Experiencias de Investigación en Probióticos

Transcripción

1 Experiencias de Investigación en Probióticos Simposium Alimentación del Siglo XXI Alimentos Funcionales y Transgenicos MC. Blanca Edelia González Martínez Facultad de Salud Pública y Nutrición Universidad Autónoma de Nuevo León Octubre de 23

2 Conceptos Los probióticos son microorganismos vivos que su ingestión en cierto número genera efectos benéficos en la salud humana además de los efectos de nutrición. Cuando éstos probióticos son incorporados en alimentos como parte del proceso de elaboración o como aditivos, se generan alimentos funcionales.

3 Historia Leeuwenhoek observa por primera vez a los microorganismos. Louis Pasteur descubre que son los responsables de las reacciones de fermentación. Elie Metchnikoff dilucida el efecto perjudicial de las sustancias putrefactivas y afirma que los productos fermentados son la causa de la longevidad del pueblo búlgaro. Surge el concepto de probiótico en la segunda mitad del siglo pasado.

4 Efectos benéficos de los probióticos Resistencia a microorganismos patógenos. Mejora en la intolerancia a la lactosa. Actividad antitumoral. Producción de nutrimentos. Concentración y metabolismo del colesterol. Efectos inmunológicos.

5 Mecanismos de la acción de los probióticos para mejorar la salud Tratamiento de encefalopatía hepática Reducción de amonio intestinal Síntesis de proteínas Reducciones de enfermedades intestinales por patógenos exógenos Fuentes selectivas de carbono y energía Proliferación de bacterias Resistencia a la colonización Reducción de infecciones oportunistas de comensales Producción de organismos putrefactivos y patogénicos Prebióticos Carbohidratos fermentables Reducción de organismos putrefactivos y patogénicos Fermentación Pocos metabolitos xenobióticos (aminas, indoles, etc.) Butirato Producción de a.g.c.c Inhibición Pocos metabolitos xenobióticos (aminas, indoles, etc.) Combustibles para colonocitos. Diferenciación celular Disminución del ph intestinal Regularización de lipogénesis hepática Incremento en la solubilidad de minerales Formación reducida de ácidos biliares Reciclaje disminuido de ácidos biliares Mejora en al absorción de minerales Reducción lípidos y colesterol en suero Reducción del riesgo de cáncer de colon

6 Investigaciones de Probióticos en disminución del colesterol Existen evidencias en estudios en animales y humanos de una moderada disminución de los niveles de colesterol con el consumo de productos lácteos fermentados. El mecanismo de acción es por la producción de ácidos de cadena corta producto de la fermentación que inhiben la síntesis de colesterol hepático. También se incrementa la deconjugación de los ácidos biliares por las enzimas microbianas. Am J Clin Nutr 2;

7 Efectos sobre los niveles de colesterol Hepner et al (17), 1979 Thomson et al (18), 1982 Rossouw et al (19), 1981 Men and women Men and women Yogurt, milk, and pasteurized and unpasteurized yogurt Milk and acidophilus milk, fermented buttermilk, and yogurt Yogurt reduced TC by 5%, both yogurts reduced TC concentrations to a similar extent No effects on blood lipid concentrations Teenage boys Yogurt, milk, and cream No effects on blood lipid concentrations Schaafsma et al (2), 1998 Men Fermented yogurt and milk Yogurt reduced TC and LDL-cholesterol concentrations compared with milk Agerbaeck et al (21), 1995 Men Fermented milk and acidified milk Fermented milk reduced TC and LDL-cholesterol concentrations Richelsen et al (22), 1996 Men and women Fermented milk and acidified milk Women: fermented milk reduced LDL-cholesterol concentrations; men: both products reduced LDL-cholesterol concentrations de Roos et al (22), 1998 Men Yogurt and AY No effects on blood lipid concentrations 1 NFMS, nonfat milk solids; TC, total cholesterol; AY, acidophilus yogurt. Am J Clin Nutr 2;

8 Investigaciones de Probióticos en Modulación del Sistema Inmune La respuesta inmune constituye la principal línea de defensa frente a la infección y, probablemente también frente a las células cancerosas. Los mecanismos para inhibir el crecimiento de tumores intestinales inducidos químicamente son: Incrementar la IgA + la producción de células CD4 + células T Disminución de células T CD8 + actividad citotóxica Incrementar la apoptósis celular Incrementar el nivel de liberación de TNFα Liberación de interleucina 1 J. Dairy Res 1998; 13:

9 Investigaciones de Probióticos en Modulación del Sistema Inmune Inducción de la producción de interferón por bacterias lácticas. Estudio en 21 voluntarios sanos en 3 grupos: Grupo 1 (7) 1 gramos de yogurt en una sola toma Grupo 2 (6) 1 gramos de leche en una sola toma Grupo 3 (8) 1 gramos de yogurt o leche durante 15 días Se encontró diferencia significativa en la producción de la actividad de 2-5 sintetasa (como marcador de la producción de interferón) del grupo 1. p =.2 Nutr Res 1993; 13:

10 Investigaciones realizadas en la Objetivo: FaSPyN - UANL Analizar los alimentos que contienen probióticos determinando su calidad microbiológica, los microorganismos que contienen y las UFC/g, evaluando la sobrevivencia de los microorganismos en condiciones de manejo normal para su uso o consumo.

11 METODOLOGÍA Selección de probióticos existentes en el mercado Determinación de calidad microbiológica Identificación del microorganismo probiótico Cuenta de microorganismos probióticos viables Sobrevivencia en condiciones de uso normal

12 Determinación de calidad microbiológica Producto Marca Mesofílicos Aerobios UFC/g Coliformes Totales UFC/g S. aureus UFC/g Salmonella UFC en 25 g Levaduras UFC/g Hongos UFC/g Escherichia coli 1 - a Ausente b - Bebidas 2 - a Ausente b a Ausente b - Leches en polvo x x x1 6 <.3 <.3 <.3 Ausente Ausente Ausente Ausente 5 c - Suplementos Ausente Ausente c c Ausente 1.66 c - * Promedio del contenido de microorganismos en 6 muestras a F=1.7 NS, b F= 2.6 NS, c F=.8 NS

13 Contenido promedio de probióticos Bebidas Log UFC/g 1 5 F=38.8 p<.1 (a) (a) (b) Productos

14 Contenido promedio de probióticos Leches en polvo para lactantes Log UFC/g a) (a) (b) F=16.18 p< Productos

15 Contenido promedio de probióticos Suplementos Log UFC/g a) (b) (a,c) (b,c) F=9.74 p<.1 Productos

16 Sobrevivencia de microorganismos probióticos en bebidas U FC /g 1.E+1 1.E+8 1.E+6 1.E+4 1.E+2 1.E Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Tiempo (días) Productos almacenados a temperatura de refrigeración. Fecha de caducidad del producto.

17 Sobrevivencia de microorganismos probióticos en leche en polvo UFC/g 1.E+8 1.E+6 1.E+4 1.E Tiempo (días) Marca 1 Marca 2 Marca 3

18 Sobrevivencia de microorganismos probióticos en suplementos UFC/g 1.E+8 1.E+6 1.E+4 1.E+2 Marca 1 Marca 2 Marca 3 Marca 4 1.E Tiempo (días)

19 Identificación de microorganismos en bebidas Muestra Aislado O 2 F6PPK Sistema API Microorganismo 1 1 Si ND 5 CHL L. casei 2 1 Si ND 5 CHL L. acidophilus 2 Si ND 5 CHL L.casei 3 Si ND 5 CHL L. paracasei 3 1 Si ND 5 CHL L. acidophilus 2 Si ND 5 CHL L paracasei

20 Identificación de microorganismos en suplementos Muestra Aislado O 2 F6PPK Sistema API Microorganismo 1 No - 5 CHL L. acidophilus 1 2 No + 2 A B. adolescentis 3 No + 2 A B. longum 4 No + 2 A B. adolescentis 5 No - 5 CHL L. acidophilus 2 1 Si ND 5 CHL L. acidophilus 2 Si ND 5 CHL L. rhamnosus 3 1 Si ND 5 CHL L. acidophilus 2 Si ND 5 CHL L. delbrueckii 4 1 Si ND 5 CHL L. acidophilus

21 Identificación de microorganismos en leches en polvo Muestra Aislado O 2 F6PPK Sistema API Microorganismo 1 1 No + 2 A B. bifidus 2 No + 2 A B. adolescentis 3 No + 2 A B. adolescentis 4 Si ND 5 CHL Streptococcus sp 2 1 No + 2 A B. adolescentis 2 No + 2 A B. adolescentis No No A 2 A B. longum B. adolescentis 3 Si ND 5 CHL L. plantarum 4 Si ND 5 CHL L. acidophilus

22 Conclusiones En el mercado se encontraron alimentos y suplementos con probióticos con buena calidad microbiológica y sin patógenos. Los probióticos de las bebidas lácteas y leches en polvo para lactantes sobrevivieron un tiempo mayor al de su caducidad en las condiciones recomendadas por los fabricantes, en cambio los suplementos no demostraron la capacidad de mantener los microorganismos probióticos viables.

23 Conclusiones La cantidad mínima de probióticos viables para asegurar un efecto benéfico es del orden de 1 7 organismos por gramo, según recomendaciones de institutos de investigación y asociaciones de productores de lácteos. De las bebidas lácteas analizadas solo 2 marcas aportan mas de esa cantidad. Las leches en polvo para lactantes aportan cantidades superiores de 1 6 por gramo y 1 8 por día; en cambio, solo una de las muestras de suplementos aporta el contenido de probióticos de 1 7.

24 Conclusiones Los microorganismos encontrados en los diferentes productos son reconocidos por sus efectos benéficos y ausencia de efectos negativos en el organismo.

25 Objetivo Determinar el efecto de los probióticos sobre los microorganismos patógenos in vitro por medio de la producción de sustancias antimicrobianas solubles.

26 Resistencia a microorganismos patógenos Competencia por nutrimentos Competencia por sitios de adhesión (efecto barrera) Cambios en las condiciones del microambiente (ph) Estimulación inmunológica Producción de compuestos que inhiben a otros microorganismos Bacteriocinas Ácidos de cadena corta Peróxido de hidrógeno

27 METODOLOGÍA Efecto de microorganismos probióticos contra patógenos in vitro Probióticos Cepas aisladas de bebidas (12) Cepas aisladas de leches en polvo (1) Cepas aisladas de suplementos (4) Cultivos comerciales grado alimenticio liofilizados (7) Patógenos Salmonella typhimurium Salmonella paratyphi Salmonella enteritidis Bacillus cereus Staphylococcus aureus Listeria monocytogenes Escherichia coli O 157 Escherichia coli O 157: H7 Yersinia enterocolitica

28 1% 9% 8% 7% 6% 5% 4% % 2% 1% % Actividad Antimicrobiana de Probióticos en Bebidas 12 cepas analizadas 1 Lactobacilos 2 Estreptococos S.typhimurium S.parathypi S.enteritidis B cereus S aureus Listeria monocytogenes E coli O157:H7 Yersinia Positivas Negativas

29 1% 9% 8% 7% 6% 5% 4% % 2% 1% % Actividad Antimicrobiana de Probióticos en leches en polvo 1 cepas analizadas 8 Bifidobacterias 1 Lactobacilo 1 Estreptococo S.typhimurium S.parathypi S.enteritidis B cereus S aureus Listeria monocytogenes E coli O157:H7 Yersinia Positivas Negativas

30 1% 9% 8% 7% 6% 5% 4% % 2% 1% % Actividad Antimicrobiana de Probióticos en cepas comerciales 7 cepas analizadas 6 Lactobacilos 1 Bifidobacteria S.typhimurium S.parathypi S.enteritidis B cereus S aureus Listeria monocytogenes E coli O157:H7 Yersinia Positivas Negativas

31 1% 9% 8% 7% 6% 5% 4% % 2% 1% % Actividad Antimicrobiana de Probióticos en Suplementos 4 cepas analizadas de Lactobacilos S.typhimurium S.parathypi S.enteritidis B cereus S aureus Listeria monocytogenes E coli O157:H7 Yersinia Positivas Negativas

32 Metodología Concentración Mínima Inhibitoria Cultivo de probióticos aprox. 4x1 8 cel/ml) 1 ml cultivo de patógenos (aprox. 1 8 )en agar Luria Centrifugación Orificios 5 mm Sobrenadante Agregar 1, 15, 2, 25 y ml de sobrenadante en los orificios Observar inhibición de crecimiento de microorganismos patógenos

33 Concentración Mínima Inhibitoria Inhibición de Escherichia coli O 157: H7 como patógeno de prueba con cepas aisladas de bebidas. Inhibición de Bacillus cereus como patógeno de prueba con una cepa aisladas de bebidas y el control (+)

34 Concentración Mínima Inhibitoria de cepas aisladas de leches en polvo Salmonella thyphimurium Salmonella parathyphi Salmonella entreritidis Bacillus cereus Staphylococcus aureus Listeria monocytogenes Escherichia coli O 157 Escherichia coli O 157: H7 Yersinia enterocolitica CEPA F * 26.6 * G * H * 26.6 * 26.6 * 26.6 * 25 * M * *

35 Concentración Mínima Inhibitoria de cepas aisladas de bebidas CEPA Salmonella thyphimurium Salmonella parathyphi Salmonella entreritidis Bacillus cereus Staphylococcus aureus Listeria monocytogenes Escherichia coli O 157 Escherichia coli O 157: H7 Yersinia enterocolitica 1 I L 2 * * * * N J 2 * 23.3 * 25 * * 2 2 O P * 28.3 * U 25 * Q R 2 * 25 * 18.6 * * 26.6 * S 25 * 26.6 *

36 Concentración Mínima Inhibitoria de cepas liofilizadas comerciales CEPA Salmonella thyphimurium Salmonella parathyphi Salmonella entreritidis Bacillus cereus Staphylococcus aureus Listeria monocytogenes Escherichia coli O 157 Escherichia coli O 157: H7 Yersinia enterocolitica A * 25 * 23.3 B * 26.6 * 26.6 * 25 * 23.3 C * * 23.3 * D * E * 26.6 * 26.6 * K 23.3 * 25 * 26.6 * * 25 * V 28.3 * 25 * 25 * 26.6 *

37 Conclusiones Se encontró actividad antimicrobiana en muchos de los productos analizados. Se encontró variación en la capacidad de inhibir en los microorganismos estudiados. La inhibición se presentó en todas las cepas de patógenos estudiadas aunque en diferente grado. No todas las cepas aisladas de microorganismos en los productos tienen actividad antimicrobiana. De las 26 cepas obtenidas de bebidas, leches en polvo y suplementos solo 14 presentaron efecto inhibitorio. Las cepas liofilizadas comerciales mostraron una mejor inhibición contra los microorganismos de prueba. En algunos de los productos no se logró demostrar el efecto inhibitorio.

38 Objetivo Determinar la sobrevivencia de los probióticos en quesos frescos tipo panela y el efecto sobre los microorganismos contaminantes de quesos.

39 Elaboración de queso fresco tipo panela. Leche pasteurizada estandarizada a 4 C Adición de renina microbiana (Formase 46) 2.5 ml/1 litros de leche Formación del cuajo Corte del cuajo Desuerado Adición de sal y Probióticos Moldeado y prensado Refrigeración

40 Efecto de los probióticos sobre organismos coliformes en quesos Quesos con Lactobacillus acidophilus 1 Log UFC/g sem anas L. acidophilus Sin Probióticos Coliformes L. acidophilus Coliformes sin probióticos

41 Efecto de los probióticos sobre organismos coliformes en quesos Quesos con Bifidobacterium Log UFC/g Sem anas Bifidobacterium Sin Probióticos Colif ormes Bifidobacterium Coliformes sin probióticos

42 Efecto de los probióticos sobre organismos coliformes en quesos Quesos con mezcla de Probióticos Log UFC/g Semanas Mezcla probióticos Sin probióticos Coliformes mezcla de probióticos Coliformes sin probióticos

43 Conclusiones Los probióticos sobreviven bien en el queso fresco tipo panela elaborado. No generaron cambios en la consistencia, aroma y sabor en el alimento, por lo que se considera son un buen vehículo para incorporar probióticos. Tienen efecto de bio-conservación mejorando la vida de anaquel del producto. Se requiere mayor investigación para determinar si hay efecto de los probóticos sobre microorganismos patógenos en productos como queso.

44 Investigaciones realizadas con probióticos en la Fac. de Ciencias Biológicas de la UANL Expresión de la proteína E7 del HPV-16 sobre la superficie de Lactococcus lactis,, y evaluación de su capacidad para inducir un respuesta inmune. QBP. Naima Gisela Cortes Pérez Dr. Juan Manuel Alcocer González Dr. Roberto Montes de Oca Luna Inmunidad de mucosas contra el VIH basada en la expresión del ASA V3 bacterias lácticas. M.C. Itza Luna Cruz Dr. Juan Manuel Alcocer

45 Investigaciones realizadas con probióticos en la UANL Ciencias Biológicas Clonación y expresión de la cadena B de la insulina fusionada a la subunidad B de la toxina del cólera en Lactobacillus casei y su efecto para bloquear el desarrollo de diabetes. QBP. Martha M. Garza Franco Dr. Juan Manuel Alcocer Clonación, expresión y secreción de dos defensinas en Lactobacillus casei: : análisis de su función antibacteriana. Biol. Samuel Campista León Dr. Juan Manuel Alcocer

46 Gracias