INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA COMO METODO CONFIRMATORIO PARA EL DIAGNOSTICO DE VIH EN EL PAIS

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1 VI Congreso Científico del Instituto Nacional de Salud INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA COMO METODO CONFIRMATORIO PARA EL DIAGNOSTICO DE VIH EN EL PAIS T.M Ada Valverde Rojas Coord. Laboratorio de Microbiología y Biomedicina

2 ANTECEDENTES Noviembre 1988: se inagura el laboratorio de Referencia Nacional en el Instituto Nacional de Salud-Peru : Transferencia Tecnológica de pruebas ELISA y pruebas rapidas a laboratorios en el pais 1991 : Se implementa la prueba confirmatoria Western Blot 1994 : se conforma el sistema de la red de laboratorios que facilitan el fortalecimiento de los lab. VIH 1996 : El laboratorio de VIH participa en las vigilancias centinelas en el pais. Vigilancia centinela en gestantes ( ), Vigilancia centinela en personas privadas de libertad (PPL) (1999), Vigilancia centinela de puerperas (2000),Vigilancia centinela de trabajadoras sexuales (T.S) (2002). Vigilancia centinela de clientes de las trabajadoras sexuales (2002). Prevalencia de la infeccion por VIH en pacientes con TB-BK (+) Lima y Callao(2003),Vigilancia centinela en gestantes y sus parejas (2005) 1988 : Implementacion de cultivo de linfocitos para la elaboracion de laminas IFI-VIH para VIH. IFI actualmente resuelve el 95 % de la confirmacion en el pais Costo- eficiencia dolares W.Blot vs 8 dolares de IFI Descentralizacion de la prueba confirmatoria de IFI a los laboratorios del pais Implementación de prueba PCR AND cualitativo 2004 Implemetación del sistema descentralizado de monitoreo (C. viral y CD4) 2008 Implementacion de pruebas genotipicas para evaluar resistencia a los ARV Acreditacion a la ISO 9001, ISO 15189

3 RED DE LABORATORIOS DE SALUD PUBLICA DIAGNOSTICO DE VIH Y MONITOREO DE LOS PVVIH Tumbes 09/02/99 Cajamarca 13/11/96 Pruebas de tamizaje 1. Pruebas ELISA 2. Pruebas rapidas Piura 17/06/94 Lambayeque 27/10/95 La Libertad 2001 LRN -INS Ancash 2000 Región Lima Callao Lima (LR Sur, Este, Ciudad) Ucayali 2000 San Martín 25/07/94 Cusco 16/02/97 Pruebas confirmatorias 1. Western blot 2. Inmunofluorescencia indirecta 3. Inmunoensayo en línea PCR ADN cualitativo para los niños menores de 2 años Pruebas de monitoreo 1.Recuento de linfocitos D4/CD8/CD3 2.Determinación de la carga viral 3.Pruebas genotípicas para evaluar la resistencia los ARV Junín 04/09/98 Red - 19 Laboratorios Regionales (LRR). - 7 Laboratorios Referenciales(LR). - 4 Regiones sin LRR(Ica, Moquegua, Cerro de Pasco, Huánuco) Huancavelica 2000 Ayacucho 23/07/94 Arequipa 06/11/96

4 CONFIRMACION DEL DIAGNOSTICO DE VIH EN EL LABORATORIO NACIONAL DE REFERENCIA VIH/SIDA/INS PERU * Set 2012

5 Valverde Rojas Ada, Romero Ruiz Soledad.

6 Desde 1998 se viene realizando diagnóstico de VIH, mediante pruebas de tamizaje: ELISA y P. confirmatoria WESTERN BLOT P.Confirmatorias:WESTERN BLOT (1990), INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA 1994: Proyecto Latinoamericano IFI-VIH-1 OPS-OMS 1995: Incorporación de la técnica IFI-VIH-1 con láminas producidas por Chile : 70% de confirmación VIH-1 por IFI Elevado costo W.Blot ($70-$100 por prueba) 1998: Consultor Dr. Eugenio Ramírez INSP-Chile en Julio 1998 (capacitación en la elaboración de laminas IFI/VIH)

7 OBJETIVO Realizar el cultivo de Linfocitos para la preparación de láminas IFI para el diagnóstico de VIH OBJETIVOS ESPECIFICOS Contar con una prueba confirmatoria para diagnostico VIH-1 de alta reproducibilidad, sensibilidad, especificidad y bajo costo frente al Western Blot. Transferencia tecnológica de IFI-VIH a los laboratorios de la Red. Preparación de Kit IFI-VIH-1 para la distribución a los laboratorios de la Red.

8 ç Líneas celulares: ç Línea H9-HTLVIII-B (derivada de un linfoma humano a células T crónicamente infectadas con VIH) ç Línea k-562 (macrófago humano no infectada con VIH) ç Medio de cultivo RPMI 1640 suplementado con 10% de SFB, glutamina 1% y HEPES 1% ç Frascos de cultivos 25 cm2 ç Estufa de CO2 al 5% a 37 C ç Cabina de flujo laminar clase II-B ç Centrífuga no refrigerada horizontal

9 ç Cultivo de células en estufa de C02 a 37 C ç Pasaje celular: dividir en 2 ó 3 frascos ç Congelamiento y descongelamiento de cultivos celulares. v ç Recuento de células: en hemoctitómetro con azul de tripán 0.5% ç Utilizar viabilidad celular igual o superior a 95%

10 ç Mezcla de células no infectadas con infectadas en proporción de 3 a 1 ç Goteo de suspensión de células en cada pocillo de lámina (6,000 a 8,000 cel. por pocillo) ç Pocillos superiores : células infectadas y no infectadas ç Pocillos inferiores: células no infectadas (control) ç Fijación con acetona fría. ç Sellado y conservación de láminas a -20 C

11 Cultivo celular

12 Selección de células

13 Línea k-562

14 Línea H9-HTLVIII-B

15 Preparación de las láminas

16 RESULTADO POSITIVO Pocillo Superior Pocillo Inferior

17 INESPECIFICO

18

19 TECNICA INMUNOFLUORESCENCIA

20 IFI-VIH

21 Producción de 252 láminas (1512 determinaciones). Validación con 150 sueros referenciales (100 sueros W.Blot positivos y 50 sueros W.Blot negativos) Sensibilidad : 100% Especificidad: 100% Control de Calidad del CDC: 100% de concordancia IFI POSITIVO WESTERN BLOT NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO 0 50 TOTAL

22 Julio 13, D D1, D3 18 Positive Reactivo Positivo Positivo D2 11 Positive Reactivo Positivo Positivo D4, D5 04 Positive Reactivo Positivo Positivo D6 16 Negative No reactivo Negativo Negativo

23 CULTIVO: Realizar los cultivos en cabina de bioseguridad Clase II B Trabajar primero las células no infectadas y después las células infectadas. Utilizar medios de cultivo por separado: para células no infectadas y para células infectadas. Descontaminar la estufa de CO2 cada 15 días Conservar las láminas en bolsas de plástico selladas al calor y almacenarlas -20 C

24 TECNICA: Personal debidamente entrenado Microscopio de inmunofluorescencia de alta resolución Titulación del conjugado Realizar dilución de 1/100 a sueros con resultado inespecífico Realizar prueba W.Blot a sueros negativos e inespecíficos. No utilizar sueros contaminados, lipémicos ni hemolizados.

25 Se cuenta con una técnica IFI-VIH 1 estandarizada con alta sensibilidad, especificidad y bajo costo. Técnica simple y de menor tiempo de ejecución que Western Blot. Técnica estandarizada para la transferencia a los laboratorios de la Red.

26 Descentralización de la Técnica de Inmunofluorescencia Indirecta (IFI VIH-1) Iquitos Tumbes Cajamarca Piura Lambayeque San Martìn INS Laboratorios Referenciales La Libertad Ancash Lima Ayacucho Tacna TRANSFERENCIA IFI-VIH Región Arequipa Región Junín Región Madre de Dios Región Callao Ica Cusco

27 AÑO IFI COSTO WB COSTO IFI DIFERENCIA S/. 65, S/. 3, S/. 62, S/. 381, S/. 21, S/. 360, S/. 186, S/. 10, S/. 176, S/. 638, S/. 47, S/. 590, S/. 221, S/. 12, S/. 208, S/. 527, S/. 29, S/. 497, S/. 490, S/. 27, S/. 463, S/. 594, S/. 33, S/. 561, S/. 582, S/. 32, S/. 549, S/. 654, S/. 37, S/. 617, S/. 673, S/. 38, S/. 635, S/. 795, S/. 45, S/. 750, S/. 630, S/. 35, S/. 594, S/. 1,491, S/. 85, S/. 1,406, TOTAL S/. 7,935, S/. 462, S/. 7,473,195.12

28 CONFIRMACIONES IFI-VIH POR REGIONES

29 Nº CONFIRMACION DE VIH DIAGNOSTICOS CONFIRMATORIOS AÑOS NEGATIVO IFI POSITIVO IFI Indeterminado LIA NEGATIVO LIA POSITIVO LIA

30 Curso de reforzamiento en IFI-VIH para los laboratorios ya capacitados. Entrega del kit IFI-VIH a los laboratorios referencia regional. Control de calidad del desempeño en pruebas de tamizaje y confirmación de VIH Supervisión de laboratorios IFI-VIH Ingresos de resultados de pruebas ELISA e IFI-VIH en el sistema Net Lab

31 ALGORITMO PARA EL DIAGNOSTICO DE INFECCION POR VIH IFI 1er ELISA Resultado (+) Resultado (-) 2do ELISA SE REPORTA NO REACTIVO SE REPORTA NO REACTIVO Resultado (+) Resultado (-) LABORATORIO LOCAL/INTERMEDIO LABORATORIO DE REFERENCIA REGIONAL e INTERMEDIO + INESPECIFICO - WESTERN BLOT LABORATORIO DE REFERENCIA NACIONAL + INDETERMINADO - REPETIR 3 MESES + INDETERMINADO - PCR

32 QUE SIGUE AHORA?...

33 TRANSFERENCIA TECNOLOGICA DE LA ELABORACION DE LAMINAS IFI-VIH AL CENTRO NACIONAL DE PRODUCTOS BIOLOGICOS REQUISITOS LABORATORIO: NBS 2 plus o NBS 3 PERSONAL : 02 profesionales (Biólogo o Tecnólogo Medico) LINEAS CELULARES: 1. L.C H9 infectadas convih-1 2. L.C K-562 macrofagos humanos celulas control no infectadas

34 Microscopio invertido con objetivos de 10, 20 y 40x (marca Carl Zeiss) Cabina de flujo laminar clase II B 2 (labconco) Estufa de C02 a 37 C (marca Termo Scientific) Centrifuga de tubos 5000 RPM con angulo batiente (marca Eppendorf, Hettich, Termo Scientific) Bomba de vacío Congeladora de -80 C Refrigeradora

35 02 Micropipetas de 10 a 100 ul 02 Pipeteador inalámbrico 02 pipetas repetidoras 06 cámaras de Neubauer Tanque de nitrógeno liquido Frascos de cultivo de 25 ml con cuello inclinado Unidades de filtración de 250 y 500 ml Tubos de centrifuga de polipropileno de 15 y 50 ml Pipetas serologicas descartables con envoltura individual de 5 y 10 ml Medio de cultivo RPMI 1640 con bicarbonato

36 Agua destilada Azul de Tripan Dimetil sulfóxido Cubetas de coloración rectangulares con tapa con porta láminas para 25 ó 50 ó 100 unidades Acetona frasco x 2.5 lts Solución Hepes 1 molar para cultivo Combitips de 500ul con dispensación celular de 10ul L-glutamina Tips estériles de baja retención de 200 ul caja x 96 Laminas para inmunofluorescencia 6 x 2 pocillos de 5 mm con fondo de Viales de fondo cónico con tapa de 1.5 a 2 ml teflón azul o negro con numeración y 02 contómetros espacio para rotulación caja x 72 Pipetas serologicas descartarles unidades estériles, con envoltura individual de1, 5 y 10 ml

37 Microscopio para inmunofluorescencia objetivos de Vortex Estufa de 37 C Refrigeradora Multimixer Cubetas de coloración de vidrio rectangular con tapa y con porta láminas de 10 ó 20 laminas

38 Laminillas cubre objeto 40x 60 caja x 100 unidades Anti IgG humano molécula completa, conjugado con FITC x 1 mg ( marca Capell) Agua destilada Cloruro de sodio x 500 grs Fosfato dibásico de potasio x 500grs Fosfato monobásico de potasio x 500 grs Azul de Evans x 100grs Tris base 0,4M TRISMA X 1 KG. HCL 0,2N concentrado Glicerol x 1 lt Tips de 200ul Tips de 1000 ul Micropipeta unical de rango variable de 0.5 a 20 ul Micropipeta unicanal de rango variable de ul Micropipeta unicanal de rango variable de ul Tubos de dilución de 1.1 ml, de polipropileno Rack porta tubos de microdilución

39 RELEVANCIA DE LA TRANSFERENCIA DE LA ELABORACION DE LAMINAS IFI-VIH AL CNPB Produccion a mayor escala Demanda nacional e internacional Kit nacional de diagnostico confirmatorio para VIH-1 Kit de alta sensibilidad y especificidad Costo bajo permite que la demanda del diagnostico VIH en el pais sea cubierta y no represente un costo elevado, permitiendo que las PVVIH accedan al tratamiento ARV

40 GRACIAS!!!

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