar repetidas pipetagens dos reagentes estoques, pois isso pode causar contaminação. 12. As amostras a serem testadas e os soros controles devem ser utilizados ao mesmo tempo para manter as mesmas condições do teste. 13. Não usar reagentes após a data de validade. 14. Descartar o material conforme regulamentações locais. 15. Utilizar a Boas Práticas de Laboratórios (BPLs) na conservação, manuseio e descarte dos materiais. TERMO DE GARANTIA A WAMA Diagnóstica garante a troca deste conjunto diagnóstico, desde que o mesmo esteja dentro do prazo de validade e que seja comprovado por sua assessoria técnica que não houve falhas na execução, manuseio e conservação deste produto. A WAMA e seus distribuidores não se responsabilizarão por falhas no desempenho do kit sob essas condições.

8 07 12 ENGLISH SUMMARY The Human Immunodeficiency Syndrome is caused by HIV (Human Immunodeficiency Virus), which was determined as the etiologic agent in the 80s by the work of Luc Montagnier, in the Pasteur Institute in Paris, and Robert Gallo, in the National Cancer Institute in the United States. The HIV is a member of the retroviridae family, a type D retrovirus that belongs to the lentiviruses subfamily. Included in this family are the oncovirus HTLV-I and HTLV-II that primarily induce the formation of tumors. There are two distinct types of HIV, HIV-1 and HIV-2. The HIV-1 is divided into 9 subtypes, Group M (subtype A - H), Group N and Group O, while HIV-2 is divided into 2 subtypes (Group A and B). HIV-1 is made of a lipid membrane, structural proteins and glycoproteins that protrudes from the outer surface. The viral genome consists of 3 major structural components: pol, gag and env. The encode several products: pol encodes DNA polymerase and endonuclease, gag encodes p24, q17, p9 and p7, and env encodes gp41 and gp120. HIV-2 has a different envelope and slightly different core proteins. The important proteins in HIV serum diagnosis are: for HIV-1, gp41 and gp160/120 from the envelope (env gene) and p24 from core (gag gene). For the HIV-2, gp34 and gp140 from the envelope (env gene) and p26 from core (gag gene). The genes that encode and their respective antigens may induce the production of antibodies after exposure to the virus are: gag gene (antigens p55, p24 and p17), pol gene (antigens p66 and p51), sor gene (antigen p24), env gene (antigen gp160, gp120 and gp41) and gene 3 'orf (p27). The homology between HIV-1 and HIV-2 is 60% between the gag, and 30-40% for the remaining genes. The 1st generation immunoenzymatic assays of used lysates of viral antigens, which had cross-reaction, with high rates of false-positive. The 2nd generation started using recombinant proteins. The 1st and 2nd generations were based in an indirect ELISA and could only detect IgG antibodies. The 3rd generation tests use highly purified polypeptides and recombinant proteins, based on a "double antigen sandwich" methodology, and may detect multiple anti-hiv antibodies in the sample (IgG, IgM, IgA, etc.). 4th generation use the same ability to detect antibodies of a 3rd generation, in addition to the p-24 antigen, reducing the window period. The Imuno-ELISA HIV 1+2 (Ag/Ac) from WAMA is a 4th generation immunoenzymatic test, "double sandwich" type, which uses gp120 and gp41 recombinant proteins from HIV-1, gp36 from HIV-2, and anti-p24 antibodies from HIV, with the purpose of screening blood donors or as an aid to clinical diagnosis of Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS). PRINCIPLE OF THE METHOD The wells of the microtiter plate are covered with recombinant proteins of HIV-1 (gp-41 and gp-120), HIV-2 (gp-36) and monoclonal antibodies anti-p24 of HIV (solid phase). In the first phase of the test, conjugated HIV anti-p24 labeled with biotin is added to the wells of the plate along with the sample of the patient. If anti-hiv antibodies and/or p-24 antigen are present in the sample they will be captured by recombinant antigens and/or anti-p24 antibodies from the solid phase. In this phase, there is the formation of a imunocomplex represented by the antip24 antibody from the solid phase, the p-24 antigen from the sample and the anti-p24 antibody labeled with biotin (1st sandwich). Material not bound is removed by washing. A conjugate of HIV 1 and 2 antigens marked with peroxidase conjugated to avidin is added and will be captured by HIV-1 and/or anti-hiv-2 antibodies in the sample bound to recombinant proteins from the solid phase. There will be the formation of a 2nd imunocomplex, represented by recombinant antigens, anti-hiv 1 and/or 2 antibodies and HIV 1 and 2 antigens labeled with peroxidase (2nd sandwich). A substrate (TMB and urea hydrogen peroxide) is added to the mixture, which will develop a blue coloration on the cavities when the peroxidase enzyme is present. An acidic stop solution to block the enzymatic reaction is added, which will change the color of the solution to yellow. The absorbance is then measured at 450 nm. The concentration of anti-hiv antibody and/or p-24 antigen is directly proportional to the intensity of the reaction color. KIT PRESENTATION R E F E 96 determinations 1. Microplate with wells covered with recombinant proteins of HIV and anti-p24 antibodies (12 removable strips with 8 cavities each) 2. Wash Solution concentrated 20x (1 x 50 ml) 3. Conjugate of HIV recombinant proteins labeled with peroxidase linked to avidin (1 x 12.0 ml) 4. Conjugated anti-p24 antibodies linked to biotin (1 x 3.5 ml) 5. Chromogen Substrate Solution A (Hydrogen Peroxide) (1 x 6.0 ml) 6. Chromogen Substrate Solution B (TMB) (1 x 6.0 ml) 7. Stop Solution (1 x 6.0 ml) specificity. Also note that that the antibodies may be undetectable in the initial stages of the disease and in some immunosuppressed individuals. Results repeatedly reactives must always be interpreted with the clinical information of the patient and with other laboratory test results. Reactive samples that become non-reactive when retested must be considered not reactive. Due to the high sensitivity of ELISA tests, false positive results may occur due to various reasons, many of which are related, but not limited to, improper washing step. When the risk factors are low a confirmatory test (Western Blot, NAT - Nucleic Acid Amplification Testing) must be performed for diagnostic confirmation. There may be false negative results in the periods of so-called "serological window", i.e. period between HIV infection and the appearance of antibodies in concentrations that can be detected by the test (seroconversion); usually over 8 weeks of infection. The 4th generation ELISA tests, which uses the research of p-24 antigen and anti-hiv antibodies, reduce the "window period" in about a week when compared with the 3rd generation tests (29 days). The test does not distinguish infection caused by HIV-1 from those caused by HIV-2. The prevalence of the disease in the evaluated population will affect the predictive value of the test. PRECAUTIONS AND WARNINGS 1. The reagents should be kept between 2-8 ºC. 2. The expiry date refers to the last day of the month indicated on the labels of the vial and of the kit box. 3. Avoid exposing the reagents to high temperatures and direct sunlight. 4. Do not freeze the reagent, as this may cause irreversible damage. 5. The Imuno-ELISA anti-hiv 1+2 (Ag/Ac) from WAMA contains materials of human origin, which have been tested, with negative results for anti-hiv I and 2 antibodies (except the Positive Serum Control), Hepatitis B surface antigen (HBsAg) and anti-h. However, as no diagnostic method offers complete safety, in the absence of these and other infectious agents, it is recommended to deal with all the reagents as potentially infectious materials, as well as having the disposing these materials. 6. Stop Solution contains 2.0 M Sulfuric Acid (H2SO4). Handle with care. Corrosive. On skin contact, immediately flush with large amounts of water. 7. Do not use reagents or microplates fof different batches. 8.Allow the reagents to reach the room temperature (20-25ºC) before starting the test. 9. The reagents should be homogenized gently by inversion and capped immediately after use. 10. Do not let the wells of microtiter plates dry during the test. 11. Avoid repeated pipetting the reagents,because this could cause contamination. 12. The samples to be tested and the serum controls should be used at the same time to maintain the same test conditions. 13. Do not use the reagent after the expiration date. 14. Discard the material following local regulations. 15. Use the Good Laboratory Practices (GLPs) in storage, handling and disposal of materials. WARRANTY WAMA Diagnóstica guarantees the exchange of the diagnostic kit, provided it is within the expiration date and is proven by its technical support that there were no technical mistakes in the execution, handling and storage of this product. WAMA and its distributors are not liable for failures on the performance of the kits under these conditions.

9 11 08 TEST VALIDATION: The test is valid if: The O.D. of the blank,which contains only Substrate Chromogen A and B and Stop Solution is less than at 450 nm. The O.D. value of the negative controls is less than at 450/630 nm or at 450 nm after subtracting the blank. The O.D. value of the positive controls must be greater than or equal to at 450/630 nm or at 450 nm after subtracting the blank. INTERPRETATION OF THE RESULTS Divide the OD value of the patient sample by the Cut-off value. The test is considered: REACTIVE : if the value is equal or greater than 1.1. INDETERMINATE (Borderline) : if value is between 0.9 and 1.1. NOT REACTIVE : if value is less than 0.9. WARNING: IT IS ALWAYS RECOMMENDED REPEAT THE TEST IN THE REACTIVE SAMPLES. SENSITIVITY AND SPECIFICITY OF THE TEST In a study conducted with 850 samples of serum and plasma obtained from a reference laboratory and a panel of commercial serum, of which 154 were positive and 696 negative, the sensitivity and specificity were determined for the Imuno-ELISA HIV 1+2 (Ag/Ac) from WAMA. Sensitivity = True Positive / (True Positive + False Negative) x 100 Specificity = True Negative / (True Negative + False Positive ) x 100 True Positives RESULTS 154 False Positives 1 True Negatives 695 False Sensitivity Especificity Negatives ANALYTICAL SPECIFICITY There was no cross-reaction in sera from infected patients by the hepatitis A virus, hepatitis B virus, hepatitis C virus, HTLV, Cytomegalovirus, and Treponema pallidum. During the tests, no "Hook" effect for high concentrations of antibodies was observed nor interference with rheumatoid factor was found. The performance characteristic of the test is not affected by high concentrations of bilirubin and hemoglobin. The analytical sensitivity of the immuno-elisa HIV 1+2 (Ag/Ac) for the detection of HIV p-24 antigen is approximately 5 pg/ml. PRECISION OF THE TEST: a. Intra-Assay Precision The intra-assay precision was determined by assaying 2 serum samples, one positive and one negative, in 20 replicates. Positive samples Number of times. Average of Deviation Absorbances Standard Positive % Negative % b. Inter-Assay Precision The inter-assay precision was determined by assaying 2 serum samples, one positive and one negative, in 20 replicates, by differenttechnicians. Positive samples Number of times. Average of Absorbances Deviation Standard Positive % Negative % LIMITATIONS OF USE The Imuno-ELISA HIV 1+2 (Ag/Ac) test from WAMA was developed to obtain the highest sensitivity and 8. Negative Control (1 x 1.0 ml) 9. Positive Control (1 x 1.0 ml) 10. Positive Control-2 (1 x 1.0 ml) 11. Positive Control-3 (1 x 1.0 ml) 12. Instructions for use R E F E 192 determinations 1. Microplate with wells covered with recombinant proteins of HIV and anti-p24 antibodies (24 removable strips with 8 cavities each) 2. Wash Solution concentrated 20x (2 x 50 ml) 3. Conjugate of HIV recombinant proteins labeled with peroxidase linked to avidin (2 x 12.0 ml) 4. Conjugated anti-p24 antibodies linked to biotin (2 x 3.5 ml) 5. Chromogen Substrate Solution A (Hydrogen Peroxide) (2 x 6.0 ml) 6. Chromogen Substrate Solution B (TMB) (2 x 6.0 ml) 7. Stop Solution (2 x 6.0 ml) 8. Negative Control (2 x 1.0 ml) 9. Positive Control (2 x 1.0 ml) 10. Positive Control-2 (2 x 1.0 ml) 11. Positive Control-3 (2 x 1.0 ml) 12. Instructions for use REAGENT PREPARATION AND STABILITY MICROPLATE (1): Remove from the envelope the strips that will be used, and allow it to reach room temperature (20 25 C). The strips that will not be used must be returned to the sealing envelope, with desiccant, and kept at 2 8 C. WASH SOLUTION (20x Concentrated) (2): Phasphate Buffered solution (PBS), ph=7,4, containing Tween-20 as deterggent Dilute the volume of the concentrate, filling it to 1000 ml with distilled or deionized water (dilution 1:20). If crystals are formed in the concentrated diluent, they must be dissolved at 37 C before the dilution is made. During each wash cycle, each well must be washed completely with approximately 350 µl. Keep at 2-8 C. Allow it to reach room temperature (20 25 C) before using it. CONJUGATE OF HIV RECOMBINANT PROTEINS LABELED WITH PEROXIDASE LINKED TO AVIDIN (3): ready to use. Stable at 2 8 C \up to the expiration date printed on the bottle. Do not freeze. Allow it to reach room temperature (20 25 C) before using it. CONJUGATED ANTI-p24 ANTIBODIES LINKED TO BIOTIN (4): ready to use. Stable at 2 8 C \up to the expiration date printed on the bottle. Do not freeze. Allow it to reach room temperature (20 25 C) before using it. CHROMOGEN SUBSTRATE SOLUTION A (HYDROGEN PEROXIDE) (5): stabilized and ready to use. Stable at 2 8 C until expiration date printed on the bottle. Do not freeze. Allow it to reach room temperature (20 25 C) before using it. CHROMOGEN SUBSTRATE SOLUTION B (TMB) (6): solution stabilized with Tetramethyl Benzidine. Ready to use. Stable at 2 8 C until expiration date printed on the bottle. Do not freeze. Allow it to reach room temperature (20 25 C) before using it. The TMB is not mutagenic and not carcinogenic. STOP SOLUTION (7): ready to use. Contains 2.0 M Sulfuric Acid (H2SO4). Handle with care. Corrosive. On skin contact, immediately flush with large amounts of water. Allow it to reach room temperature (20 25 C) before using it. Stable at until expiration date printed on the bottle. NEGATIVE SERUM CONTROL (8): control diluted in stabilized protein buffer, negative for HIV 1 and 2. Ready to use. Use it as is (do not dilute it). Stable at 2 8 C \up to the expiration date printed on the bottle. Contains ProClin % as preservative. POSITIVE CONTROL-1 (9): Control diluted in protein stabilized buffer, positive for anti HIV-1 antibodies. Ready to use. Use it as is (do not dilute it). Stable at 2 8 C \up to the expiration date printed on the bottle. Contains ProClin % as preservative. POSITIVE CONTROL-2 (10): Control diluted in protein stabilized buffer, positive for anti HIV-2 antibodies. Ready to use. Use it as is (do not dilute it). Stable at 2 8 C \up to the expiration date printed on the bottle. Contains ProClin % as preservative. POSITIVE CONTROL-3 (11): Control diluted in protein stabilized buffer, positive for p-24 antigen. Ready to use. Use it as is (do not dilute it). Stable at 2 8 C \up to the expiration date printed on the bottle. Contains ProClin % as preservative. Note: The kit has the same performance after first use, and is stable until the expiration date described on the label if it is kept in the indicated temperature (2-8 C).

10 09 10 SPECIMENS Use serum or plasma specimens not hemolysed, lipemic or contaminated. The plasma sample can be collected with EDTA, sodium citrate or heparin. The sample can be stored covered in refrigerator at 2-8 C for 48 hours. For long-term storage, serum or plasma must be kept in the freezer at 20ºC. Frozen specimens must be homogenized before testing. Avoid making foam. Avoid repeated freezing and thawing as this may lead to false results. MATERIAL REQUIRED BUT NOT PROVIDED Micropipettes (50µl) and tips Distilled and deionized water for the dilution of the wash solution. Microplate shaker. Incubator at 37 C. Microplate reader with 450nm filter. Microplate Washer Absorbent paper. Container for material disposal. PROCEDURE IMPORTANT: Bichromatic absorbance measurements using reference filter with wavelength of 630 nm is recommended when available. In this condition, the use of "blank" should be disregarded, since it should be used only when using a 450 nm single filter. 1. In accordance with the established plan for the plate distribution, use 3 wells for the negative control (8) and 3 wells for the positive controls - 1 well for the positive control-1 (9), 1 well for the positive control-2 (10) and 1 well for the positive control-3 (11). Use one well for the blank, which will have only 50µl of the chromogen substrate solution A (5), and 50µl of chromogen substrate solution B (6) and Stop Solution (7). 2. Dispense with 20µl of the anti-p24 conjugate linked to biotin (4) in each well, except for the vlank. 3. Dispense 100µl of positive and negative controls (without diluting) as set out in item 1, and 100µl of samples in other wells to be tested. Use individual tips for each sample, to avoid contamination. 4. Gently homogenize the samples, by holding the plate on the edges and shaking it for 30 seconds or use a microtiter plate shaker. 5. Cover the plate with adhesive foil and incubate at 37 C for 60 minutes. 6. Discard the contents of the plate into a container with disinfecting solution carefully, to avoid contamination between the cavities. 7. Wash the plate 5 times with diluted Wash Solution (2) (see Preparation and Stability of Reagents). Aspirate the contents of the plate, dispense 350µl of diluted Wash Solution (2) in each well, wait 30 seconds, and empty the contents of the wells. Repeat this procedure 4 times (total of 5 cycles). We recommend using a microplate washer (manual or automatic). WARNING: The correct washing procedure is essential for good performance of the test. 8. After the last wash, turn the plate over and tap it dry on absorbent paper to remove any residual liquid. 9. Dispense 100µl of the HIV 1 and 2 conjugate marked with peroxidase linked to avidin (3) in all wells, except the blank. 10. Gently homogenize the samples, by holding the plate on the edges and shaking it for 30 seconds or use a microtiter plate shaker. 11. Cover the plate with adhesive foil and incubate at 37 C for 30 minutes. 12. Repeat the steps 6, 7 and Pipette 50µl of chromogen substrate Solution A (5) and 50µl of chromogen substrate - Solution B (6) in each well of the microplate, including the blank. A blue color will develop wherever the peroxidase enzyme is present. Gently homogenize the samples, by holding the plate on the edges and shaking it or use a microtiter plate shaker for 30 seconds. 14. Incubate at 37 C for 15 minutes, protecting from light. 15. Block the reaction by dispensing 50µl of Stop Solution (7) in each well of the microplate, including the blank. The solution will change the color to yellow. Gently homogenize the samples, by holding the plate on the edges and shaking it or use a microtiter plate shaker for 30 seconds. 14. Read the absorbance (O.D.) in a microplate reader with 450 nm filter, against the blank of the substrate, within 15 minutes. NOTE: it is recommended to use a dual wavelength using a reference filter of 630 nm when available. IMPORTANT: The wash procedure is critical for the performance of the test. Insufficient washing will result in inaccurate readings or falsely elevated absorbance. Performing the tests in duplicate, though not required, is recommended. The pipetting time for the specimens and controls should not exceed 30 minutes. SUMMARY OF THE PROCEDURE 1. Pipette 20µl of the anti-p24 conjugate linked to biotin (4) in each well, except in the blank. 2. Pipette 100µl of negative controls (8) (3 wells) and positive controls-1 (9) and positive-2 (10) and positive-3 (11) in the microplate. Pipette 100µl of sample in other cavities. 3. Mix for 30 seconds and incubated at 37 C for 60 minutes. 4. Discard the contents of the microplate within a container containing disinfectant solution and wash 5 times with wash solution (2). 5. Completely discard the contents of the last wash, removing any residual liquid. 6. Pipette 100 µl of enzyme conjugate (3) in each well of the plate, except blank. 7. Mix for 30 seconds and incubated at 37 C for 30 minutes. 8. Repeat the steps 4 to Pipette 50 µl of Chromogen Substrate - Solution A (5) and 50 µl of Chromogen Substrate - Solution B (6) in each well of the plate, including the blank (which should contain only these reagents). The color of the solution turns blue wherever there is peroxidase. 10. Mix for 30 seconds and incubated in the dark at 37 C for 15 minutes. 11. Pipette 50µl of the Stop Solution (7) in each well of the microplate. The solution color will turn yellow. 12. Mix for 30 seconds. EXAMPLE OF THE DISTRIBUTION DIAGRAM IN THE PLATE A Blank A2 B Neg. Control A3 C Neg. Control A4 D Neg. Control A5 E Control Pos.-1 A6 F Control Pos.-2 G Control Pos.-3 H A1 CALCULATION OF RESULTS Determine the optical density (OD) for each test and control serum. whose the final value is obtained by subtracting the blank from the OD. If double wavelength is used, the blank is ommited, therefore, the the O.D readings are used without subtracting. If more than one microplate is used they should be considered separately for calculation and interpretation of results. Determine the Cut-off value: Warning: If the value of OD of one of the negative controls does not fall within the control range specified in the test validation, the OD of this this control should be discarded. If more than one negative control does not meet the specification, the test should be considered invalid and must be repeated. Example: OD value of the of negative controls = Then, the OD of must be discarded and the average of OD of negative controls is ( ) /2 = Therefore, Cut-off = = Cut-off = average OD of Negative Control