Título: Papel de las células B como células presentadoras de antígeno en Artropatía Psoriásica y Artritis Reumatoide.
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1 Título: Papel de las células B como células presentadoras de antígeno en Artropatía Psoriásica y Artritis Reumatoide. Solicitante: Daniel Ramos Rodríguez Alumno 4º Grado en Medicina. Facultad de Medicina de la Universidad de La Laguna. S/C de Tenerife. Introducción La Artritis Reumatoide (AR) es una enfermedad crónica de etiología desconocida que causa inflamación de las membranas sinoviales y una destrucción progresiva de las articulaciones diartrodiales. Actualmente se le atribuye a las células T el principal papel en su patogénesis 1,2, aunque en los infiltrados inflamatorios de la membrana y líquido sinovial también se pueden encontrar otros tipos celulares, como los linfocitos B y macrófagos. Hasta hace poco tiempo el papel del las células B en la patogénesis de la AR se consideraba colateral. Sin embargo, los buenos resultados clínicos que la depleción sistémica de los linfocitos B por rituximab, un anticuerpo monoclonal anti-cd20, ha mostrado en pacientes con AR 3,4 ha devuelto el interés sobre la contribución que los linfocitos B a la patogénesis de la sinovitis reumatoide. En la artritis psoriásica (APs), una enfermedad inflamatoria crónica articular asociada a la presencia de psoriasis, el rituximab ha mostrado solo un efecto modesto en el control de los síntomas musculoesqueléticos 5,6, lo que sugiere que el papel que juegan las células B en la patogénesis de la APs debe ser diferente al de la AR. Hasta la actualidad se han propuesto tres mecanismos potenciales por los cuales los linfocitos B actúan en la patogénesis de la AR 7,8 : 1. La más obvia es la producción de anticuerpos (células plasmáticas) y la formación de inmunocomplejos que al unirse al receptor Fc y activar el complemento, activan la producción de citoquinas proinflamatorias por el macrófago. 2. El infiltrado de linfocitos B en la membrana sinovial produce localmente factores proinflamatorios solubles, incluyendo el TNF-α o la IL-6 que conducen a la sinovitis. 3. Los linfocitos B regulan la función de los linfocitos T, principalmente de los CD4+ en la membrana sinovial, al actuar como células presentadoras de antígeno (CPA). Se desconoce cual de estos es el principal mecanismo patogénico de las células B en la sinovitis reumatoide o si existen otros mecanismo adicionales. En este sentido, los linfocitos B son capaces de producir metaloproteasas (enzimas que degradan la matriz extracelular) 9 cuando son activados por diferentes estímulos, aunque se desconoce cuanta es su relación con la capacidad de producir destrucción de la articulación en la AR. Las células dentríticas y los macrófagos juegan el papel más importante en la respuesta inmune actuando como CPA profesionales. Los linfocitos T reconocen los péptidos unidos a moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad clase II que se
2 expresan en la membrana de las CPA. Sin embrago con el fin de convertirse en linfocitos T efectores, estas células deben recibir una segunda señal de un péptido específico de membrana que se expresa en la superficie de las CPA, en un proceso denominado co-estimulación. CD40 y CD86 (también conocida como B7,2) son los dos receptores de membrana presentes en la CPA responsables de las señales coestimuladoras necesarias para la activación de los linfocitos T. El papel de los linfocitos B como presentadores de antígenos a linfocitos T naïve se ha investigado en modelos animales durante las últimas dos décadas En dos modelos murínos de artritis inducida por proteoglicanos y colágeno, se ha propuesto que los linfocitos B pueden estar involucrados en la patogenia de la artritis mediante la producción de autoanticuerpos y además actuando como CPA 13,14. Hipótesis de Trabajo La hipótesis que este trabajo defiende es que las células B presentes en el tejido sinovial pueden participar en la patogenia de la AR y de la APs mediante su capacidad para actuar como célula presentadora de antígeno. Desarrollo Objetivos Los objetivos concretos de este trabajo son: 1. Conocer mediante estudios de inmunohistoquímica la expresión de moléculas de clase II y de moléculas co-estimuladoras: CD40 y CD86 en las células B (CD20+) presentes en el infiltrado sinovial de pacientes con AR. 2. Determinar mediante estudios de citometría de flujo el nivel diferencial de expresión de moléculas de clase II, HLA-DR, -DP y DQ en células B (CD20+) de sangre periférica (SP) respecto de las del líquido sinovial (LS) en pacientes con AR y APs y determinar diferencias en las relaciones de expresión SP/LS de estas moléculas entre ambas patologías. 3. Mediante la misma aproximación experimental que en el punto 2, conocer las diferencias de expresión de CD40 y CD86 en células B de SP y LS de ambas patología. 4. Determinar mediante RT-PCR cuantitativa la expresión de factores intracelulares relacionadas con la diferenciación hacia células dendrítica, como el IFIT4 (Interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 4) 15 en células B de SP y LS de pacientes con AR y APs. Metodología: Pacientes Las muestras biológicas de SP y LS se obtendrán simultáneamente de pacientes con AR y APs por reumatólogos expertos del Servicio de Reumatología. Los pacientes cumplirán con los criterios para AR del año 1986 del Colegio Americano de Reumatología 16 y los criterios CASPAR para APs 17. Todos los pacientes firmarán un consentimiento informado y el estudio será sometido a la aprobación del comité ético del Hospital donde serán atendidos.
3 Estudios de inmunohistoquímica Muestras de Tejido sinovial de pacientes con AR serán procesadas para realizar doble marcaje con anticuerpos fluorescentes para determinal la presencia de CD20/HLA-DR, CD20/CD40 y CD20/CD86. Las muestras de tejido serán analizadas mediante microscopia confocal para determinar la presencia de moléculas de clase II (HLA-DR) y co-estimuladoras (CD40 y CD86) en células B (CD20+) presentes en el infiltrado sinovial. Aislamiento celular y cultivo Las células mononucleares (monocitos y linfocitos T y B) serán aisladas de muestras heparinizadas de SP y LS obtenidos simultáneamente de pacientes con AR y APs activas mediante centrifugación en gradiente de densidad en Ficoll. Después de un lavado en buffer salino, la banda de mononucleares será estudiada mediante citometría de flujo multicolor usando CD20 como marcador de células B. Algunas muestras de LS y SP serán utilizadas para aislamiento de células B mediante inmunoselección negativa utilizando bolas magnéticas acopladas a anticuerpos (StemCell Technologies, Grenoble, France) Citometría de flujo Células mononucleares aisladas de SP y LS de RA y APs serán marcadas con dos anticuerpos conjugados directamente a 4ºC durante 30 min, siendo uno de ellos un anticuerpo anti-cd20 humano marcado con ficoeritrina (rojo) (para distinguir células B) y el otro un anticuerpo marcado con fluoresceína (verde) anti-hla-dr o anti-hla-dp o anti-hla-dq o anti-cd40 o anti-cd86 humanos. Después de un lavado, las células serán analizadas en un ACCURI C6 (BD Bioscience) y los datos de niveles de expresión en superficie adquiridos en escala logarítmica. Como controles de fluorescencia se utilizarán anticuerpos controles marcados con fluoresceína o ficoeritrina del mismo isotipo. Debido a que la fluorescencia puede variar entre experimentos, los datos de citometría de flujo (media de intensidad de fluorescencia, MFI) serán normalizados y expresados como MFI relativa (rmfi) según la siguiente ecuación: rmfi = (MFI LS MFI control de isotipo ) / (MFI sp MFI control de isotipo 100) RT-PCR cuantitativa Para el análisis cuantitativo de la expresión de genes, se analizará el mrna de células B aisladas por inmunoselección negativa de muestras de LS y SP de pacientes con AR y APs mediante RT-PCR cuantitativa. Se utilizarán sondas específicas para IFIT4 y para beta2 microglobulina como control de carga. Las condiciones de la PCR serán establecidas según las características de las sondas que se diseñen. Todos los datos de PCR serán expresados utilizando el método (2 - CT ) 18 Estadística Las diferencias entre grupos serán examinadas para significación estadística usando el Test de Wilcoxon para muestras pareadas. Valores de p menores de 0.05 serán considerados significativos. Los datos se expresarán como media aritmética ± desviación estándar.
4 Conclusión Un estudio de las moléculas que intervienen en la presentación de antígenos por parte de los linfocitos B así como la expresión de factores intracelulares relacionadas con la diferenciación hacia células dendrítica podría ayudarnos a entender el papel de los linfocitos B en la patogenia de la APs y además de la AR. De esta forma, en el caso de que alguna de estas moléculas se viera involucrada en la patogenia de la enfermedad, podríamos actuar farmacológicamente ya que hoy en día existen terapias biológicas diana contra alguna de las moléculas de membrana que expresan los linfocitos B y que se recogen en este estudio, ejemplo de ellas son: rituximab (CD20) y abatacept (CD86). Bibliografía 1. Gonzalez-Quintial, R., Baccala, R., Pope, R.M. & Theofilopoulos, A.N. Identification of clonally expanded T cells in rheumatoid arthritis using a sequence enrichment nuclease assay. J Clin Invest 97, (1996). 2. Choy, E. Understanding the dynamics: pathways involved in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. Rheumatology (Oxford, England) 51 Suppl 5, v Jacobi, A.M. & Dorner, T. Current aspects of anti-cd20 therapy in rheumatoid arthritis. Curr Opin Pharmacol (2010). 4. Edwards, J.C., et al. Efficacy of B-cell-targeted therapy with rituximab in patients with rheumatoid arthritis. N Engl J Med 350, (2004). 5. Jimenez-Boj, E., et al. Rituximab in psoriatic arthritis: an exploratory evaluation. Annals of the rheumatic diseases 71, (2012). 6. Wendling, D., et al. Rituximab treatment for spondyloarthritis. A nationwide series: data from the AIR registry of the French Society of Rheumatology. The Journal of rheumatology 39, (2012). 7. Moura, R.A., Graca, L. & Fonseca, J.E. To B or not to B the conductor of rheumatoid arthritis orchestra. Clinical reviews in allergy & immunology 43, (2012). 8. Finnegan, A., Ashaye, S. & Hamel, K.M. B effector cells in rheumatoid arthritis and experimental arthritis. Autoimmunity 45, (2012). 9. Trocme, C., et al. Human B lymphocytes synthesize the 92-kDa gelatinase, matrix metalloproteinase-9. J Biol Chem 273, (1998). 10. Constant, S., Schweitzer, N., West, J., Ranney, P. & Bottomly, K. B lymphocytes can be competent antigen-presenting cells for priming CD4+ T cells to protein antigens in vivo. J Immunol 155, (1995). 11. Kurt-Jones, E.A., et al. The role of antigen-presenting B cells in T cell priming in vivo. Studies of B cell-deficient mice. J Immunol 140, (1988). 12. Ron, Y. & Sprent, J. T cell priming in vivo: a major role for B cells in presenting antigen to T cells in lymph nodes. J Immunol 138, (1987). 13. O'Neill, S.K., et al. Antigen-specific B cells are required as APCs and autoantibody-producing cells for induction of severe autoimmune arthritis. J Immunol 174, (2005). 14. Taneja, V., et al. B cells are important as antigen presenting cells for induction of MHC-restricted arthritis in transgenic mice. Molecular immunology 44, (2007). 15. Huang, X., et al. Interferon-induced protein IFIT4 is associated with systemic lupus erythematosus and promotes differentiation of monocytes into dendritic cell-like cells. Arthritis Res Ther 10, R91 (2008).
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