PROCEDIMIENTO TECNICA DE COAGULASA EN TUBO PRT

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1 Página 1 de 7 1. OBJETIVO Comprobar la facultad de las unidades formadoras de colonias de S. aureus presentes en una muestra de alimento, de coagular el plasma de conejo por acción de la enzima coagulasa (libre y ligada) 2. CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE Aplicar este procedimiento a las unidades formadoras de colonias sospechosas de S. aureus y que han sido seleccionadas para realizar la prueba de coagulasa 3. FUNDAMENTO S. aureus es un microorganismo que produce durante su desarrollo la enzima coagulasa. Esta enzima es de naturaleza proteica y es fácilmente inactivada por las enzimas proteolíticas. Se desconoce el mecanismo exacto y la estructura química, pero se sabe que esta enzima desempeña cierto papel en la coagulación. Actúa sobre algún componente que se encuentra en el suero para producir un coágulo o trombo. In vitro, la coagulasa aumenta la velocidad de coagulación del plasma; formando un coágulo de fibrina bacterias Plasma coágulo de fibrina Coagulasa 4. REFERENCIAS 4.1 Bacteriological Analytical Manual Online Enero 2001, Charper Compendium of methods for the microbiological examination of foods APHA, TERMINOLOGÍA No Aplica

2 Página 2 de 7 6. MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS 6.1 MATERIALES Tubos de 10x130 mm con tapa rosca y estériles Pipetas de 1 ml estériles Asas de inoculación nicrom o desechables estériles Aguja de inoculación nicrom o desechables estériles 6.2 MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS Caldo infuso cerebro corazón ph 7,4 ± 0.2 en tubo tapa rosca de 13x100 mm Agar soya tripticasa ph 7,3 ± Plasma de conejo con EDTA (Difco o Merck ) o plasma fresco de conejo diluido 1:3 con agua destilada estéril. 6.3 CEPAS CONTROL Control coagulasa positiva = cepa de S.aureus ATCC Control coagulasa negativa = cepa S. epidermidis ATCC EQUIPOS Incubadora a 35ºC ± 1ºC 7. DESARROLLO 7.1 Seleccionar colonias sospechosas de S. aureus en las placas Baird Parker. 7.2 Transferir las colonias sospechosas a tubos con 5 ml de caldo cerebro corazón y emulsificar cuidadosamente Inocular en estría un tubo con agar soya tripticasa a partir de la colonia sospechosa en paralelo al traspaso del caldo infusión cerebro corazón con una asada de la suspensión de caldo infuso cerebro corazón preparado en el pto Incubar los tubos de agar soya tripticasa y de caldo infuso cerebro corazón a 35 ºC ± 1 C durante horas.

3 Página 3 de Retener los cultivos en estría a temperatura ambiente por si se tiene que repetir el test de coagulasa o se requiere realizar otras pruebas confirmativas. 7.6 Cumplido el período de incubación agregar 0,3 ml de plasma de conejo reconstituido (comercial o plasma fresco) a cada tubo, previamente identificados por muestras y añadir de 0,1 a 0,3 ml a cada tubo respectivo con el cultivo en caldo cerebro corazón previamente incubado.mezclar cuidadosamente. 7.7 Incubar a 35 ± 1 C y examinar la formación de coágulo en un período superior a 4 horas. 7.8 Solamente un coágulo firme y completo y que permanece en su lugar al ser invertido el tubo es considerado positivo para S. aureus. 7.9 Las reacciones parciales del coágulo correspondientes a 2+ y 3+ deben ser analizadas nuevamente Simultáneamente con las muestras sospechosas realizar controles con cepas de cultivos conocidos coagulasa positiva y coagulada negativa Si se requiere, realizar a todos los cultivos sospechosos Tinción de Gram y observar microscópicamente Si los resultados son provenientes del estudio de cepas anotar los resultados obtenidos en el Registro estudio de cepas S. aureus aisladas de ambiente 8. REGISTROS 8.1 Registro estudio de cepas S. aureus aisladas de ambiente. 9. ANEXOS Anexo N 1 Esquema :Técnica de coagulasa en tubo. Anexo N 2 Medios de Cultivo y Reactivos. Anexo N 3 Precauciones al realizar la prueba de coagulasa Anexo N 4 Registro estudio de cepas S. aureus aisladas de ambiente

4 Página 4 de 7 ANEXO Nº 1 TECNICA DE LECTURA PLACAS O Lectura de placas que contengan entre 20 a 200 ufc REAISLAMIENTO Colonia, negra con características de S. aureus Agar Baird Parker SIEMBRA: colonia seleccionada INCUBACION: Caldo cerebro corazón Incubar a 35 º C por 24 hrs Pruebas bioquímicas o toxinas Agar BAB o Soya tripticasa (siembra en estría) 0,2mL cultivo CONFIRMACION : 0,3 ml de plasma de conejo Prueba coagulasa en tubo INCUBACION: Incubar a 35 ºC por 4-18 horas LECTURA PRUEBAS CONFIRMATIVAS Leer a las 4hrs, los tubos negativos incubar hasta 18 hrs TABLA DE LECTURA: (-) TABLA DE LECTURA: Turner y Schwartz,1958) (-): sin evidencia de coagulación 1+: pequieños coágulos no organizados 2+: pequeños coágulos organizados 3+: gran coágulo organizado 4+: todo el contenido coagulado, se mantiene al invertir el tubo

5 ANEXO N 2 MEDIOS DE CULTIVO Y REACYIVOS Página 5 de 7 1- INFUSO CEREBRO CORAZÓN (Difco Merck Oxoid CM 225 B) Infusión de cerebro de ternero 200 ml Infusión de corazón de vaca 250 ml Peptona o proteosa peptona 10 g Cloruro de sodio 5 g Fosfato de sodio monohidrato 2,5 g Glucosa 2 g ph 7,4 ± 0,2 Distribuir en volúmenes de 3 ml y esterilizar en autoclave a 121 C por 15 minutos. Realizar control de calidad antes de usar. 2- SOLUCIÓN SALINA 0,8 % Cloruro de sodio Agua destilada 8,5 g ml Esterilizar a 121 C por 15 minutos.

6 Página 6 de 7 1- CULTIVO ANEXO Nº 3 PRECAUCIONES AL REALIZAR PRUEBA DE COAGULASA Una actividad débil de coagulasa puede pasar inadvertida, si el cultivo en caldo del microorganismo sospechoso es : - demasiado viejo. Se debe emplear un cultivo de 24 hrs. - o si el crecimiento es escaso. 2- PLASMA El plasma fresco es inestable y puede coagularse y formar partículas que producen una turbiedad o depósito que hace difícil interpretar una reacción de coagulasa débilmente positiva. El plasma utilizado para la prueba de la coagulasa no debe ser filtrado ya que la filtración extrae los agentes de la coagulación de la sangre. Todos los días que se utilice el plasma se debe realizar un control positivo y negativo, utilizando como control positivo una cepa de S. aureus coagulasa positiva y como control negativo una cepa de S. epidermidis. 3- PRUEBA EN TUBO Cuando se realiza la prueba en tubo de ensayo, no sacudir ni agitar el tubo al controlar la formación de coágulo. Puede producirse un resultado dudoso por rompimiento del coágulo en la primera etapa de la coagulación lo que no se revierte con la incubación. Algunas cepas de S. aureus producen una gran cantidad de fibrinolisina lo que provoca la ausencia de coágulo por lisis precoz o solamente la presencia de un pequeño coágulo en los primeros momentos de la incubación y que luego es lisado y da por resultado falsas reacciones negativas. Algunas cepas de S. aureus producen tan poca estafilocoagulasa, que solamente se observa la actividad coagulasa después de 24 hrs de incubación. Se acepta en general que la actividad de la coagulasa es específica de S. aureus. Sin embargo, otros microorganismos son capaces de coagular el plasma citratado. Ej Serratia marcescens, E. coli, Klebsiella, Pseudomonas aeruginosa, pero estos microorganismos no producen la enzima sino que la coagulación del plasma se produce porque descomponen el citrato liberando iones calcio que a su vez activan los mecanismos normales de la coagulación de la sangre (generalmente lo hacen a las 18 hrs o más de incubación).

7 Página 7 de 7 Anexo N 4 Registro estudio de cepas S. aureus aisladas de ambiente Nº...Procedencia...Identificación Cepa... Alimento que se aisló cepa :...Fecha de análisis:... PRUEBA REAISLAMIENTO en B. P. 48 hrs a 35 º C CARACTERISTICAS EN AGAR ESTRIA TINCION DE GRAM COAGULASA 4 hrs. 18 hrs. TERMONUCLEASA 4 hrs. TEST DE TOXINA ( Kit RPLA ) RESULTADO CEPA 1 CEPA 2 CEPA 3 CEPA 4 CEPA 5 RESULTADO...