ASPECTOS GENERALES DE LA EVALUACIÓN HEMATOLÓGICA EN FAUNA SILVESTRE Y NO CONVENCIONAL

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1 MEM. CONF. INTERNA MED. APROVECH. FAUNA SILV. EXÓT. CONV. 2013, 9: 1 ASPECTOS GENERALES DE LA EVALUACIÓN HEMATOLÓGICA EN FAUNA SILVESTRE Y NO CONVENCIONAL Copete-Sierra M* * BLC, MSc (c). Analista Clínica Veterinaria Centro Especializado de Diagnóstico Veterinario CESDIVET Ltda. Correo electrónico: mcbact@gmail.com Resumen El uso de la evaluación hematológica en animales silvestres y no convencionales es fundamental para la evaluación general del estado de salud de estas poblaciones. La estandarización de los procedimientos de laboratorio, el conocimiento y la experiencia del analista en la identificación de las diferencias morfológicas, son fundamentales para obtener resultados confiables que proporcionan la mayor utilidad clínica. El objetivo de este documento es recopilar información básica para la realización adecuada de la evaluación hematológica en animales silvestres y no convencionales, así como los aspectos generales para su interpretación. Palabras clave: evaluación hematológica, diferencias morfológicas, mamíferos, aves, reptiles. Introducción La Hematología es la rama de la medicina, tanto humana como veterinaria, que estudia los elementos formes de la sangre, los precursores en médula ósea y los analitos químicos plasmáticos relacionados, abarcando un análisis estructural, funcional y la determinación de concentraciones de estos elementos. Dentro de las pruebas hematológicas disponibles el hemograma es la más solicitada, ya que permite tener una visión global de la homeostasis del sistema hematopoyético y obtener excelentes indicadores de varios aspectos del estado de salud de un animal. La evaluación hematológica, hemograma, cuadro hemático, biometría hemática o hemoleucograma, en realidad no se trata de una prueba individual sino de un conjunto de análisis cuantitativos y cualitativos, en el cual la utilidad clínica es directamente proporcional a la calidad del material obtenido, la calidad analítica y el número de parámetros determinados. [10, 16] Página 17

2 COPETE-SIERRA M Pese a que en las últimas décadas se han estandarizado procedimientos para desarrollar estas pruebas en especies silvestres y no convencionales, aún se presentan algunas limitaciones para su desarrollo. La primera de ellas es la variación morfológica de las células sanguíneas que existe en condiciones normales, entre la gran cantidad de especies a evaluar. Si el analista encargado no cuenta con los conocimientos y la experiencia suficiente en el área, difícilmente podrá detectar los cambios celulares producidos por alteraciones como el estrés, así como los que se hacen evidentes en los diferentes procesos de enfermedad. En aves y reptiles, específicamente, se pueden presentar confusiones entre tipos celulares como linfocitos y trombocitos o entre heterófilos y eosinófilos. [15, 18] Cuando la hematología es remitida a laboratorios externos, es imprescindible verificar la capacidad del analista para trabajar este tipo de animales. Estas diferencias morfológicas constituyen un obstáculo para la disponibilidad de recursos técnicos. Actualmente los avances tecnológicos han hecho posible adaptar analizadores automatizados para hematología veterinaria similares a los de uso en humanos, capaces de crear resultados más precisos tanto desde un punto de vista cualitativo como cuantitativo. Sin embargo, este tipo de tecnología es aplicable a animales convencionales y a muy pocas especies de mamíferos no domésticos, ya que sigue siendo necesaria la revisión manual del extendido para recuentos diferenciales y observación de inclusiones y parásitos sanguíneos. En el caso de las aves, reptiles, peces y anfibios es más complicado, debido a que sus eritrocitos son células nucleadas y esto dificulta el conteo con métodos automatizados y su posterior interpretación. [2] En cuanto a interpretación de resultados hematológicos, si bien existe el Sistema de Información Internacional de Especies (ISIS), los valores de referencia siguen siendo una limitante, ya que los rangos establecidos en esta base de datos son muy amplios y no todas las especies están incluidas. El presente artículo pretende proporcionar información básica para la realización adecuada de la evaluación hematológica en animales silvestres y no convencionales, haciendo énfasis en los parámetros que hacen parte del hemograma manual y las características morfológicas de las células sanguíneas, teniendo en cuenta que constituyen la mayor limitación que pueden presentarse en la práctica hematológica para estas especies. Recolección, almacenamiento y preparación de muestras El procedimiento de toma de muestra es el principal factor determinante durante la fase preanalítica. El proceso de extracción de sangre puede ser innecesariamente estresante para un animal, sencillamente por el trato, el tipo de anestesia o la incomodidad que se asocia a una determinada técnica. 18 Asociación de Veterinarios de Vida Silvestre (VVS) ISSN

3 EVALUACIÓN HEMATOLÓGICA EN FAUNA SILVESTRE Y NO CONVENCIONAL [21] Las recomendaciones generales para una correcta extracción de sangre son las mismas para todas las especies. Toda muestra debe acompañarse de una solicitud que indique el análisis requerido, la información básica del animal y una corta anamnesis (cuando se trata de hematología para diagnóstico). Sitios de punción Se debe escoger el sitio de punción más adecuado de acuerdo con la especie y el tamaño del animal (tabla 1). Puede usarse el sistema tradicional con jeringa o el sistema al vacío tipo Vacutainer (figura 1). Se debe tener en cuenta que el calibre de la aguja debe asegurar una extracción de sangre rápida sin colapsar la vena, dentro de la limitación de evitar hematomas; el calibre deberá ser justo menor que el diámetro de la vena. [21] Figura 1. Toma de muestra en un puma (Puma concolor) con sistema tradicional de jeringa, en la vena femoral. Fotografía: Santiago Lozada- Cardona. La cardiocentesis no es recomendada como proceso rutinario de extracción sanguínea en ninguna especie, ya que presenta un riesgo elevado de muerte para el animal. [7, 8] Subdirección Técnico Científica 19

4 COPETE-SIERRA M Tabla 1. Sitios de punción para extracción de muestras sanguíneas en mamíferos, aves y reptiles Grupo Mamíferos Aves Sitios de Punción Venosa Safena, poplítea, femoral, humeral, basílica, braquial, cefálica, yugular Basílica (ulnar, radial o braquial), metatarsiana medial, yugular Reptiles Cervical dorsal (supravertebral), coccígea dorsal, caudal, subcarapacial (subvertebral) *, ulnar (radio-humeral), yugular ** Convenciones: *, Exclusiva en quelonios [8]; **, Minimiza los cambios que se producen con frecuencia por contaminación linfática de la sangre durante la extracción, debido a que en reptiles los vasos linfáticos acompañan a los sanguíneos [8, 28] Recolección y almacenamiento Existen tubos para recolección de sangre con fines hematológicos, comercialmente disponibles, en diferentes tamaños y presentaciones. Generalmente se usan los tubos de tapa lila los cuales contienen Ácido Etilendiamino Tetracético (EDTA) líquido o liofilizado, compuesto anticoagulante de elección en hematología; el EDTA es el que mejor conserva las características morfológicas y permite la tinción adecuada de los leucocitos. [32] Sin embargo, en algunos casos la sangre debe recolectarse en tubos con heparina, material que se encuentra disponible comercialmente (tabla 2). [20, 40] Los tubos con heparina se encuentran disponibles en diferentes tamaños y se identifican con la tapa de color verde. Los tubos con anticoagulante también pueden ser preparados en el laboratorio. En reptiles se prefiere la recolección con heparina ya que en algunas especies, sobre todo en quelonios, el EDTA produce hemólisis. Algunas especies aviares presentan una anticoagulación incompleta y hemólisis parcial cuando se mezclan con EDTA. En estos casos también se utiliza heparina como anticoagulante. [7] La relación anticoagulante/sangre debe ser la correcta para evitar fenómenos de dilución y/o distorsión celular por exceso. Durante el proceso de extracción sanguínea se debe evitar el exceso de succión para no provocar hemólisis; es necesario usar la jeringa y la aguja adecuadas al calibre de la vía utilizada. Una vez extraída la sangre, se mezcla por inversión suavemente. Es ideal realizar el frotis sanguíneo inmediatamente, ya que el contacto prolongado de la sangre con el anticoagulante induce distorsiones celulares e incluso hemólisis; no se deben hacer recuentos celulares en sangre con más de 4 días de almacenamiento. Si la muestra no se va a procesar durante la primera hora 20 Asociación de Veterinarios de Vida Silvestre (VVS) ISSN

5 EVALUACIÓN HEMATOLÓGICA EN FAUNA SILVESTRE Y NO CONVENCIONAL posterior a la toma, debe refrigerarse de 2 8 C; jamás debe congelarse pues esto causa hemólisis. [40] Tabla 2. Anticoagulantes de uso frecuente en hematología de animales silvestres y no convencionales Anticoagulante Mecanismo de acción Ventajas Desventajas Usos Heparina (litio, sodio) Antitrombínico Reversible, no tóxico Alteración morfología lecucocitaria y agregación; fondo azul en la coloración de frotis; artefactos en eritrocitos; costoso. Irreversible; en altas concentraciones contrae los eritrocitos. Aves (cuando la muestra va usarse para bioquímica) y reptiles. Ácido Etilendiamino Tetracético: Na2EDTA, K2EDTA y K3EDTA Quelante de calcio Proporciona la mejor preservación Mamíferos, aves y algunos reptiles. Parámetros de la evaluación hematológica La composición del hemograma varía desde unos pocos parámetros como la hemoglobina, el hematocrito y los recuentos total y diferencial de leucocitos, obtenidos mediante técnicas manuales, hasta más de 30 parámetros obtenidos determinados por autoanalizadores de hematología, agrupados tradicionalmente en el eritrograma, el leucograma y el trombograma. [10, 11] Adicional a estos tres grupos, en hematología veterinaria se realiza la determinación de proteínas plasmáticas. Eritrograma. Comprende el análisis de todos los parámetros relacionados con los eritrocitos en circulación. En los hemogramas simples consta del recuento eritrocitario, hematocrito, hemoglobina e índices eritrocitarios. En los cuadros hemáticos más completos y, necesariamente, automatizados se incorporan parámetros como el ancho de distribución eritrocitaria y el recuento de reticulocitos. [10,40] Para el estudio de la morfología celular y la detección de hemoparásitos, es necesaria la observación del extendido de sangre periférica. El eritrograma brinda información para detectar y caracterizar anemias, así como para evaluar la presencia de agentes Subdirección Técnico Científica 21

6 COPETE-SIERRA M patógenos relacionados de manera directa o indirecta con la cantidad de células y cambios morfológicos. [19, 46] Recuento eritrocitario Determina el número total de eritrocitos o hematíes que se encuentran en un volumen de sangre periférica expresado en células por milímetro cúbico (mm3), por microlitro (µl) o por litro (L). [10] El sistema de unidades en que se reporta el resultado puede variar en cada laboratorio, pero la interpretación del parámetro sigue siendo la misma y va acorde con los valores de referencia. Para el recuento pueden usarse métodos manuales o automatizados. El recuento manual consiste en preparar una dilución de la sangre en solución salina en el caso de mamíferos, o en solución de Natt y Herrick para aves, reptiles, peces y anfibios. [31] Esta dilución se pone en un hemacitómetro o cámara de Neubauer para realizar el conteo. [40] Este método requiere de mucho tiempo y habilidad visual, desventajas para ser usado de rutina en el laboratorio. Además, su alto coeficiente de variación le resta confiabilidad a los parámetros que a partir de él se calculan. [10] El conteo automatizado tradicional se basa en el principio de impedancia eléctrica. [4] Los analizadores más recientes usan centrifugación asociada a colorantes y anticuerpos monoclonales, y citometría de flujo por equipos láser. Estas tecnologías son poco aplicables a muestras de animales silvestres y no convencionales. El conteo de eritrocitos es necesario para calcular el volumen corpuscular medio (VCM) en los hemogramas realizados por métodos manuales. Este recuento en sangre periférica es menor en los reptiles que en los mamíferos y aves. [5] Hematocrito Es la relación del volumen de eritrocitos con el de sangre total, es decir, es el valor de sangre que se compone realmente de eritrocitos. Se expresa como un porcentaje o, preferiblemente, una fracción decimal. El hematocrito se puede medir directamente por centrifugación con un micrométodo o, de forma indirecta como lo hacen los analizadores automatizados, calculando el producto del volumen corpuscular medio (VCM) multiplicado por el recuento de eritrocitos. [10, 40] Hemoglobina La hemoglobina (Hb), componente principal de los eritrocitos, es una proteína conjugada especializada que sirve de vehículo para el transporte de oxígeno 22 Asociación de Veterinarios de Vida Silvestre (VVS) ISSN

7 EVALUACIÓN HEMATOLÓGICA EN FAUNA SILVESTRE Y NO CONVENCIONAL y de CO 2. [44] La determinación de hemoglobina, ya sea manual o automatizada, consiste en medir la cantidad de esta proteína por unidad de volumen expresada en g/dl. Este parámetro es de gran utilidad clínica, ya que define los conceptos de anemia y policitemia. [10] El método manual empleado es el de la cianometahemoglobina, compuesto que se forma al disolver un volumen de sangre en el reactivo o solución de Drabkin. Es una técnica sencilla y su principio de reacción consiste en la oxidación de la hemoglobina a metahemoglobina por parte de ferricianuro potásico, para formar cianometahemoglobina, compuesto que tiene una absorción máxima a una longitud de 540 nm. La sangre debe diluirse en el reactivo de Drabkin y en el caso de animales con eritrocitos nucleados, la dilución debe someterse a centrifugación para lisar las membranas eritrocitarias. Los núcleos libres de los eritrocitos lisados deben ser removidos antes de realizar la lectura de la absorbancia, para evitar una sobrestimación de la concentración de hemoglobina. [42, 43] El método de la cianometahemoglobina también es utilizado de forma más refinada por algunos analizadores automatizados. [30] Sin embargo, teniendo en cuenta la toxicidad del cianuro y su impacto en el medio ambiente y la salud ocupacional, en analizadores más recientes se ha reemplazado la solución de cianuro por lauril sulfato sódico, una sustancia atóxica. La hemoglobina de la sangre diluida en este lisante es transformada en lauril sulfato de sodio-metahemoglobina (metahemoglobina sódica de lauril sulfato). Este compuesto tiene un pico de máxima absorción a 555 nm, lectura que realiza el autoanalizador. [23] Otro de los métodos automatizados descritos para la determinación de la concentración de hemoglobina se basa en la medición de la cantidad de luz láser dispersada, técnica descrita en 1986 y aplicada en la actualidad en hematología automatizada. [30] Índices eritrocitarios Las determinaciones del eritrograma descritas hasta ahora, se conocen como índices eritrocitarios básicos o primarios. Aquellos que derivan de estos se les conoce como parámetros derivados o secundarios. [10, 40] Estos parámetros son la base para la clasificación de las anemias y pueden ser calculados o determinados por analizadores automatizados. A continuación se describen los índices eritrocitarios secundarios que hacen pueden componer el eritrograma manual y el automatizado: Volumen corpuscular medio (VCM). Ofrece información sobre el tamaño promedio de los eritrocitos, expresado en fentolitros (fl) como unidad de volumen. A partir del VCM se define el tamaño de los eritrocitos como normocitosis (normales), microcitosis (pequeño) y macrocitosis (grandes), Subdirección Técnico Científica 23

8 COPETE-SIERRA M característica fundamental para la clasificación de las anemias. [33] Su cálculo manual se obtiene de la relación del hematocrito y del recuento eritrocitario, aplicando la siguiente fórmula: VCM (fl) = (hematocrito/recuento de eritrocitos en millones por µl) x 10 Se debe tener en cuenta que El VCM calculado no tiene la misma confiabilidad del obtenido por analizadores automatizados, ya que depende del recuento de eritrocitos que por métodos manuales tiene un coeficiente de variación muy alto (>5%). [4] Hemoglobina corpuscular media (HCM). Es el valor promedio de la hemoglobina contenida en cada eritrocito, expresada en picogramos (pg). Se calcula a partir del valor de hemoglobina y del recuento de eritrocitos mediante la siguiente fórmula: HCM (pg) = (Hb en g/dl/recuento de eritrocitos en millones por µl) x 10 La HCM es considerada como redundante a otros parámetros y de poca utilidad si es calculada manualmente. [10, 40] Concentración de hemoglobina corpuscular media (CHCM). Provee un índice de la cantidad de hemoglobina en relación al hematocrito, expresada en g/dl. La fórmula para su cálculo es la siguiente: CHCM (g/dl) = (hemoglobina en g/dl/ hematocrito %) x 100 La CHCM define los conceptos de hipocromía, normocromía e hipercromía (concepto hipotético), necesarios para la clasificación de las anemias. [10] Morfología eritrocitaria Un perfil hematológico siempre debe incluir el examen de un frotis sanguíneo para determinar, si existen o no, cambios morfológicos en los eritrocitos y demás células sanguíneas. Esta evaluación se realiza mediante un extendido de sangre en lámina teñido con coloración de Wright u otra tipo Romanowsky como son Wright-Giemsa, May Grünwald-Giemsa o Diff-Quick. [19] La relevancia de la información derivada es proporcional al conocimiento y experiencia del analista. 24 Asociación de Veterinarios de Vida Silvestre (VVS) ISSN

9 EVALUACIÓN HEMATOLÓGICA EN FAUNA SILVESTRE Y NO CONVENCIONAL Los eritrocitos normales de todos los vertebrados, a excepción de los mamíferos diferentes a los Camelidae, son nucleados y ovales sin palidez central (Figura 2). La variación en el tamaño también es evidente; por regla general, los eritrocitos aviares son de mayor tamaño que los de los mamíferos, y los de los reptiles son más grandes que los de las aves. A pesar de las diferencias en tamaño, la similitud entre los eritrocitos de reptiles y aves es notoria, corroborando la hipótesis de un ancestro común. [45] Los glóbulos rojos más grandes son los de los anfibios. [19] Figura 2. Eritrocitos normales en diferentes especies. Izq. Mamífero (Saguinus leucopus): discos bicóncavos, con palidez central evidente, anucleados. Centro. Ave (Ara macao): contorno y núcleo elípticos. Der. Reptil (Iguana iguana): contorno y núcleo elípticos, más redondeados que en las aves. (1000X, coloración de Wright). Fotografías: Copete-Sierra M. Alteraciones del color Policromasia o policromatofilia. Las células policromatófilas son eritrocitos que han sido liberados tempranamente a la circulación. Generalmente son más grandes que los eritrocitos maduros y su coloración es azul violáceo, en frotis teñidos con coloraciones tipo Romanowsky, permitiendo determinar un grado cualitativo. Bajo la coloración supravital con azul de metileno, se observan de un tono azul claro con material reticular punteado o formando agregados y son llamados reticulocitos, células que pueden ser cuantificadas. Esta tonalidad es el resultado de organelas como ribosomas y mitocondrias, que permanecen en las células inmaduras. La presencia o ausencia de este tipo de células indica una eritropoyesis activa, importante en la caracterización de las anemias. [7, 8, 9, 40] Subdirección Técnico Científica 25

10 COPETE-SIERRA M La policromasia debe ser interpretada con cautela de acuerdo con la especie a evaluar. En los frotis sanguíneos de pequeños mamíferos es normal encontrar un número moderado de eritrocitos policromatófilos, ya que estos animales responden rápida y drásticamente a la pérdida de glóbulos rojos (figura 3). Por el contrario, en el caso de grandes mamíferos es raro encontrar, en condiciones normales, células policromatófilas en un extendido. [19] Figura 3. Eritrocitos policromatófilos de un tití gris (Saguinus leucopus), que se diferencian del resto de eritrocitos por su tinción azul-violácea y un tamaño ligeramente mayor. (1000X, coloración de Wright). Fotografía: Copete-Sierra M En aves los eritrocitos policromatófilos son similares a los eritrocitos maduros, pero aparecen con un citoplasma débilmente basofílico y un núcleo redondeado menos condensado (figura 4). Con coloración supravital se observan agregados de material reticular rodeando el núcleo. [7] La respuesta regenerativa eritrocitaria en los reptiles parece ser más lenta que la observada en los mamíferos. Los eritrocitos policromatófilos en estas especies, al igual que en las aves, presentan un patrón de cromatina nuclear menos denso pero su citoplasma es más basofílico que el de los eritrocitos maduros y, generalmente, son de menor tamaño (figura 5). [8] En los reptiles con policromatofilia, existe una menor CCMH y un VCM disminuido. [28] 26 Asociación de Veterinarios de Vida Silvestre (VVS) ISSN

11 EVALUACIÓN HEMATOLÓGICA EN FAUNA SILVESTRE Y NO CONVENCIONAL Figura 4. Eritrocitos policromátofilos de una guacamaya bandera (Ara macao). Se puede observar las diferencias en la coloración del citoplasma y la densidad de la cromatina (1000X, coloración de Wright). Fotografía: Copete-Sierra M. Figura 5. Eritrocitos policromatófilos de una tortuga carey (Eretmochelys imbricata). Se observa intensa basofilia citoplasmática y menor condensación del núcleo (1000X, coloración de Wright). Fotografía: Copete-Sierra M. Subdirección Técnico Científica 27

12 COPETE-SIERRA M Hipocromía. La hipocromía se produce por una disminución en el contenido de hemoglobina en los eritrocitos. En la mayoría de mamíferos, los eritrocitos hipocrómicos aparecen con una palidez central aumentada (figura 6). [41] En aves, la hipocromía se evidencia en eritrocitos con una palidez citoplasmática, que equivale a un área mayor al 50% del total. [7] Figura 6. Eritrocitos hipocrómicos de un mono churuco (Lagothrix lagotricha). La palidez central de estas células es más notoria que la de los eritrocitos normocrómicos. En la imagen puede apreciarse un neutrófilo (sup der) (1000X, coloración de Wright). Fotografía: Copete-Sierra M. Alteraciones de tamaño La variación en el tamaño eritrocitario se conoce como anisocitosis. En la mayoría de mamíferos esta alteración puede discriminarse en macrocitosis (aumento de tamaño) y microcitosis (disminución de tamaño). En aves y reptiles suele describirse de forma general y es normal encontrar una ligera variación en el tamaño eritrocitario (1+). Un grado mayor de anisocitosis asociado con policromatofilia es observado en aves con anemia regenerativa. [7] Alteraciones de la forma Poiquilocitosis es el término que se emplea para generalizar las variaciones en la forma de los eritrocitos. Aunque en aves y reptiles se describe de 28 Asociación de Veterinarios de Vida Silvestre (VVS) ISSN

13 EVALUACIÓN HEMATOLÓGICA EN FAUNA SILVESTRE Y NO CONVENCIONAL manera general por cruces, en mamíferos este término no es posible de interpretar ya que son varios los cambios descritos en la forma eritrocitaria. [41] Algunas de las alteraciones morfológicas eritrocitarias evidentes en el frotis sanguíneo de algunos mamíferos, son reversibles. Generalmente estos cambios están asociados a la presencia de variantes de hemoglobina que se polimerizan tras la manipulación de las muestras, produciendo un fenómeno in vitro. La forma de hoz observada en los eritrocitos de venados, antílopes y pequeños carnívoros, es la alteración reversible más notoria. El cambio en éstos animales es el resultado de la polimerización de hemoglobinas variantes de la hemoglobina del adulto, al someter la sangre a oxigenación. [19] El significado de las alteraciones en el color, tamaño y forma de los eritrocitos puede variar entre mamíferos, aves y reptiles (Tabla 3). Inclusiones Cuerpos de Howell-Jolly. Son remanentes nucleares y se observan como gránulos densos y de color azul rojizo o violeta, localizados excéntricamente (figura 7). Es un hallazgo habitual en felinos, roedores, pequeños primates y algunos marsupiales sanos. [19] Una cantidad incrementada de estas inclusiones se asocia con anemia regenerativa e hipoesplenismo. [41] Figura 7. Cuerpo de Howell-Jolly en un eritrocito de tití gris (S. leucopus). (1000X, coloración de Wright). Fotografía: Copete-Sierra M. Subdirección Técnico Científica 29

14 COPETE-SIERRA M Tabla 3. Significado de algunos cambios morfológicos eritrocitarios en mamíferos, aves y reptiles Observación Indicación Mamíferos Hipocromía Anemia, deficiencia mineral (hierro) Significativa Aves y reptiles Significativa Poiquilocitosis Alteración metabólica, eritropoyesis incrementada Significativa Significativa Anisocitosis Alteración metabólica, eritropoyesis incrementada Significativa si la hemoglobina no tiende a la polimerización Significativa Codocitos o dianocitos Enfermedad hepática, anemia hipocrómica Significativa No descrita Estomatocitos Enfermedad hepática, anemia hemolítica Significativa No descrita Esferocitos Anemia hemolítica Significativa No descrita Esquistocitos Coagulación intravascular diseminada (CID), sepsis Significativa No descrita Cuerpos de Howell-Jolly Hipoesplenismo, división nuclear anómala Significativa en algunas especies Probablemente significativa Punteado basófilo Deficiencia de hierro, intoxicación por plomo Significativa en adultos Significativa Cuerpos de Heinz Exposición a oxidantes, hemoglobina inestable, defectos enzimáticos, hipoesplenismo Significativa en algunas especies Significativa (rara vez descritos) Tomado y adaptado de: Hawkey C M y Dennet T B. Atlas de Hematología Veterinaria Comparada. Grass Ed. España, p. 15, Cuerpos de Heinz. Son el resultado de la desnaturalización oxidativa de la hemoglobina. Aparecen como estructuras pequeñas, pálidas y excéntricas 30 Asociación de Veterinarios de Vida Silvestre (VVS) ISSN

15 EVALUACIÓN HEMATOLÓGICA EN FAUNA SILVESTRE Y NO CONVENCIONAL dentro del eritrocito. Están asociados a alimentos como la cebolla y el ajo, y a fármacos como el acetaminofén. La presencia de cuerpos de Heinz reduce la deformabilidad de la célula roja aumentado su susceptibilidad a hemólisis intra y extravascular. [41] Estas inclusiones han sido descritas en aves que han ingerido petróleo. [19] Punteado basófilo. Aparece como gránulos pequeños, irregulares de tinción basofílica, en el citoplasma eritrocitario, y está asociado con cambios degenerativos del rrna. En mamíferos y aves, estos cambios son indicativos de la respuesta a anemia o, rara vez, indican una intoxicación. En reptiles es común que aparezca punteado basófilo en los reticulocitos (figura 8). [8, 45] Figura 8. Punteado basófilo en eritrocito de una tortuga carey juvenil (E. imbricata). La célula punteada puede observarse en el centro de la imagen (1000X, coloración de Wright). Fotografía: Copete-Sierra M. Hemoparásitos. Especies de diferentes géneros se encuentran parasitando las células sanguíneas de mamíferos, aves y reptiles. Algunos de estos organismos tienen una baja o nula patogenicidad en especies silvestres y no convencionales. [15, 41] En primates, por ejemplo, es común encontrar microfilarias y trypomastigotes de Trypanosoma spp, sin enfermedad asociada (figuras 9 y 10). De la Hortúa et al (2007), determinaron la prevalencia de microfilarias en primates de zoológicos colombianos, la cual fue de 6,39%, encontrando la mayoría de Subdirección Técnico Científica 31

16 COPETE-SIERRA M parásitos en machos adultos de Saguinus leucopus, sin signos de enfermedad considerando a esta especie como reservorios y/o portadores. [13] Otros hemoparásitos observados en primates y otros mamíferos pertenecen a los géneros Plasmodium, Babesia, Hepatozoon, Theileria y Anaplasma. [41] En frotis sanguíneos de aves es común encontrar parásitos de los géneros Hemoproteus, Leucocytozoon, y Plasmodium, así como algunas especies de filarias y tripanosomas. [8, 25] En reptiles pueden observarse con frecuencia Haemogregarina spp, Trypanosoma spp y Plasmodium spp. Parásitos del género Haemoproteus también han sido reportados en reptiles, describiéndolas como especies similares a las que parasitan aves. [27, 42] Figura 9. Tripomastigote de Trypanosoma sp en un tití gris (1000X, coloración de Wright). Fotografías: Copete-Sierra M (S. leucopus). Eritrocitos inmaduros En mamíferos los precursores eritrocitarios aparecen como células nucleadas. En aves y reptiles se observan con un núcleo de mayor tamaño que el de la célula madura y acúmulos irregulares de cromatina. Las características detalladas de los eritrocitos inmaduros se recopilan en la Tabla 4. [19] 32 Asociación de Veterinarios de Vida Silvestre (VVS) ISSN

17 EVALUACIÓN HEMATOLÓGICA EN FAUNA SILVESTRE Y NO CONVENCIONAL Figura 10. Microfilaria compatible con Mansonella (Dipetalonema) perstans en un tití gris (S. leucopus). Estos hemoparásitos son observados con frecuencia en pequeños primates (1000X, coloración de Wright). Fotografías: Copete-Sierra M. Tabla 4. Clasificación y descripción de los precursores mamíferos, aves y reptiles Precursor Mamíferos Aves y reptiles Rubriblasto Prorubricito Redondo, de gran tamaño, núcleo grande que opaca la mayor parte de la célula. Cromatina nuclear finamente granulada, nucléolos. Citoplasma fuertemente basofílico. Redondo, pequeño, con cromatina nuclear granulada, sin nucléolo. Citoplasma basofílico. eritroides de Redondo o ameboide de gran tamaño. Cromatinaa nuclear formando reticulación laxa con acúmulos. Nucleoloo grande. Citoplasma muy basofílico con espacios mitocondriales. Redondo, de menor tamaño, con acúmulos de cromatina nuclear. Nucleolo de menor tamaño, visible. Citoplasma basofílico. Rubricito Redondo de menor tamaño, con el núcleo más pequeño con relación al citoplasma; grupos irregulares de cromatina. Citoplasma gris o ligeramente eosinofílico. Redondo, pequeño. Núcleo relativamente pequeño con acúmulos de cromatina, ausencia de nucléolo. Citoplasma grisáceo o ligeramente eosinofílico. Subdirección Técnico Científica 33

18 COPETE-SIERRA M Precursor Mamíferos Aves y reptiles Metarubricito Policromatófilo Citoplasma eosinofílico o algo basofílico. Núcleo de tamaño reducido, uniformemente basofílico o pignótico. Redondo, anucleado, con citoplasma grisáceo o azulado. Suele ser más grande que el eritrocito maduro. Pequeño, redondeado o ligeramente oval. Núcleo redondeado o ligeramente ovalado y acúmulos irregulares de cromatina. Citoplasma grisáceo o rojo pálido. Citoplasma eosinofílico, núcleo de mayor tamaño que el de la célula madura, con acúmulos irregulares de cromatina. Con tinción supravital se observa una banda perinuclear formada por abundantes gránulos citoplasmáticos. Tomado y adaptado de: Hawkey C M y Dennet T B. Atlas de Hematología Veterinaria Comparada. Grass Ed. España, p , El eritrograma en respuesta a anemia La anemia es el trastorno más común de la línea roja y se define como la disminución en la masa eritrocitaria, lo cual resulta en una deficiencia del transporte de oxígeno. Las tres causas básicas de anemia en mamíferos, aves y reptiles son: disminución de la producción de eritrocitos (anemia hipoplásica), pérdida aguda o crónica (anemia hemorrágica) y destrucción (anemia hemolítica). [2, 39] Las anemias han sido clasificadas en tres esquemas generales descritos a continuación [39]: Tamaño eritrocitario (normocítica macrocítica o microcítica) y concentración de hemoglobina (normocrómica o hipocrómica). Respuesta de la médula ósea (regenerativa o no regenerativa Mecanismo fisiopatológico (agrupa las anemias de acuerdo al desorden subyacente) En mamíferos, aves y reptiles, la respuesta a anemias se evalúa con el eritrograma. Mamíferos La policromasia y la hipocromía son alteraciones eritrocitarias evidentes en frotis teñidos por sus patrones de coloración, de gran utilidad en la clasificación y monitoreo de anemias. La policromasia tiende a producirse en anemias por pérdida de sangre y anemias por destrucción eritrocitaria, 34 Asociación de Veterinarios de Vida Silvestre (VVS) ISSN

19 EVALUACIÓN HEMATOLÓGICA EN FAUNA SILVESTRE Y NO CONVENCIONAL mientras que en anemias por hipoplasia eritroide y anemia aplásica, no se hace evidente. [39, 41] La hipocromía es un signo indicativo de pérdida de hierro. En mamíferos adultos la deficiencia de hierro se debe generalmente a pérdidas crónicas de sangre causadas por neoplasias, alteraciones de la coagulación y trastornos del sistema gastrointestinal como úlceras y enfermedad inflamatoria intestinal. En mamíferos jóvenes esta deficiencia se produce por dieta inadecuada. [8] En anemias hemolíticas y anemias hemorrágicas por pérdida crónica es característico observar anisocitosis, policromasia, eritrocitos nucleados y cuerpos de Howell-Jolly, ya que son regenerativas. [9, 14] Las causas de anemia en mamíferos son similares a las descritas en aves y reptiles. [41] Aves La anemia es un hallazgo común en los hemogramas aviares. [38] En las aves, el desarrollo de la anemia por carencia de eritropoyesis parece ser más rápido que en los mamíferos debido, probablemente, a la vida media relativamente corta de sus eritrocitos, que puede variar de 28 a 45 días. [7] La policromasia puede usarse como un indicador de eritrogénesis. En aves anémicas con una respuesta regenerativa apropiada el grado de policromasia debe ser superior al 5% del total de eritrocitos (3+ y 4+). La presencia de células en mitosis, eritrocitos inmaduros binucleados y de otros precursores eritroides en el frotis sanguíneo, son evidencias de eritropoyesis activa (figura 11). [3, 7] Reptiles La respuesta regenerativa a anemia en reptiles es más lenta comparada con la de aves y mamíferos, y se evidencia con aumento de eritrocitos policromatófilos, presencia de eritrocitos inmaduros, anisocitosis (moderada a marcada), eritrocitos en mitosis y poiquilocitosis. Sin embargo, algunos de estos hallazgos pueden presentarse en reptiles posthibernación o asociados a estados de ayuno, malnutrición y enfermedad inflamatoria severa. [8, 28] La hipocromía está asociada a la deficiencia de hierro al igual que en mamíferos. [43] Leucograma. Consiste en el análisis cuantitativo y cualitativo de los parámetros relacionados con los glóbulos blancos o leucocitos en sangre periférica. Comprende los recuentos total y diferencial lecucocitarios y la evaluación morfológica de las células blancas en el frotis de sangre periférica. [10] Subdirección Técnico Científica 35

20 COPETE-SIERRA M Figura 11. Eritroblasto aviar en mitosis (Amazona amazónica). (1000X, coloración de Wright). Fotografía: Copete-Sierra M. Recuento total leucocitario El recuento total de leucocitos es de gran utilidad clínica ya que define los conceptos de leucopenia (disminución) y leucocitosis (aumento), alteraciones que pueden estar asociadas con una amplia variedad de enfermedades y estados fisiológicos. [10] Factores como el estrés y los cambios estacionales, en algunos reptiles, producen variaciones en el total de leucocitos aumentado los recuentos totales. [8, 28] Puede realizarse por métodos automatizados o técnicas manuales. Automatizado. Similar al recuento de eritrocitos en la mayoría de los autoanalizadores de hematología, aplicando los principios de impedancia eléctrica y la dispersión de luz láser. [10] Este tipo de analizadores son útiles sólo en un pequeño grupo de mamíferos y han sido de poca utilidad en aves y reptiles, ya que por sus eritrocitos y trombocitos nucleados, se presentan interferencias que dificultan la interpretación de los resultados obtenidos. [28] En estudios preliminares se ha indicado la posibilidad de obtener un recuento total leucocitario confiable en reptiles, empleando analizadores como el Cell Dyn 3500 (Abbott Diagnostics) asociado al programa informático para veterinaria. [38] Sin embargo, incluso empleando analizadores de alta complejidad, la variación que existe entre las diferentes especies de reptiles requiere la modificación de parámetros y estudios de validación para cada especie estudiada. [28] 36 Asociación de Veterinarios de Vida Silvestre (VVS) ISSN

21 EVALUACIÓN HEMATOLÓGICA EN FAUNA SILVESTRE Y NO CONVENCIONAL Manual. Para mamíferos la muestra debe diluirse en reactivo de Turk, que es una solución de ácido acético, compuesto que hemoliza los eritrocitos para permitir la observación de los leucocitos. [36] En el caso de animales con eritrocitos nucleados el solvente utilizado es la solución de Natt y Herrick, que permite contar eritrocitos y leucocitos en una misma dilución. [44, 45]. El recuento se realiza mediante hemacitómetro o cámara de Neubauer. Recuento diferencial leucocitario El recuento diferencial leucocitario corresponde a la concentración relativa y absoluta de las subpoblaciones de glóbulos blancos, en las que se dividen las poblaciones principales, en sangre periférica. [10] Al igual que el recuento total de leucocitos, puede realizarse de forma automatizada o manualmente, siendo esta última la más aplicable en animales silvestres y no convencionales. Las dos poblaciones principales en las que se dividen los leucocitos son los granulocitos o polimorfonucleares y los agranulocitos o mononucleares. Aunque las subpoblaciones leucocitarias presentan diferencias morfológicas y en terminología entre mamíferos, aves y reptiles (tabla 5), son similares en términos de funcionalidad. [19] Recuento automatizado. Realizado por autoanalizadores junto al recuento total. Bajo el principio de impedancia eléctrica el citoplasma celular es reducido sin ser destruido, dando como resultado una nueva célula de un tamaño proporcional al núcleo de la misma para poder ser contadas y medidas. El recuento diferencial arrojado consta de tres partes: granulocitos, linfocitos y monocitos. [10] Mediante luz láser el recuento diferencial de leucocitos se basa en el tamaño de las células por impedancia y en las características de éstas de acuerdo con ciertas propiedades químicas de las células, obteniendo un diferencial de cinco partes: neutrófilos, eosinófilos, basófilos, linfocitos y monocitos. [34] Las variaciones en tamaño, forma, granulación y patrones de tinción de los leucocitos en animales silvestres y no convencionales, dificulta la aplicación de este tipo de metodologías, limitándola a unas pocas especies de mamíferos como los felinos y primates. Recuento manual. La diferenciación manual de los leucocitos se basa en la observación microscópica de las variaciones morfológicas y las características de tinción de los constituyentes celulares, en el frotis sanguíneo. [19] Tradicionalmente se clasifican las subpoblaciones leucocitarias de un total de células contadas. Este método depende de la calidad del extendido de sangre, de la calidad de la coloración y, sobretodo, de la experiencia y habilidad del analista. Subdirección Técnico Científica 37

22 COPETE-SIERRA M Tabla 5. Clasificación de las subpoblaciones leucocitarias en mamíferos, aves y reptiles Población Mamíferos Aves Reptiles Granulocitos Neutrófilos Eosinófilos Basófilos Heterófilos Eosinófilos Basófilos Heterófilos Eosinófilos Basófilos Mononucleares Monocitos Linfocitos Monocitos Linfocitos Azurófilos Monocitos Linfocitos Evaluación morfológica Mamíferos Neutrófilos. En todas las especies de mamíferos los núcleos de los neutrófilos son polimórficos y la variación radica en el grado de lobulación. Existen diferencias en tamaño, forma y patrones de tinción. Los gránulos de los neutrófilos pueden ser basofílicos como en primates y algunos artiodáctilos, o fuertemente eosinofílicos como en algunos roedores (figura 12). [12, 41] Los neutrófilos son las células de mayor proporción dentro del recuento diferencial de mamíferos adultos. [14, 19] En el frotis sanguíneo de mamíferos pueden observarse neutrófilos inmaduros. Estas células se caracterizan por su gran tamaño, basofilia citoplasmática y disminución o ausencia de lobulación nuclear. [19] Un incremento en la cantidad de neutrófilos inmaduros se conoce como desviación a la izquierda, alteración en la que generalmente se observan bandas, pero también pueden aparecer metamielocitos y mielocitos (figura 13). La toxicidad en neutrófilos se refiere a los cambios morfológicos que se observan en el citoplasma como resultado de una liberación temprana de estas células, desde la médula ósea, a la circulación. [9] Los cambios tóxicos evidentes consisten en granulaciones y vacuolización citoplasmáticas, e inclusiones azul-grisáceas llamadas cuerpos de Döhle. 38 Asociación de Veterinarios de Vida Silvestre (VVS) ISSN

23 EVALUACIÓN HEMATOLÓGICA EN FAUNA SILVESTRE Y NO CONVENCIONAL Figura 12. Izq. Neutrófilo típico con gránulos basofílicos, de un primate (Cebus capucinus). Der. Neutrófilo de roedor característico en el cual puede apreciarse la diferencia en la coloración de la granulación de tipo eosinofílico (Hydrochaeris hydrochaeris). (1000X, coloración de Wright) ). Fotografías: Copete-Sierra M. Figura 13. Banda neutrófila en un zorro cañero (Cerdocyon thous). Claramente se observa la ausencia de lobulación nuclear. (1000X, coloración de Wright). Fotografía: Copete-Sierra M. La desviación a la izquierda y los cambios tóxicos son indicios de hiperplasia mieloide asociados a malignidad, infecciones y otras enfermedades inflamatorias. [19] Eosinófilos. Generalmente aparecen en un pequeño porcentaje de la población leucocitaria de los mamíferos. Estas células contienen grandes gránulos citoplasmáticos eosinofílicos (figura 14) que permiten diferenciarlos claramente de los neutrófilos, con algunas excepciones. En el caso de Subdirección Técnico Científica 39

24 COPETE-SIERRA M conejos y roedores los neutrófilos tienen características pseudoeosinofílicas, lo cual dificulta la identificación de sus eosinófilos. [9, 12, 19, 41] La diferenciación en estas especies se basa en la forma del núcleo y las características de sus gránulos: el núcleo varía de bilobulado a una forma de U, y los gránulos son de mayor tamaño y se tiñen con menor intensidad que los de los neutrófilos. [9] Figura 14. Eosinófilos característicos de algunos mamíferos. Izq. Lemur (Varecia variegata). Der. Mono capuchino (Cebus apella). (1000X, coloración de Wright). Fotografías: Copete-Sierra M. Un aumento en la cantidad de eosinófilos (eosinofilia) es considerado una respuesta inespecífica que podría estar asociada a infestaciones por helmintos, reacciones de hipersensibilidad e inflamación de tejidos con un alto contenido de mastocitos. [41] Basófilos. Son las células de menor proporción dentro del recuento diferencial de mamíferos. Generalmente tienen el núcleo lobulado y contienen gránulos citoplasmáticos fuertemente basofílicos (figura 15). [9] Al igual que la eosinofilia, la basofilia está asociada a reacciones de hipersensibilidad. Linfocitos. Los linfocitos típicos son redondos, con núcleo redondo en posición central o ligeramente excéntrico con un grado variable de condensación de cromatina. El citoplasma aparece de color azul claro u oscuro y, en algunas especies, contiene gránulos azurófilos o basofílicos (figura 16). Los linfocitos inmaduros pueden distinguirse de las células maduras por su mayor tamaño, intensidad en la basofilia del citoplasma y presencia de nucléolos. En animales juveniles de algunas especies, los linfocitos pueden ser la subpoblación predominante dentro del recuento diferencial leucocitario. [19] 40 Asociación de Veterinarios de Vida Silvestre (VVS) ISSN

25 EVALUACIÓN HEMATOLÓGICA EN FAUNA SILVESTRE Y NO CONVENCIONAL Figura 15. Basofilo de un tití gris (S. leucopus). En esta célula puede apreciarse la fuerte granulación basofílica que, en ocasiones, esconde al núcleo. (1000X, coloración de Wright). Fotografía: Copete-Sierra M. Figura 16. Linfocitos de un mono ardilla (Saimiri sciureus). (1000X, coloración de Wright). Fotografía: Copete-Sierra M. En algunos roedores los linfocitos de gran tamaño presentan una inclusión citoplasmática conocida como cuerpo de Kurloff. Estas estructuras suelen Subdirección Técnico Científica 41

26 COPETE-SIERRA M observarse en machos, por lo que se sugiere una asociación con las hormonas sexuales. [41] Los linfocitos reactivos pueden aparecer como células con un núcleo menos denso mayor cantidad de citoplasma, que los linfocitos maduros. La linfocitosis y presencia de linfocitos reactivos, sugiere estimulación antigénica por infección crónica. Un aumento marcado de los linfocitos en mamíferos así como la aparición de linfocitos inmaduros (linfoblastos) en el frotis sanguíneo, generalmente es asociado con un trastorno linfoproliferativo. [19, 41] Monocitos. Usualmente son las células más grandes entre las poblaciones leucocitarias. Su núcleo varía de redondo u oval a lobulado. El citoplasma es abundante, se tiñe de color azul grisáceo y puede contener vacuolas y gránulos azurófilos (figura 17). La monocitosis en mamíferos ocurre en inflamaciones agudas y crónicas como respuesta a un incremento en la demanda. [9] Figura 17. Monocitos en tití gris (S. leucopus). Izq. Núcleo característico lobulado. Der. Célula con vacuolas citoplasmáticas. (1000X, coloración de Wright). Fotografías: Copete-Sierra M. Aves Heterófilos. Constituyen la subpoblación más abundante dentro del recuento diferencial en aves son las células análogas a los neutrófilos de los mamíferos. [39] Generalmente son redondos, con un núcleo lobulado de cromatina densa que se tiñe de color morado. Su citoplasma es pálido y presenta gránulos de color rojo ladrillo de forma espiculada, aunque en algunas especies estos gránulos pueden ser ovalados o redondos (figura 18). [7, 19] 42 Asociación de Veterinarios de Vida Silvestre (VVS) ISSN

27 EVALUACIÓN HEMATOLÓGICA EN FAUNA SILVESTRE Y NO CONVENCIONAL Los cambios morfológicos observados en heterófilos pueden deberse al estrés o diferentes enfermedades. La toxicidad se evidencia con degranulación, vacuolización y/o basofilia del citoplasma. [3] La heterofilia puede asociarse con inflamación en respuesta a agentes infecciosos como Chlamydophila, Mycobacterium y Aspergillus, y a causas no infecciosas como toxicidad e injuria traumática. [42] Figura 18. Heterófilo de una lora frente amarilla (Amazona ochrocephala), con núcleo bilobulado. (1000X, coloración de Wright). Fotografía: Copete- Sierra M. Los heterófilos inmaduros presentan una fuerte basofilia citoplasmática y ausencia de segmentación nuclear. Al igual que en mamíferos pueden encontrase bandas, metamielocitos y mielocitos. Estas células no suelen observarse en aves sanas y su presencia está relacionada con enfermedades infecciosas. En respuesta a enfermedades sistémicas los heterófilos pueden exhibir cambios tóxicos como son degranulación, vacuolización y/o basofilia del citoplasma. [7] Eosinófilos. El núcleo de los eosinófilos es lobulado y suele teñirse más oscuro que el de los heterófilos. El citoplasma se colorea de azul claro y contiene gránulos generalmente ovalados o redondos, de color rojo brillante en la mayoría de especies (figura 20). En algunas ocasiones los gránulos no absorben el colorante y semejan vacuolas redondeadas de tamaño uniforme Subdirección Técnico Científica 43

28 COPETE-SIERRA M que ocupan todo el citoplasma. [7] En algunas especies de psitácidos los eosinófilos exhiben gránulos de color azul (figura 20). [19] Aunque se considera un hallazgo inconsistente, la eosinofilia en aves puede estar asociada a parasitosis, automutilación, traumas severos, lesiones en piel y reacciones de hipersensibildad. [15] Las aves rapaces sanas poseen un número elevado de eosinófilos. Basófilos. Usualmente el núcleo no está segmentado y es difícil de observar, debido a que los gránulos metacromáticos basofílicos del citoplasma suelen enmascararlo. A diferencia de los mamíferos, es frecuente encontrar basófilos en frotis de aves sanas. Aunque se conoce que estas células participan en la respuesta inflamatoria aguda y en reacciones de hipersensibilidad tipo IV, su función no ha sido bien definida. [42] Linfocitos. Similares a los de mamíferos. Son redondos pero pueden exhibir irregularidad en el citoplasma, por acúmulos de eritrocitos a su alrededor. El núcleo es redondo, de cromatina densa o reticulada, en posición central o ligeramente excéntrico. El citoplasma es homogéneo, se tiñe débilmente basofílico y carece de vacuolas y gránulos, características importantes para la diferenciación entre trombocitos y linfocitos pequeños [7]. Figura 19. Eosinófilos aviares. Izq. Eosinófilo de una lora de cachetes amarillos (Amazona amazonica): célula con granulación redonda, de color rojo brillante; en la parte inferior se observa un heterófilo. Der. Eosinófilo de una Guacamaya azul y amarillo (Ara ararauna), en el cual pueden observarse los gránulos de color azul característicos en algunos psitácidos. (1000X, coloración de Wright). Fotografías: Copete-Sierra M. Los linfocitos reactivos se caracterizan por presentar un citoplasma basofílico un núcleo con cromatina densa. En ocasiones el citoplasma puede contener gránulos azurófilos. En psitácidos se han observado linfocitos reactivos con vacuolización del citoplasma. [3, 7] La reactividad de estas células, al igual que la linfocitosis, se relaciona con estimulación antigénica producida por 44 Asociación de Veterinarios de Vida Silvestre (VVS) ISSN

29 EVALUACIÓN HEMATOLÓGICA EN FAUNA SILVESTRE Y NO CONVENCIONAL diferentes agentes infecciosos, aunque algunos autores afirman que la aparición de esta reactividad en animales clínicamente sanos es común [25]. Monocitos. Son las células más grandes de la serie blanca encontradas en la sangre aviar. Pueden ser redondos o ameboides, de núcleo redondo o lobulado normalmente excéntrico (figura 20). Su citoplasma es abundante, se tiñe azul-grisáceo, puede verse ligeramente opaco y puede presentar vacuola y finos gránulos eosinofílicos. [7, 15] La monocitosis en aves es un signo de infección crónica que puede asociarse con agentes bacterianos y fúngicos. [42] Figura 20. Monocito de una guacamaya cariseca (Ara severa). (1000X, coloración de Wright). Fotografía: Copete-Sierra M. Reptiles Heterófilos. Al igual que en aves son las células equivalentes a los neutrófilo de los mamíferos. Son células redondeadas, de gran tamaño, con citoplasma pálido que contiene gránulos fusiformes refringentes, generalmente. Estos gránulos se tiñen de color naranja brillante y en una misma célula pueden aparecer gránulos opacos y refringentes. El núcleo es ovalado o redondo, de posición excéntrica y con un patrón de cromatina denso (figura 21). Algunas especies de lagartos, como las iguanas o los dragones barbudos, tienen heterófilos con el núcleo lobulado. El número de heterófilos en el leucograma de reptiles sanos varía con la especie. [1, 8, 28] Subdirección Técnico Científica 45

30 COPETE-SIERRA M La heterofilia se asocia con enfermedades inflamatorias, especialmente infecciosas o que supongan un daño tisular. [28] El aumento de heterófilos puede asociarse con causas no inflamatorias como estrés, neoplasias y leucemia hetrofílica. Se han observado heterofilias por cambios estacionales (valores máximos en verano y más bajos durante la hibernación) y como respuesta a la migración, en algunas especies como la tortuga Caretta caretta. [37] Al igual que en mamíferos y aves, en los frotis sanguíneos de reptiles pueden observarse heterófilos inmaduros (normalmente mielocitos y metamielocitos) y células con cambios tóxicos. Los heterófilos inmaduros tienen mayor grado de basofilia del citoplasma, el núcleo no lobulado, menor número de gránulos que las células maduras. Su presencia en el frotis sanguíneo acompañada de heterofilia es indicativa de una enfermedad inflamatoria. Si la cantidad de heterófilos inmaduros constituye una desviación a la izquierda, la heterofilia se asocia una etiología infecciosa bacteriana. [8, 28] Figura 21. Heterófilo de una tortuga estuche (Kinosternon leucostomum). Se puede apreciar el deterioro de la morfología eritrocitaria por el contacto prolongado con el anticoagulante (1000X, coloración de Wright). Fotografía: Copete-Sierra M. La toxicidad en heterófilos se caracteriza por un aumento de basofilia citoplasmática; alteraciones en los gránulos como degranulación parcial, 46 Asociación de Veterinarios de Vida Silvestre (VVS) ISSN

31 EVALUACIÓN HEMATOLÓGICA EN FAUNA SILVESTRE Y NO CONVENCIONAL gránulos con tendencia a fusionarse o gránulos anómalos; vacuolización del citoplasma; y alteraciones nucleares (cariorrexis o cariolisis). [28] La lobulación nuclear, en especies de reptiles que normalmente no la poseen, indica una inflamación grave, característica que se observa en tortugas del génerotestudo. [24] Eosinófilos. Son células grandes, redondas, con citoplasma azul claro que presenta gránulos esféricos eosinofílicos. En algunas especies estos gránulos se observan de color magenta oscuro o azul. El núcleo tiene una forma variable, desde redondo a ligeramente ovalado; en algunas especies de lagartos puede ser bilobulado (figura 22). [8] El tamaño de los Eosinófilos varía con la especie: las serpientes tienen los eosinófilos más grandes, y los lagartos los más pequeños. [26] En algunas especies de reptiles es normal encontrar eosinofilia en animales sanos durante la hibernación; es relativamente normal encontrar un recuento elevado en las tortugas del género Trachemys. [28] La eosinofilia puede asociarse con infecciones parasitarias y la estimulación del sistema inmune. [8] Basófilos. Son células pequeñas, redondas con un contenido variable de gránulos citoplasmáticos metacromáticos basofílicos que enmascaran con frecuencia el núcleo, al igual que en los basófilos aviares (figura 23). Son de tamaño variable de acuerdo con la especie: los lagartos tienen basófilos pequeños y los quelonios y cocodrilos tienen basófilos más grandes. [8] Figura 22. Eosinófilo de una pitón de la India (Python molurus) observan gránulos esféricos de color rojo brillante. (1000X, coloración de Wright). Fotografía: Copete-Sierra M. Subdirección Técnico Científica 47

32 COPETE-SIERRA M Figura 23. Basófilo de de una tortuga estuche (Kinosternon leucostomum). (1000X, coloración de Wright). Fotografía: Copete-Sierra M. Su función es probablemente similar a la de los basófilos de los mamíferos. Su concentración en sangre periférica varía entre especies: en la tortuga acuática Pseudemys ruiventris es el tipo celular predominante en los recuentos diferenciales leucocitarios. [22] La basofilia en reptiles ha sido asociada con infecciones parasitarias y virales. [8] Linfocitos. Son similares a los de aves y mamíferos. Son redondos pero pueden exhibir irregularidad en el citoplasma, por acúmulos de eritrocitos a su alrededor, al igual que los linfocitos aviares. Su citoplasma es escaso, homogéneo, generalmente carece de vacuolas y gránulos y se tiñe moderado o débilmente basofílico. El núcleo es redondo, de posición central o ligeramente excéntrico, con un patrón de cromatina densa [8, 28]. La concentración de linfocitos en sangre de reptiles es variable y puede representar más del 80% del recuento diferencial leucocitario. [39] Existen diferencias en el recuento linfocitario asociadas con sexo: en algunas especies las hembras pueden tener una concentración de linfocitos significativamente más alta que los machos de la misma especie; cambios estacionales: disminuye en invierno y es más elevado en verano. La linfocitosis es producida en procesos inflamatorios, infecciones parasitarias y virales, cicatrización de heridas y trastornos linfoproliferativos. La reactividad 48 Asociación de Veterinarios de Vida Silvestre (VVS) ISSN

33 EVALUACIÓN HEMATOLÓGICA EN FAUNA SILVESTRE Y NO CONVENCIONAL se evidencia con un volumen citoplasmático aumentado y un mayor grado de basofilia citoplasmática, y se asocia con una estimulación del sistema inmune por la presencia de antígenos sistémicos [43]. Monocitos. Al igual que en mamíferos y aves son los leucocitos de mayor tamaño que se encuentran en la sangre periférica. Pueden ser redondos o ameboides, con un núcleo pleomórfico (redondo, ovalado o lobulado) y con un patrón de cromatina menos denso que el de los linfocitos. El citoplasma se tiñe azul-grisáceo y puede contener vacuolas o gránulos eosinofílicos (figura 24). [8] Figura 24. Monocito de de una tortuga estuche (Kinosternon leucostomum). (1000X, coloración de Wright). Fotografía: Copete-Sierra M. La monocitosis está asociada con enfermedad inflamatoria, especialmente en inflamación granulomatosa. Con frecuencia, los monocitos en sangre periférica muestran actividad fagocitaria. La eritro y la leucofagocitosis por parte de estas células pueden asociarse con anemia y la presencia de enfermedades infecciosas. [17, 38] Azurófilos. La identificación y clasificación de estas células han estado rodeadas de confusión, ya que son consideradas del mismo tipo que los monocitos por algunos autores, y de una población aparte por otros como se presentan en las serpientes. [28] Los azurófilos son células mononucleares, que pueden ser redondas o de forma irregular, ligeramente más pequeñas en tamaño que los monocitos. Son mononucleares y el núcleo es redondo, ovalado o irregular. El Subdirección Técnico Científica 49

34 COPETE-SIERRA M citoplasma es basofílico y más oscuro que el del monocito, de color azul a lila y presenta una pequeña cantidad de gránulos azurofílicos mate, de varios tamaños; el citoplasma puede presentar vacuolas y material fagocitado. [8, 19] Se ha descrito azurofilia asociada con inflamación e infecciones, incluyendo las producidas por hemoparásitos. [27, 35] Trombograma En animales silvestres y no convencionales el trombograma consiste en el análisis cuantitativo (recuento) y cualitativo (morfología) de las plaquetas en mamíferos, y de los trombocitos en aves y reptiles. El recuento puede realizarse de forma manual en hemacitómetro (recuento directo), o en el frotis sanguíneo (recuento indirecto) como recuento estimado. [4, 40] El recuento de plaquetas y trombocitos define los conceptos de trombocitopenia y trombocitosis. Trombocitopenia se refiere a la disminución de estas células y está asociada en la mayoría de especies a un aumento del consumo o destrucción. [9] Pueden producirse falsas disminuciones en los recuentos por agregación plaquetaria in vitro. La trombocitosis define el aumento en la cantidad de plaquetas o trombocitos y está asociada con anemia ferropénica, enfermedades inflamatorias, neoplasias e infecciones bacterianas. [7, 8, 9] Mamíferos Las plaquetas son los fragmentos citoplasmáticos de los megacariocitos, células que se encuentran en la médula ósea, no poseen núcleo y presentan granulación (figura 25). Tienden a ser redondas pero pueden variar en forma y tamaño. [19] Normalmente son más pequeñas que los eritrocitos pero pueden aparecer mucho más grandes. A estas células de mayor tamaño se les denomina macroplaquetas, son producto de una liberación de formas inmaduras hacia la circulación y, en algunas especies, regeneración plaquetaria. [9] Aves Los trombocitos aviares son células pequeñas, redondas u ovaladas. Poseen un núcleo que puede ser redondo u ovalado, y presenta un patrón de cromatina denso. El citoplasma es incoloro o se tiñe de un gris pálido y contiene gránulos eosinófilicos (figura 26). Su identificación y recuento se dificulta ya que tienden a agregarse. Los trombocitos se forman a partir de un precursor mononuclear en médula ósea. [7] 50 Asociación de Veterinarios de Vida Silvestre (VVS) ISSN

35 EVALUACIÓN HEMATOLÓGICA EN FAUNA SILVESTRE Y NO CONVENCIONAL Figura 25. Plaquetas de un puma (Puma concolor). (1000X, coloración de Wright). Fotografía: Copete-Sierra M. Figura 26. Trombocitos de un periquito cascabelito (Forpus conspicillatus). (1000X, coloración de Wright). Fotografía: Copete-Sierra M. Reptiles En reptiles los trombocitos son células pequeñas, elípticas o fusiformes, con un núcleo ovalado y central. El citoplasma es casi transparente, hecho importante que lo que permite diferenciarlos de los linfocitos pequeños. [8, 28] Subdirección Técnico Científica 51