TECNOLOGÍA DE CONGELACIÓN DEL ESPERMA PORCINO (PURSEL ET AL., 1975; WESTENDORF ET AL., 1975)

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1 TECNOLOGÍA DE CONGELACIÓN DEL ESPERMA PORCINO (PURSEL ET AL., 1975; WESTENDORF ET AL., 1975) Selección Sl cuidadosa d de los verracos buenos congeladores ld y calidad d de las dosis seminales Recogida de la fracción rica sobre 100 cc de diluyente comercial (BTS, MR-A) y después se completa a dilución 1:2 con diluyente a 32 ºC Diluyentes para congelación sustancias energéticas (glucosa, fructosa, lactosa) crioprotector (glicerol) proteínas (yema de huevo o leche) Aditivos (detergente sintético Amino-Na-Lauryl Sulfato conocido como Orvus Es paste-oep) Presión osmótica: alrededor de 400 mosm/kg Periodo de equilibrado El espermatozoide de verraco precisa recubrirse de una capa proteica que actúe como agente crioprotector en el momento de la congelación, para lo cual es precisode3-4h(1ha22-23ºcy2ha15ºc) Centrifugación-Dilución Para proceder a la dilución es preciso eliminar total o parcialmente el plasma seminal. Para ello se centrifuga 10 minutos (3 min.) a 800 g (2.400 g) en centrífuga refrigerada a 15 ºC y después se elimina el sobrenadante La dilución se hace con diluyente a 15 ºC (se añade hasta 3 cc por dosis de lactosa-yema) y después se equilibra por 2 h a 5 ºC. A continuación se añade lactosa-yema + glicerol + OEP hasta 5 cc. 75 Congelación Ha de ser rápida, con el fin de pasar el punto crítico en el menor tiempo posible Para ello el semen a 5 ºC debe dejarse caer sobre nieve carbónica o incidir sobre el mismo vapores de nitrógeno líquido (a unos 5 cm sobre el nitrógeno líquido) para posteriormentealmacenarse t en nitrógeno líquido Presentación (envase) En pajuelas de 0,25-0, ml o en envases planos plásticos (pet-flat bags) congelados en vapores de nitrógeno líquido con capacidad de 2,5-5 ml. Las dosis utilizadas deben contener como mínimo x 10 9 espermatozoides (I.A. convencional) (disminuye el número de dosis por eyaculado) (1 x10 9 esper. en IA intrauterina profunda) El coste de estas dosis s es 3-4 veces el de la dosis s refrigerada Descongelación La Tª y el tiempo de descongelación es determinante para la viabilidad y capacidad de fecundación de los espermatozoides Ha de realizarse rápidamente, introduciéndose las dosis directamente desde el nitrógeno líquido al baño María a 42 ºC (50 ºC, 37 ºC) durante (12, 30) segundos y a continuación verter el contenido sobre ml (80, 30) de diluyente de refrigeración (mejor específico) (tipo ACROMAX, MR-A THAW, BTS) a 15 ºC (37 ºC) Hay que seguir rigurosamente las instrucciones indicadas por el fabricante de la 76 dosis

2 Técnica aplicada en el INIA (modificación de Wenstendorf et al, 1975) Obtención de la fracción espermática del eyaculado Dilución 1/3 con diluyente de refrigeración a 32ºC Equilibración durante 90 minutos a temperatura ambiente (20 22ºC) Equilibración a 15ºC durante 120 minutos Centrifugación a 800 x g durante 10 minutos en viales con 5 x 109 spz Eliminación del plasma seminal Dilución hasta 3,5 ml con Lactosa Yema (A) Equilibración durante 120 minutos para disminuir a 5ºC Dilución hasta 5 ml con Lactosa-Yema + glicerol + OEP (B) Congelación inmediata en pajuela de 6 ml en vapores de nitrógeno a una altura de 5 cm., durante 20 minutos Introducción en nitrógeno liquido Descongelación: Introducir las pajuelas en baño Maria a 42ºC durante 40 segundos Añadir la dosis de 5 ml a 45 ml de medio de conservación (dilución 1/10) Lactosa... 8,8 g. Agua destilada... hasta 80 ml Yema de huevo ml Composición de Lactosa Yema (A): Composición de Lactosa Yema + glicerol + OEP (B): Lactosa yema... 93,5 ml O.E.P... 1,5 ml Glicerol 5 ml 77 (1975) (agente regulador del ph) (1975) < 3 % de glicerol (agente detergente) Hasta el 50 % resultan dañados Píldoras (100 microlitros) pajuelas por eyaculado de 0,5 ml con una concentración de 1 x 10 9 espermatozoides (IA intrauterina profunda) Maxipajuelas (5 ml) o pajuelas de 0,5 ml (Gómez Rincón et al., 2008) 78

3 Semen refrigerado Semen Congelado Tasa Prolificidad fecundidad % % 9-10 (Bolarín et al., 2006) 79 Causas que originan esta disminución en los resultados reproductivos: - Cambios estructurales y funcionales de los espermatozoides - Viabilidad disminuida de los espermatozoides en el tracto genital de la hembra - Producción de espermatozoides con menor viabilidad Marcadores de congelabilidad (ver tabla) Posible utilización de los bancos de semen (Rubalcaba et al., 2003): - Contingencia por motivos sanitarios - Transporte de material genético a larga distancia - Trabajos de recuperación de razas en extinción - Baja temporal de los machos por problemas diversos (Conde et al., 2003) 80

4 - Marcadores moleculares de congelabilidad: algunos transportadores de membrana (GLU-3) o de proteínas (HSP90), algunos enzimas (SOD) - Marcadores no moleculares: LIN y STR Bonet et al., 2009) 81 TÉCNICAS DE APLICACIÓN DEL SEMEN DETECCIÓN DE CELOS: Signos de celo (Palomo Yagüe, 1999) 82 Precelo: la cerda está muy nerviosa y prueba a montar a sus congéneres cuando la cerda es montada, no presenta el reflejo de inmovilidad la vulva está edematizada-hinchada las mucosas vulvares están rojas y con una ligera mucosidad pastosa dura de 2-5 días (menos en nulíparas y primerizas) Celo verdadero, la cerda se deja montar por el verraco: Primer período de verraco (PV1): la vulva está todavía roja, pero menos hinchada y con moco opaco la cerda permanece inmóvil cuando se le comprime los flancos; no siendo así cuando se la oprime el lomo (espalda) la cerda permanece más tranquila y se deja montar por las compañeras y por el verraco duración de 8-10 h. Período del investigador (PI): es el período crítico para llevar a cabo la inseminación (en los primeros ¾ partes de esta fase) la vulva está rosa y no hinchada, sino arrugada, la mucosidad es menos opaca, más acuosa y casi transparente la cerda presenta el reflejo de inmovilidad tanto para el verraco como para las manipulaciones realizadas por el responsable en este período, la cerda realiza generalmente un movimiento de orejas a veces muy claro, presentando los ojos saltones la duración de la fase PI está entre h. Segundo período de verraco (PV2): la cerda no presenta más el reflejo de inmovilidad a las manipulaciones del investigador, pero sí aun para el verraco la vulva puede permanecer todavía roja las tasas de fertilidad cuando se insemina en este período son muy bajas. Postcelo: no hay reflejo de inmovilidad para el investigador ni para el verraco los signos exteriores de celo son dispares, presentándose a veces una ligera hinchazón de la vulva que por el contrario no está roja en esta fase no existe ninguna posibilidad de fecundación.

5 Detección de celo en la práctica: -actitud inquieta i (nerviosismo) i - vulva hinchada y enrojecida - emisión de gruñidos característicos - permite ser montada y monta sobre otras hembras - búsqueda del macho - se suele utilizar un verraco adulto recela o estímulos simuladores del verraco (aerosoles con feromonas) - posición rígida (lordosis) con las orejas erectas y cola levantada cuando se las monta (reflejo de inmovilidad). (Gordon, 1999) 83 Introducir el macho en grupos de hembras reducidas Cerdas alojadas en celdas individuales y acceso amplio por la parte trasera que permita verificar la inmovilidad e inseminar Pasillo en la parte delantera para que el verraco de recela pueda circular (Quiles y Hevia, 2008) (Mozo Martín, 2009) - Conducir a las hembras dudosas o con problemas al corral del macho (incrementa su estimulación) - Iluminación en las salas destinadas a recela: 16 h luz (350 lux) / 8 h oscuridad 84