CONTROL DE CALIDAD EN PARASITOLOGÍA

Transcripción

1 CONTROL DE CALIDAD EN PARASITOLOGÍA Dra. Enedina Jiménez Cardoso Laboratorio de Investigación en Parasitología Hospital Infantil de México Federico Gómez

2 Programa de control de calidad Diagnóstico de Parásitos intestinales Diagnóstico de Parásitos intestinales Fase Pre-analítica Fase Pre-analítica Fase Analítica Fase Analítica Fase Post-Analítica Fase Post-Analítica Toma de muestra Toma de muestra 5-10g en un recipiente de boca 5-10g en un recipiente de boca ancha limpio, seco y libre ancha limpio, seco y libre de detergentes de detergentes Calibrar el equipo Calibrar el equipo (centrifuga y microscopio) (centrifuga y microscopio) Verificar el buen estado de los Verificar el buen estado de los reactivos y que la muestra no reactivos y que la muestra no presente interferencias presente interferencias Reporte Post-Analítica Reporte Post-Analítica Transporte en Formalina al 5% Transporte en Formalina al 5% PROCEDIMIENTO PROCEDIMIENTO Realizar análisis coproparasitoscópico por concentración: Realizar análisis coproparasitoscópico por concentración: flotación o sedimentación flotación o sedimentación Archivar una copia del resultado Archivar una copia del resultado con los datos del paciente, de la con los datos del paciente, de la muestra, del analista y del muestra, del analista y del laboratorio laboratorio Recepción Recepción Datos completos del paciente, Datos completos del paciente, fecha y hora de la recolección fecha y hora de la recolección fecha de recepción, código de fecha de recepción, código de la muestra la muestra Identificación de las formas parasitarias teñidas con lugol, usando Identificación de las formas parasitarias teñidas con lugol, usando micrómetro Incluir control positivo, micrómetro Incluir control positivo, comparar con fotografías comparar con fotografías y laminillas de colección y laminillas de colección Evaluación de resultados Evaluación de resultados Reportar casos raros para los Reportar casos raros para los estudios epidemiológicos y realizar estudios epidemiológicos y realizar una colección con tinción una colección con tinción permanente permanente

3 Analisis coproparasitoscopico Fase preanalítica Toma de Muestras Condiciones Aceptables. La muestra será la primera de la mañana y remitida al Laboratorio. Si es un Bebé, la muestra se tomará del pañal. Tres días consecutivos. Se enviará en un frasco de boca ancha. Inaceptables. Contaminadas con orina. Mas de cinco días de emisión. Almacenadas en temperaturas inferiores a 0 C, mayores a 50 C.

4 Coproparasitoscopico, transporte, ejecución Fase preanalítica MANEJO. Rotularla con la siguiente información. - Fecha de colección - Nombre y número de identificación del paciente. - Historia clínica con datos de importancia para el diagnóstico correcto.

5 Fase Analítica LABORATORIO (a, b, c). Debe contar con un área de recepción de muestras y otra para desarrollar la metodología restringido para actividades tales como comer, beber, fumar. a) MATERIAL. b) CRISTALERIA c) REACTIVOS Centrifuga. Cubreobjetos Formalina 5% Microscopio óptico. Portaobjetos Lugol-Yoduro 2% Densímetro Tubos de ensaye Sulfato de Zinc Balanza granataria. (13x100mm) 33% δ Embudo de plástico. Malla de alambre galvanizado.

6 Fase Analítica Control de Calidad a) CALIBRACIÓN DEL MICROSCOPIO. Controles, fotografías y laminillas de parásitos conocidos.

7 b) PRECAUCIONES. Uso de guantes, bata y trabajar en un área destinada únicamente al procesamiento de las muestras. Las muestras diarreicas deben analizarse en los treinta minutos siguientes a su emisión. c) ERRORES. El que los reactivos no estén en condiciones óptimas. (Frascos con fecha de elaboración). Confusión de artefactos con formas parasitarias. Confusión de genero yo especie del parásito observado. Densidad del sulfato de Zinc a una densidad diferente d) LIMITES DE REPORTE. Estadio del parásito. Género del parásito Especie del parásito. Fase Analítica Control de Calidad

8 Fase Analítica Control de Calidad Artefactos más comunes en el análisis de concentración por flotación 1. La materia fecal contiene en muchos componentes entre ellos se encuentran: Residuos de alimentos Productos de digestión Células epiteliales, leucocitos, eritrocitos Levaduras y bacterias. 2. Es necesario hacer la diferencia entre los parásitos, de otros elementos presentes en las heces Material derivado de células humanas Cristales de Charcot-Leyden

9 2.3.- Células epiteliales Macrófagos Leucocitos polimorfonucleares Eritrocitos 3. Otros elementos. Fase Analítica Control de Calidad Algas Conidias Esporas Elementos de plantas Granos de polen Esporas Artefactos de tinción Espirales vegetales Levaduras

10 artefactos

11 Fase Analítica Diagnóstico Presuntivo (1) Procedimiento Heces no preservadas 0.85% NaCL Formalina al 5 ó 10% Fijador de Schaudinn s Obtención Directa Concentración Tinciones permanentes Protozoarios Quistes/Huevos Helmintos Larvas Motilidad Protozoarios Protozoarios Quistes/Huevos Quistes/Huevos Helmintos Helmintos Larvas Larvas Morfología General Protozoarios Trofozoitos Y Quistes Morfología Precisa

12 Fase Analítica Diagnóstico presuntivo (2) Procedimiento Heces Heces Muestra Muestra líquida líquida 5 a 10% de Formalina Mezclar 3-4 gotas con PVA con la ó 2 gotas de la muestra Fijador de Schaudinn s Concentrarla Tinción permanente Tinciones permanentes Huevecillos o larvas de Helmintos Protozoarios Helmintos Protozoarios Helmintos Morfología General Morfología precisa Protozoarios y/o Helmintos Morfología Precisa Protozoarios y/o Helmintos

13 Van Leewenhoek conocido como el padre de la microbiología (1632) Realizo la primera observación de Giardia Ninguna relación entre el microorganismo y su patología En 1859, Vilem Lambl observo Giardia en muestras de niños con diarrea Comensal Giardia lamblia

14 G. intestinalis Es el agente etiológico parásito más importante que causa diarrea en niños. Lewis, D.J. Dig Dis. 1992;10(2): Farthing, M. J. Gastoenterol Clin North Am. 1996;25(3): En Asia, Africa y Latinoamerica se reportan 200 millones de personas con Giardiasis sintomática y 500,000 casos nuevos de Giardiasis por año. WHO (1996) The World Heath Report 1996, WHO. Afecta un gran múmero de mamíferos entre ellos a los animales domésticos. Por lo que además de la importancia médica y veterinaria este parásito se hace peculiar por sus características genéticas que lo ubican ocmo el eukariote más primitido. Upcroft, J; Upcroft, P. Bioessays. 1998;20(3):

15 Colonización La ingestión de quistes permite pasar a éstos por el estómago y el desenquestamiento se lleva a cabo por al breve exposición con el ácido clorídico ph2, después de 5 a 10 minutos los trofozoítos colonizan la parte alta del intestino delgado.

16 Adherencia Los trofozoítos se adhieren a la mucosa intestinal por el disco ventral suctorio mediante microtúbulos que adheridos a la microbellocidad intestinal provoca un aplanamiento de ellas y como consecuencia su disfunción.

17 Dos núcleos simétricos Citoesqueleto desarrollado Cromosomas múltiples Anaeróbico Amitocondrial Sensible a fármacos Plásmido o virus Gen para toxina

18 1. Núcleo 2. Cuerpo medio 3. Axonema 4. flagelos 1. Núcleo 2. Axonema 3. Pared 4. Cuerpos obscuros

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20 giardiasis Asintomática Portador Sintomática Diarrea Perdida de apetito Calambres Nausea Pérdida de peso y deshidratación Síndrome de malabsorción

21 diagnóstico El diagnóstico se hace al identificar los quistes y/o trofozoítos en heces. aspirado o biopsia duodeno-yeyunal. El examen simple de una sola muestra de heces no es suficiente (50-70%). 3 muestras en un período de una semana (90-95%).

22 Parasitosis intestinal por protozoarios GIARDIASIS DIARREA PERSISTENTE MALA ABSORCIÓN FLATULENCIAS DIAGNÓSTICO HISTORIA POSITIVO NEGATIVO NO DESCARTAR DIAGNÓSTICO TROFOZOITOS O QUISTES EN MATERIA FECAL NEGATIVO TROFOZOITOS EN DUODENO NEGATIVO DIAGNÓSTICO CONFIRMADO NEGATIVO POSITIVO POSITIVO DIAGNÓSTICO CONFIRMADO POSITIVO TRATAMIENTO

23 Reacción en Cadena de la Polimerasa 1 200pb Electroforesis en gel de agarosa al 1% en el que se observa: 1.- Marcadores de pesos moleculares. 2, 3, 4.- Producto de RCP, fragmento de 1200pb que codifica para la enzima glutamato deshidrogenasa (gdh) de Giardia lamblia.

24 Análisis de los genes tsp11 y gdh de Giardia intestinalis tsp11 gdh Kpn I Xha I Hind III Sph I Apa I BspH I EcoRI Kpn I Genogrupo Producto Producto Kb Kb AI AII B No Amplifica

25 transmisión zoonótica

26 transmisión zoonótica 10% en perros bien tratados 36 a 50% en cachorros hasta 100% en criaderos. En gatos es de 1,4-11% (dificultad para identificar el organismo)

27 Genogrupos de Giardia intestinales y su relación al origen del aislamiento A A2 A3 A4 B G ASINTOMATICOS SINTOMATICOS CULTIVOS PERROS

28 Árbol filogenético del gen ribosomal 16S, de aislados de Giardia intestinalis humanos y caninos

29 Multiplex Aislado Grupo 1) Ad23 F 2) Ad28 B 3) Ad137 C 4) Ad148 D 5) Ad13 A 6) Bris136 AII 7) Rat G pb PM F B E C D AI AII G

30 Genotipo de Giardia intestinalis en aislados obtenidos de perros y humanos, mediante la restricción del gen de β- giardina Muestras Assemblage A AI AII Cultivo n=6 6/6 (100%) 0/6 Humano n=12 5/12 (41.66%) 7/12 (58.33%) Perro n=20 11/20 (55%) 9/20 (45%) Total n=38 22/38 (57.89%) 16/38 (42.10%)

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