CURSO DE POSTGRADO APLICACIÓN DE LOS MARCADORES MOLECULARES

Transcripción

1 CURSO DE POSTGRADO APLICACIÓN DE LOS MARCADORES MOLECULARES Dr. Oscar Díaz Director del Programa FITOGEN Departamento de Acuicultura y Recursos Agroalimentarios Universidad de Los Lagos

2 SELECCIÓN ASISTIDA POR MARCADORES MOLECULARES (SAM)

3 MARKER ASSISTED SELECTION (MAS)

4 Los fitomejoradores han trabajado durante años en la selección de plantas basándose en el FENOTIPO. LA EXPRESIÓN DEL FENOTIPO en un ambiente determinado debe ser evaluada en la progenie de los individuos seleccionados y en el tiempo, y el tiempo que eso lleva dependerá del intervalo generacional y del número de descendientes.

5 Con sólo observar el fenotipo, el fitomejorador no puede conocer los genes directamente involucrados en la expresión de un carácter, su localización y su función.

6 TERMINOLOGÍA SOBRE SELECCIÓN ASISTIDA POR MARCADORES Marker Assisted Selection (MAS) - Selección asistida por marcadores, en general. Gene Assisted Selection (GAS) - Cuando se refiere a un gen conocido. Marker Asissted Breeding (MAB) - Aplicación de marcadores en fitomejoramiento, en combinación a mapas de ligamiento y genómica (Incluye al MAS, MABC, MARS, QWS ó GS)

7 TERMINOLOGÍA SOBRE SELECCIÓN ASISTIDA POR MARCADORES El término marcador, locus y gen son a menudo (y equivocadamente) usados de igual manera. Un locus (plural loci) es un lugar específico en el cromosoma, donde está localizado un gen. Un marcador es usado para identificar o rastrear un locus (o gen). Locus y gen son sinónimos sólo si el locus corresponde a la secuencia de ese gen.

8 QUÉ ES MAS? Es una valiosa herramienta, que combina técnicas de mejoramiento convencional y de biología molecular. En MAS, un marcador genético (morfológico, bioquímico o de ADN) es usado para seleccionar indirectamente individuos portadores de genes que determinan caracteres de interés que son difíciles o costosos de medir.

9 USO DE MAS EN FITOMEJORAMIENTO El uso de MAS en fitomejoramiento se inició aprox. en el año 1980, cuando se utilizaron marcadores isoenzimáticos para acelerar la introgresión de caracteres monogénicos desde el germoplasma exótico hacia variedades de élite. Beckmann & Soller (1986) usaron marcadores RFLPs en el mejoramiento de variedades, incluyendo los aspectos relacionados con los retrocruzamientos asistidos por marcadores moleculares para el mejoramiento de caracteres cualitativos.

10 EL USO DE MAS EN FITOMEJORAMIENTO Lande & Thompson (1990) fueron los primeros en considerar MAS para los caracteres cuantitativos (Genetics 124(3):743-56). Posteriormente, y a la fecha, se han aplicado MAS en programas de fitomejoramiento y la optimización de (1) los sistemas de retrocruzas asistidas por marcadores (MABC, por su acrónimo inglés, Marker- Assisted Backcrossing); y (2) las estrategias para la piramidación de alelos favorables en esquemas de selección recurrente.

11 CARACTERÍSTICAS DE MAS Con MAS se puede mejorar (más eficiente) los factores determinantes de los Incrementos de los Rendimientos en un programa de mejoramiento genético.

12 CARACTERÍSTICAS DE MAS La selección Asistida por Marcadores permite: Organizar, mantener e incrementar la diversidad genética. Disminuir el efecto de la interacción genotipo/ambiente. Disminuir el tiempo requerido para completar los ciclos de selección.

13 CARACTERÍSTICAS DE MAS Con MAS es posible reducir el número de retrocruzamientos para obtener un 97% o más del padre recurrente. MAS se utilizada para acumular QTL y realizar selección a través de la introgresión de caracteres.

14 CARACTERÍSTICAS DE MAS Los marcadores moleculares en MAS pueden ser de tipo directos (en el mismo gen) o indirectos (ligado al gen). Con MAS, se acelera la eficiencia del proceso de mejoramiento, ya que es posible seguir la huella de la presencia de genes útiles en cada generación. Esto no excluye, sin embargo, la necesidad de hacer evaluaciones en el campo.

15 MARCADORES MOLECULARES COMO HERRAMIENTAS EN MAS Se aplica, principalmente, para caracteres simples por conversión linear (retrocruzas más rápidas). Transferencia de fragmentos genómico múltiples (pocos QTLs). Formación de pirámides genéticas. Selección y manipulación de alelos recesivos. Selección temprana.

16 REQUERIMIENTOS PARA REALIZAR MAS 1. CONFIABILIDAD: El marcador debe cosegregar o estar muy cercano al carácter deseado. 2. CALIDAD Y CANTIDAD DEL ADN: Algunas técnicas de marcadores requieren de grandes cantidades y buena calidad del ADN. 3. PROCEDIMIENTO TÉCNICO: La técnica de caracterización debería tener alta reproducibilidad entre laboratorios. 4. COSTOS: Debería ser económico y amigable. 5. NIVELES DE POLIMORFISMO: Debería ser polimórfico.

17 CARACTERÍSTICAS DE UN BUEN MARCADOR PARA MAS EN PROGRAMAS DE FITOMEJORAMIENTO - Ser altamente polimórfico (dentro y entre especies). - Tener herencia mendeliana, no epistática. - Insensible a los efectos ambientales. - Ser capaz de diferenciar individuos heterocigotos de homocigotos (Co-dominante). - De rápida identificación y simple análisis. - De detección en los estadios tempranos del desarrollo de la planta (seedling stage). - Poder seleccionar caracteres de baja heredabilidad. - Piramidar (combinar) genes.

18 Los individuos son muestreados y se procede a la extracción del ADN del material foliar (1 y 2). El ADN obtenido es utilizado como molde para realizar el proceso de amplificación por PCR del marcador elegido (3). ETAPAS PRINCIPALES DEL MAS

19 Los fragmentos obtenidos para cada individuo son resueltos mediante electroforesis (4). Los resultados son leídos e interpretados para decidir la selección de los individuos que presenten el alelo de interés (5). ETAPAS PRINCIPALES DEL MAS

20 MEJORAMIENTO ASISTIDO POR MARCADORES CROMOSOMAS Extracción de ADN Primer Locus A/a ligado al marcador M/m PCR analisis: Primers para el locus M/m A a M m Alelo m Alelo M Genotipos mm Mm MM mm MM Análisis por ADN: Presencia de M y m Genotipo de interés (aa) Selección de las plantas que sólo llevan m > Homocigotas m/m -> Plantas con genotipo aa

21 MEJORAMIENTO ASISTIDO POR MARCADORES Allelo/caracter deseado (1) (1) (1) (1) (1) (1) (1) (1) (1) (1) La selección se basa en la presencia del marcador molecular seleccionados

22 FITOMEJORAMIENTO CONVENCIONAL

23 FITOMEJORAMIENTO CONVENCIONAL Método Pedigree

24 Aplicación de MM MAS

25 MARCADOR MOLECULAR LIGADO A GENES MAYORES EN GIRASOL Con los marcadores ligados a genes mayores (e.g., resistencia a enfermedades), se puede estudiar su ubicación en el genoma y definir programas de selección o trabajos de ingeniería genética.

26 MEJORAMIENTO ASISTIDO POR MARCADORES PUEDE REDUCIR EL TIEMPO DEL PROCESO DE MEJORAMIENTO

27 COSTO BENEFICIO (METODO DE SELECCIÓN) (CONVENCIONAL VERSUS MAS)

28 DNA FINGERPRINTING

31 UN EJEMPLO DE MAS CON MAIZ DULCE

32 CONFIABILIDAD DEL MARCADOR El marcador debería estar muy cercano al gen(es) de interés. Esto se consigue a través de: 1. Mapeo de las descendencias (F2, BC1, o similares) que segreguen para el gen de interés: Se construye un mapa de marcadores y se estudia la co-segregación de los genes con el carácter de interés. La localización del gen(es) en el mapa supondrá la identificación de marcadores en su proximidad.

33 CONFIABILIDAD DEL MARCADOR Es deseable que la distancia entre marcador y el gen (o QTL) sea < 5cM).

34 CONFIABILIDAD DEL MARCADOR

35 CONFIABILIDAD DEL MARCADOR 2. Uso de mezclas de ADN en poblaciones segregantes. Se usa el método Bulked Segregant Analysis (BSA) Se obtiene una población (F2, BC1) que segregue para el gen de interés. Se realiza el fenotipado y la selección de dos grupos de plantas con fenotipos alternativos. Se extrae el ADN y se mezcla entre los individuos con el mismo fenotipo. Prunus mume J. Zhang et al. (2015). DNA Research 1-9

36 CONFIABILIDAD DEL MARCADOR Las dos mezclas de ADN se usan entonces para obtener el mayor número posible de marcadores (AFLP y RAPD) en busca de diferencias entre los patrones de bandas de las dos mezclas. Se asume que estas diferencias pueden corresponder a fragmentos de ADN próximos al gen de interés. Se aíslan estos fragmentos y se elaboran marcadores polimórficos cuya segregación se estudia en la población. Aquellos marcadores suficientemente próximos al gen de interés se usan en MAS.

37 MARKER-ASSITED PYRAMIDING (MAP)

38 DESARROLLO DE MARCADORES PARA LA RESISTENCIA A ENFERMEDADES

39 PIRIMIDACIÓN DE GENES

40 PIRIMIDACIÓN DE MULTIPLES GENES EN UNA VARIEDAD

41 PIRIMIDACIÓN ASISTIDA POR MARCADORES

42 EJEMPLOS DE MAS PARA LA PIRAMIDACIÓN DE GENES DE IMPORTANCIA

43 EJEMPLOS DE MAS PARA LA PIRAMIDACIÓN DE GENES DE IMPORTANCIA

44 MAS En MAS se requieren en muchos casos mapas de ligamiento (marcadores asociados con caracteres de interés). En algunos variedades existen mapas de ligamiento (arroz, maiz, trigo, otros), pero otros es limitado (casava, otros).

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46 POTENCIAL DE MAS EN CRUZAMIENTOS CON DIFERENTES NIVELES DE DIVERSIDAD GENÉTICA

47 EJEMPLOS DE MAS EN PROGRAMAS DE FITOMEJORAMIENTO

48 APLICACIÓN DE MARCADORES CODOMINANTES Y DOMINANTES DURANTE EL CICLO DE MEJORAMIENTO EN HABAS Existen diferentes formas de introducir MAS a diferentes esquemas de cruzamiento (Figura). Un mejorador podría considerar iniciar la selección por MAS en diferentes etapas para obtener los mejores beneficios (costo-beneficio). Podría ser a inicios del programa del programa cuando usa el método pedigree o al final cuando Mass Selection. En el caso de las generaciones tempranas, la eliminación de plantas sin los genes de interés evitará gastos innecesarios.

49 APLICACIÓN DE MARCADORES CODOMINANTES Y DOMINANTES DURANTE EL CICLO DE MEJORAMIENTO EN HABAS

50 GENES DE RESISTENCIA MAPEADOS EN TOMATE Aunque el Mejoramiento Convencional ha tenido un impacto significativo durante mucho tiempo para transferir resistencia a enfermedades en tomate, ha requerido mucho tiempo en cruzamientos y retrocruzamientos, en selección de progiene que sea resistente. Hoy se necesitan nuevos metodos de aceleren el proceso (sintomas sólo en estado adulto mutación de la población).

51 GENES DE RESISTENCIA MAPEADOS EN TOMATE

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53 RESUMEN DE VARIOS METODOS DE SELECCIÓN USANDO MAS