Kit para a determinação qualitativa ou semi-quantitativa de anticorpos Anti-Tireoglobulina (Anti-TG) no soro humano por enzimaimunoensaio (ELISA).

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1 MS Imuno-ELISA Anti-TG Kit para a determinação qualitativa ou semi-quantitativa de anticorpos Anti-Tireoglobulina (Anti-TG) no soro humano por enzimaimunoensaio (ELISA). Kit for the qualitative or semi-quantitative determination of Anti-Thyroglobulin (Anti-TG) antibodies in human serum by enzyme immunoassay (ELISA). Kit para determinación cualitativa o semi-cuantitativa de anticuerpos Anti-Tiroglobulina (Anti- TG) en el suero humano por enzimoinmunoensayo (ELISA). R E F R E F E - 96 determinações / determinations / determinaciones E determinações / determinations / determinaciones WAMA Diagnóstica Rua Aldo Germano Klein, CEAT CEP São Carlos - SP - Brasi Fone / Fax EC R E P Obelis S.A. Boulevard Général Wahis Brussels, BELGIUM Phone. +(32) Fax : +(32) SAC

2 01 PORTUGUÊS IMPORTÂNCIA CLÍNICA O espectro clínico das doenças autoimunes da tireoide é amplo, sendo que o paciente afetado pode ser hiper, hipo ou mesmo eutireóideo. Existem duas formas principais de distúrbios autoimunes da tireoide, a doença de Graves e a tireoidite de Hashimoto. As reações autoimunes também podem ocorrer em outras alterações, como o bócio esporádico e o endémico, a doença de Plummer e a oftalmopatia endócrina. Os pacientes que sofrem destas desordens são frequentemente associados com a presença de autoanticorpos contra os antígenos da tireoglobulina (Tg) e da tireoperoxidase (TPO). A Tg é uma glicoproteína homodimérica, de 660 kd, que funciona como pro-hormônio da tireoide. A TPO é uma enzima, de 105 kd, ligada a membrana, que catalisa a biossíntese dos hormônios da tireoide. A tiroxina e a tri-iodotironina são produzidas através da iodação catalisada pela TPO e ligadas às tirosinas homogênicas específicas. A determinação dos autoanticorpos contra a Tg e a TPO é importante no diagnóstico das doenças autoimunes da tireoide. Estes anticorpos podem ser medidos através de diversos métodos, como a imunofluorescência indireta, a hemaglutinação passiva, a quimioluminescência e o ELISA. O Imuno-ELISA Anti-TG da WAMA é um teste imunoenzimático para a determinação qualitativa ou semi-quantitativa de anticorpos anti-tireoglobulina no soro humano, para o diagnóstico de doenças autoimunes da tireoide. PRINCÍPIO DO MÉTODO As cavidades da placa de microtitulação são cobertas com antígenos purificados de Tg (fase sólida). Quando anticorpos anti-tg específicos estão presentes na amostra de soro, eles ligam-se às proteínas da fase sólida. O material não ligado é removido por lavagem. Um conjugado de anti-igg humana de cabra marcada com peroxidase se ligará aos anticorpos anti-tg presentes. Um substrato (TMB) é adicionado, cuja presença de anticorpos é detectada pela mudança de cor na reação. Uma solução stop para bloqueio da reação enzimática é adicionada e a absorbância da reação é então medida a 450 nm. A concentração de anticorpos é proporcional à intensidade da cor da reação. Os resultados são expressos em unidades internacionais por mililitro (UI/mL). APRESENTAÇÃO DO KIT R E F E - 96 determinações 1. Microplaca com cavidades cobertas com antígenos Tg purificados (12 tiras removíveis com 8 cavidades cada) 2. Solução de lavagem em pó (2 frascos) 3. Conjugado anti- IgG humana de cabra marcada com peroxidase (1 x 15 ml) 4. Substrato Cromógeno (TMB) (1 x 15 ml) 5. Diluente de Amostra (1 x 60 ml) 6. Solução Stop (1 x 15 ml) 7. Calibrador-Tg: A. 1 frasco, líquido, contendo 640 UI/mL de anti-tg (1 x 1,75 ml), B. 1 frasco, líquido, contendo 320 UI/mL de anti-tg (1 x 1,75 ml), C. 1 frasco, líquido, contendo 160 UI/mL de anti-tg (1 x 1,75 ml), D. 1 frasco, líquido, contendo 80 UI/mL de anti-tg (1 x 1,75 ml), E. 1 frasco, líquido, contendo 1 UI/mL de anti-tg (1 x 1,75 ml). 8. Soro Controle Negativo (1 x 1,75 ml) 9. Soro Controle Positivo (1 x 1,75 ml) 10. Instruções para uso R E F E determinações 1. Microplaca com cavidades cobertas com antígenos Tg purificados (24 tiras removíveis com 8 cavidades cada)

3 02 2. Solução de lavagem em pó (4 frascos) 3. Conjugado anti- IgG humana de cabra marcada com peroxidase (2 x 15 ml) 4. Substrato Cromógeno (TMB) (2 x 15 ml) 5. Diluente de Amostra (2 x 60 ml) 6. Solução Stop (2 x 15 ml) 7. Calibrador-dsDNA: A. 2 frascos, líquido, contendo 640 UI/mL de anti-tg (2 x 1,75 ml), B. 2 frascos, líquido, contendo 320 UI/mL de anti-tg (2 x 1,75 ml), C. 2 frascos, líquido, contendo 160 UI/mL de anti-tg (2 x 1,75 ml), D. 2 frascos, líquido, contendo 80 UI/mL de anti-tg (2 x 1,75 ml), E. 2 frascos, líquido, contendo 1UI/mL de anti-tg (2 x 1,75 ml). 8. Soro Controle Negativo (2 x 1,75 ml) 9. Soro Controle Positivo (2 x 1,75 ml) 10. Instruções para uso PREPARAÇÃO E ESTABILIDADE DOS REAGENTES MICROPLACA (1): Retirar do envelope a quantidade de tiras que serão usadas e deixá-las atingir a temperatura ambiente (20-25 ºC). As tiras que não forem utilizadas devem retornar ao envelope laminado, com dissecante, e mantidas entre 2-8ºC. SOLUÇÃO DE LAVAGEM (2): Dissolver o conteúdo (pó) de 1 frasco em 1000 ml de água destilada ou deionizada. Durante cada ciclo de lavagem, cada cavidade deve ser completada com aproximadamente 350µl. Manter entre 2-8ºC. Deixar atingir a temperatura ambiente (20-25 ºC) antes de usar. CONJUGADO ANTI-IgG HUMANA DE CABRA MARCADA COM PEROXIDASE (3): pronto para uso. Estável entre 2-8 ºC até a data do vencimento impressa na etiqueta do frasco. Não congelar. Deixar atingir a temperatura ambiente (20-25 ºC) antes de usar. SUBSTRATO CROMÓGENO (TMB) (4): solução estabilizada de tetrametilbenzidina. Pronta para uso. Estável entre 2-8 ºC até a data de vencimento impressa na etiqueta do frasco. Não congelar. Deixar atingir a temperatura ambiente (20-25 ºC) antes de usar. O TMB é não mutagênico e não carcinogênico. DILUENTE DE AMOSTRA (5): pronto para uso. Estável entre 2-8ºC até a data do vencimento impressa na etiqueta do frasco. SOLUÇÃO STOP (6): pronta para uso. Contém ácido sulfúrico (H2SO4). Manusear com cuidado. É corrosivo. Em caso de contato com a pele lavar abundantemente em água corrente. Deixar atingir a temperatura ambiente (20-25 ºC) antes de usar. Estável até a data do vencimento impressa na etiqueta do frasco. CALIBRADORES-Tg (7): pronto para uso. Produzido de soro humano contendo anti-tg. A concentração em UI/mL e a data de vencimento estão impressas na etiqueta de cada frasco. Contém conservante. Estável entre 2-8ºC. O uso do Calibrador-Tg é para determinar resultados semiquantitativos e valores em unidades internacionais. O Calibrador-Tg deve ser sempre utilizado em cada ensaio realizado. SORO CONTROLE NEGATIVO (8): pronto para uso. Soro humano negativo para Anti-Tg. Usar puro, ou seja, não diluído. Estável entre 2-8ºC até a data do vencimento impressa na etiqueta do frasco. Contém conservante. SORO CONTROLE POSITIVO (9): pronto para uso. Soro humano positivo para Anti-Tg. Usar puro, ou seja, não diluído. A concentração em UI/mL e a data do vencimento estão impressas na etiqueta do frasco. Contém conservante. Estável entre 2-8ºC. Obs.: O kit mantém o mesmo desempenho após a primeira utilização, e é estável até a data de validade descrita no rótulo, desde que mantido na temperatura indicada (2-8ºC). AMOSTRAS Usar amostra de soro livre de hemólise, lipemia e contaminação. A amostra pode ser conservada em geladeira entre 2-8 ºC por 48 horas. Para longo tempo, devem ser mantidas no freezer a -20 ºC. Amostras congeladas devem ser cuidadosamente homogeneizadas

4 03 antes do teste. Evitar a formação de espuma. Repetidos congelamentos e descongelamentos podem causar falsos resultados. MATERIAL NECESSÁRIO, MAS NÃO FORNECIDO Micropipeta de 5µl e 1000µl e ponteiras. Água deionizada para diluição do tampão de lavagem. Agitador de microplaca. Incubador com temperatura de 37 ºC. Leitor de microplaca com filtro de 450 nm. Lavadora de microplaca. Papel absorvente. Recipiente para descarte de material. PROCEDIMENTO IMPORTANTE: Medidas de absorbância bicromática usando um filtro de referência com comprimento de onda de 630 nm é recomendado quando disponível. Nesta condição, o uso do blank deve ser desconsiderado, uma vez que ele somente deve ser usado quando utilizado um único filtro de 450 nm. 1. De acordo com o plano estabelecido de distribuição na placa, usar 1 cavidade para o calibrador-tg (7), frasco D, se o resultado pretendido for qualitativo, ou 5 cavidades, frascos de A a E, se o resultado desejado for semi-quantitativo, 1 cavidade para o soro controle negativo (8) e 1 cavidade para o soro controle positivo (9). Usar 1 cavidade para o blank, a qual conterá somente 100 µl do diluente de amostra (5). 2. Preparar diluição das amostras a serem testadas a 1:101 (5 µl da amostra µl do diluente de amostra (5). 3. Dispensar 100µl dos calibradores-tg (7), soro controle negativo (8), soro controle positivo (9) e amostras (1:101) nas cavidades da microplaca. Usar uma cavidade para o blank se a leitura for monocromática, dispensando nesta 100µl do diluente de amostra (5). Usar ponteiras individuais para cada pipetagem, evitando com isso contaminação. 4. Homogeneizar levemente, batendo com os dedos nas bordas da placa, ou por vibração mecânica (agitador de placa) por 30 segundos. 5. Cobrir a placa com folha adesiva e incubar a temperatura ambiente por 30 minutos. 6. Descartar o conteúdo da microplaca dentro de um recipiente contendo solução desinfetante, tendo o cuidado de evitar contaminação entre as cavidades. 7. Lavar a placa 4 vezes com a solução de lavagem (2) (ver Preparação e Estabilidade dos Reativos). Aspirar o conteúdo da microplaca, dispensar 350µl de solução de lavagem (2) em cada cavidade, aguardar 30 segundos e esvaziar o conteúdo das cavidades. Repetir 3 vezes este procedimento (total de 4 ciclos). Recomenda-se o uso de uma lavadora de microplaca manual ou automática. ATENÇÃO: O correto procedimento de lavagem é fundamental para uma boa performance do ensaio. 8. Após a última lavagem, inverter a placa e batê-la sobre papel absorvente para remover todo o líquido residual. 9. Dispensar 100µl do conjugado (3) em todas as cavidades, exceto no blank. 10. Cobrir a placa com folha adesiva e incubar a temperatura ambiente por 30 minutos. 11. Repetir as etapas 6 a Dispensar 10µl do substrato cromógeno (TMB) (4) em cada cavidade da microplaca, exceto no blank. Homogeneizar levemente, batendo com os dedos nas bordas da placa ou por agitação mecânica (agitador de placa) por 30 segundos. 13. Incubar a temperatura ambiente por 30 minutos, protegendo da luz. 14. Bloquear a reação dispensando 100µl da solução stop (6) em cada cavidade da microplaca, exceto no blank. Homogeneizar levemente, batendo com os dedos nas bordas da placa ou por agitação mecânica (agitador de placa) por 30 segundos. 15. Ler a absorbância (D.O.) em um leitor de microplaca com filtro de 450 nm, contra o blank, dentro de 30 minutos. NOTA: recomenda-se usar um duplo comprimento de onda utilizando um filtro de referência de 630 nm quando disponível.

5 04 IMPORTANTE: O procedimento de lavagem é crítico para o desempenho do teste. Lavagens insuficientes resultarão leituras pouco precisas ou absorbâncias falsamente elevadas. A realização dos testes em duplicata, embora não obrigatória, é recomendada. O tempo levado para pipetagem das amostras e controles não deve exceder 30 minutos. RESUMO DO PROCEDIMENTO 1. Pipetar 100µl do calibrador-tg (7), controle negativo (8), controle positivo (9), amostras (1:101) e blank (leitura monocromática) nas respectivas cavidades. 2. Homogeneizar por 30 segundos e incubar a T.A. por 30 minutos. 3. Descartar o conteúdo da microplaca dentro de um recipiente contendo solução desinfetante e lavar 4 vezes com solução de lavagem (2). 4. Descartar completamente o conteúdo da última lavagem, removendo todo o líquido residual. 5. Pipetar 100µl do conjugado (3) em cada cavidade da placa, exceto blank. 6. Homogeneizar por 30 segundos e incubar a T.A. por 30 minutos. 7. Repetir as etapas 3 e Pipetar 100µl do substrato cromógeno (4) em cada cavidade da placa, exceto no blank. Haverá mudança na cor da reação onde houver peroxidase. 9. Homogeneizar por 30 segundos e Incubar a T.A. por 30 minutos. Protegendo da luz 10. Pipetar 100µl da solução stop (6) em cada cavidade da microplaca. 11. Homogeneizar por 30 segundos. 12. Ler a D.O. em um leitor de microplaca com filtro de 450 nm contra o blank, ou um duplo comprimento de onda (450/630 nm), dentro de 30 minutos. A B C D E F G H A B C D E F G H EXEMPLO DE ESQUEMA DE DISTRIBUIÇÃO NA MICROPLACA DETERMINAÇÃO QUALITATIVA 1 Blank Controle neg. Controle pos. Calibrador D A1 A2 A3 A4 2 A5 A6 A7 A8 A9 A EXEMPLO DE ESQUEMA DE DISTRIBUIÇÃO NA MICROPLACA DETERMINAÇÃO SEMI-QUANTITATIVA 1 Blank Controle neg. Controle pos. Calibrador A Calibrador B Calibrador C Calibrador D Calibrador E 2 A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 3 A9 A10 A11 A CÁLCULOS DOS RESULTADOS Determinar para cada teste e soros controles a densidade óptica (D.O.), cujo valor final é obtido subtraindo da leitura da D.O. do blank. Se duplo comprimento de onda é usado o blank é omitido e, portanto, as leituras das D.Os. são usadas sem subtração. Se mais do que uma microplaca é utilizada elas deveriam ser consideradas separadamente para cálculos e interpretação dos resultados.

6 05 A determinação da concentração das amostras pode ser determinada através de um dos seguintes métodos: 1. Determinação Qualitativa D.O da Amostra x UI/mL do Calibrador D = UI/mL da Amostra D.O do Calibrador D Atenção: Recomenda-se que os resultados qualitativos sejam informados como REAGENTES ou NÃO REAGENTES. As amostras com resultados superiores ou iguais ao Calibrador D são consideradas Reagentes. 2. Determinação Semi-Quantitativa Plotar as D.Os. e concentrações dos Calibradores de A a E em papel linear-log, plotando as concentrações em UI/mL no eixo X e as D.Os. no eixo Y, traçando uma curva que ligue os pontos determinados. A concentração da amostra em UI/mL é obtida plotando a D.O. da amostra desconhecida no eixo Y e traçando o ponto de intersecção na Curva de Calibração, cuja concentração será o valor correspondente no eixo X em UI/mL. 2,5 2 1,5 D.O 1 0,5 0-0, UI/mL Importante: Alternativamente, pode-se usar uma curva de calibração de 4 pontos, descartando-se o calibrador Ant - TG. Os resultados semi-quantitativos são reportados em UI/mL, devendo os borderline ( UI/mL) serem retestados. Amostras com valores elevados, superiores ao calibrador anti- TG, devem ser diluídas e retestadas, cujo resultado final em UI/mL é obtido após multiplicar pelo fator de diluição. VALIDAÇÃO DO TESTE: O teste é válido se: A D.O. do blank, que contém somente o diluente de amostra, deve ser menor do que 0,3 a 450nm. O valor da D.O. do Calibrador-Tg A deve ser igual ou superior a 1,0, caso contrário o teste deve ser repetido. A concentração do controle negativo deve ser inferior a 40 UI/mL. Quando se realiza determinação qualitativa, a D.O. do Calibrador-Tg D deve ser superior à D.O. do controle negativo e inferior à D.O. do controle positivo. Para as determinações semi-quantitativas, o controle positivo deve apresentar valores na faixa indicada na etiqueta do frasco.

7 06 INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS Para a interpretação dos resultados sugere-se a seguinte referência: Valores de Anticorpos Anti -TG Interpretação < 80 UI/mL Resultado Negativo UI/mL Resultado Borderline > 100 UI/mL Resultado Positivo IMPORTANTE: 1. Os valores acima servem apenas como orientação para a interpretação dos resultados. É recomendável que cada laboratório determine seus próprios valores de referência. VALORES ESPERADOS Os valores esperados numa população normal são negativos. No entanto, 5-10% de indivíduos aparentemente saudáveis e assintomáticos podem apresentar resultados positivos para autoanticorpos da tireoide. A incidência destes auto-anticorpos aumenta com a idade. O quadro abaixo mostra a incidência de auto-anticorpos da tireoide em indivíduos normais e em diversas doenças autoimunes. Condição Nº de Indivíduos Nº de Positivos % de Positivos Doença de Graves ,7% Tireoidite de Hashimoto ,9% Suspeita de Doenças da Tireoide ,4% Perda Autoimune da Audição ,0% Artrite Reumatóide ,5% Lupus Eritematoso Sistêmico 2 0 0,0% Indivíduos Saudáveis Normais ,8% Os anticorpos anti-tireoglobulina ocorrem principalmente nas doenças de Graves e de Hashimoto. Estes auto-anticorpos podem igualmente ocorrer no bócio nodular tóxico e em associação com outros distúrbios autoimunes, como o LES. SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE DO TESTE Em um estudo realizado com 121 amostras de soro obtidas de um Laboratório de referência, das quais 57 eram positivas e 64 negativas foram determinadas a sensibilidade e especificidade do kit Imuno- ELISA Anti-Tg da WAMA em comparação com o Kit comercial. Sensibilidade = Verdadeiros Positivos / (Verdadeiros Positivos + Falsos Negativos) x 100 Especificidade = Verdadeiros Negativos / (Verdadeiros Negativos + Falsos Positivos) x 100 Verdadeiros Positivos Falsos Positivos Verdadeiros Negativos Falsos Negativos Sensibilidade (%) Especificidade (%) RESULTADO ,75 Foi também estudado a reatividade cruzada em indivíduos portadores de outras doenças autoimunes ou reagentes para auto-anticorpos, cujos resultados são mostrados no quadro abaixo: Condição Nº de Pacientes Nº de Reagentes Perda Autoimune da Audição 10 0 Artrite Reumatóide 18 1 Lupus Eritematoso Sistêmico 2 0 TOTAL 30 1 (3,3%)

8 07 PRECISÃO DO TESTE a. Precisão Intra-Ensaio A precisão intra-ensaio foi determinada ensaioando 2 amostras de soros, uma reagente e outra não reagente, em 20 replicatas. Amostras Número de Vezes Média UI/ml Desvio Padrão Reagente ,28 7,58 Não Reagente 20 25,47 1,56 CV (%) 5,37% 6,12 % b. Precisão Inter-Ensaio A precisão inter-ensaio foi determinada ensaiando 2 amostras de soros, uma reagente e outra não reagente, em 20 replicatas, sendo 10 replicas para cada lote estudado e por operadores diferentes. Amostras Número de Vezes Reagente 20 Não Reagente 20 Média UI/ml Desvio Padrão CV (%) 140,40 8,01 5,71% 25,13 1,66 6,62 % LINEARIDADE A linearidade do Imuno-ELISA Anti-TG é 12,6 640 UI/mL. Sugere-se que amostras com valores superiores a concentração do calibrador-tg A sejam diluídas e retestadas. O resultado final é determinado pela multiplicação do valor obtido pelo fator de diluição. LIMITE DE DETECÇÃO O limite de detecção do teste foi determinado como de 12,6 UI/mL com base em 60 replicatas do blank e 10 replicatas de cada uma de seis amostras com baixos níveis de anticorpos. ESPECIFICADADE ANALÍTICA Não foi demonstrada interferência significativa para as seguintes substâncias nas concentrações indicadas: Hemoglobina (até 2g/L), Bilirrubina (até 342 µmol/l) e Fator Reumatóide (até 100 UI/mL), Colesterol (até 13 mmol/l) e Triglicérides ( até 37 mmol/l). LIMITAÇÕES DE USO O teste Imuno-ELISA Anti-TG da WAMA foi desenvolvido para se obter a mais alta sensibilidade e especificidade. Entretanto, devido à possibilidade de falsos resultados reagentes e interferência com outras doenças, resultados repetidamente reagentes devem ser sempre interpretados com as informações clínicas do paciente e com os resultados de outros testes laboratoriais. Amostras reagentes que se tornam não reagentes quando retestadas devem ser consideradas não reagentes. Devido à alta sensibilidade dos testes ELISA, falsos resultados reagentes podem ocorrer por várias razões, muitas das quais estão relacionadas, mas não limitadas, à inadequada etapa de lavagem. A prevalência da doença na população avaliada afetará o valor preditivo do teste. PRECAUÇÕES E ADVERTÊNCIAS 1. Os reagentes devem ser conservados entre 2-8 ºC. 2. A data de validade corresponde ao último dia do mês assinalado nos rótulos dos frascos e da caixa do kit. 3. Deve ser evitado expor os reagentes a temperaturas elevadas, bem como diretamente ao sol. 4. Não congelar nenhum reagente, pois isto causará deterioração irreversível. 5. O Imuno-ELISA Anti-TG contém materiais de origem humana, os quais foram testados, com resultados negativos para anticorpos anti-hiv I e II, anti-hcv e antígeno de superfície da Hepatite B (HBsAg). Porém, como nenhum método diagnóstico oferece completa segurança da ausência destes e de outros agentes infecciosos, recomenda-se tratar os reagentes como material potencialmente infeccioso, bem como ter o mesmo cuidado no descarte destes materiais. 6. Não utilizar reagentes ou microplacas de lotes diferentes. 7. Deixar os reagentes adquirirem a temperatura ambiente (20-25 ºC) antes de iniciar os testes.

9 08 8. Os reagentes devem ser homogeneizados levemente por inversão e tampados imediatamente após o uso. 9. Não deixar as cavidades da microplaca secarem durante o ensaio. 10. Evitar repetidas pipetagem dos reagentes estoques, pois isso pode causar contaminação. 11. As amostras a serem testadas e os soros controles devem ser utilizados ao mesmo tempo para manter as mesmas condições do teste. 12. Não usar reagentes após a data de validade. 13. Não reutilizar qualquer um dos reagentes. 14. Descartar o material conforme regulamentações locais. 15. Utilizar as Boas Práticas de Laboratórios (BPLs) na conservação, manuseio e descarte dos materiais TERMO DE GARANTIA A WAMA Diagnóstica garante a troca deste conjunto diagnóstico, desde que o mesmo esteja dentro do prazo de validade e que seja comprovado por sua assessoria técnica que não houve falhas na execução, manuseio e conservação deste produto. A WAMA e seus distribuidores não se responsabilizarão por falhas no desempenho do kit sob essas condições. ENGLISH SUMMARY The clinical spectrum of autoimmune diseases of the thyroid is broad, where the affected patient may be hyper, hypo or even euthyroid. There are two main forms of autoimmune disorders of the thyroid gland, the Graves' disease and Hashimoto's thyroiditis. The autoimmune reactions can also occur in other changes, such as sporadic goiter and the endemic, the disease of Plummer and the endocrine ophthalmopathy. Patients who suffer from these disorders are often associated with the presence of autoantibodies against the thyroglobulin antigens (Tg) and thyroperoxidase (TPO). The Tg is a homodimeric glycoprotein, 660 kd, that acts as pro-hormone of the thyroid gland. The TPO is an enzyme, 105 kd, linked to the membrane, which catalyzes the biosynthesis of thyroid hormones. The thyroxine and triiodothyronine are produced through the iodination catalyzed by the TPO and linked the specific homogenic tyrosine. The determination of autoantibodies against the Tg and TPO is important in the diagnosis of autoimmune diseases of the thyroid gland. These antibodies can be measured by various methods, such as the indirect immunofluorescence, the passive hemagglutination, the chemiluminescence and the ELISA. The Imuno-ELISA Anti-TG from WAMA is an enzyme immunoassay test for the qualitative or semiquantitative determination of anti-thyroglobulin antibody in human serum for the diagnosis of autoimmune diseases of the thyroid gland. PRINCIPLE OF THE METHOD The microtiter wells of the plate are covered with purified Tg antigen (solid phase). When specific anti- TG antibodies are present in the serum sample, they bind to proteins from the solid phase. Material not bound is removed by washing. A goat anti-human IgG conjugated to peroxidase will bind to the anti-tg antibodies present. A substrate (TMB) is added, which detects the presence of antibodies through the change of color in the reaction. A stop solution to block the enzymatic reaction is added and the reaction absorbance is measured at 450 nm. The concentration of antibodies is directly proportional to the intensity of the reaction color. The results are expressed as international units per milliliter (IU/mL). KIT PRESENTATION R E F E - 96 determinations 1. Microplate with wells coated with purified TG antigen (12 removable strips with 8 wells each) 2. Washing solution - powder (2 bottles) 3. Goat anti-human IgG conjugate marked with peroxidase (1 x 15 ml)

10 09 4. Chromogen Substrate (TMB) (1 x 15 ml) 5. Sample Diluent (1 x 60 ml) 6. Stop Solution (1 x 15 ml) 7. Tg Calibrator: A. 1 bottle, liquid, containing 640 IU/mL of anti-tg (1 x 1.75 ml), B. 1 bottle, liquid, containing 320 IU/mL of anti-tg (1 x 1.75 ml), C. 1 bottle, liquid, containing 160 IU/mL of anti-tg (1 x 1.75 ml), D. 1 bottle, liquid, containing 80 IU/mL of anti-tg (1 x 1.75 ml), E. 1 bottle, liquid, containing 1 IU/mL of anti-tg (1 x 1.75 ml), 8. Negative Serum Control (1 x 1.75 ml) 9. Positive Serum Control (1 x 1.75 ml) 10. Instructions for use R E F E determinations 1. Microplate with wells coated with purified Tg antigen (24 removable strips with 8 wells each) 2. Washing solution - powder (4 bottles) 3. Goat anti-human IgG conjugate marked with peroxidase (2 x 15 ml) 4. Chromogen Substrate (TMB) (2 x 15 ml) 5. Sample Diluent (2 x 60 ml) 6. Stop Solution (2 x 15 ml) 7. Tg Calibrator: A. 2 bottles, liquid, containing 640 IU/mL of anti-tg (2 x 1.75 ml), B. 2 bottles, liquid, containing 320 IU/mL of anti-tg (2 x 1.75 ml), C. 2 bottles, liquid, containing 160 IU/mL of anti-tg (2 x 1.75 ml), D. 2 bottles, liquid, containing 80 IU/mL of anti-tg (2 x 1.75 ml), E. 2 bottles, liquid, containing 1 IU/mL of anti-tg (2 x 1.75 ml), 8. Negative Serum Control (2 x 1.75 ml) 9. Positive Serum Control (2 x 1.75 ml) 10. Instructions for use REAGENT PREPARATION AND STABILITY MICROPLATE (1): Remove from the envelope the strips that will be used, and allow it to reach room temperature (20 25 C). The strips that will not be used must be returned to the sealing envelope, with desiccant, and kept at 2 8 C. WASH SOLUTION (2): Dissolve the contents (powder) of 1 bottle in 1000 ml of distilled or deionized water. During each wash cycle, each well must be washed filled with approximately 350µl. Keep at 2-8ºC. Allow it to reach room temperature (20 25 C) before using it. GOAT ANTI-HUMAN IgG LABELED WITH PEROXIDASE (3): ready for use. Stable at 2 8 C up to the expiration date printed on the bottle. Do not freeze. Allow it to reach room temperature (20 25 C) before using it. CHROMOGEN SUBSTRATE (TMB) (4): solution stabilized with Tetramethyl Benzidine. Ready to use. Stable at 2 8 C until expiration date printed on the bottle. Do not freeze. Allow it to reach room temperature (20 25 C) before using it. The TMB is not mutagenic and not carcinogenic. SAMPLE DILUENT (5): ready for use. Stable at 2 8 C up to the expiration date printed on the bottle. STOP SOLUTION (6): ready to use. Contains sulfuric acid (H2SO4). Handle with care. Corrosive. On skin contact, immediately flush with large amounts of water. Allow it to reach room temperature (20 25 C) before using it. Stable at until expiration date printed on the bottle. Tg CALIBRATORS (7): ready to use. Made from human sera containing anti-tg. The concentration in IU/mL and the expiration date are printed on the label of each bottle. Contains preservative. Stable at 2-8 C. The use of Tg Calibrator is to determine semi-quantitative results and the values in International Units. The T Calibrator must always be used in each test performed. NEGATIVE SERUM CONTROL (8): ready for use. Negative human serum to Anti-Tg. Use it as is (do not dilute it). Stable at 2 8 C up to the expiration date printed on the bottle. Contains preservative. POSITIVE SERUM CONTROL (9): ready to use. Positive human serum to Anti-Tg. Use it as is (do not dilute it). The concentration in IU/mL and the expiration date are printed on the label of the bottle. Contains preservative. Stable at 2-8 C.

11 10 Note.: The kit has the same performance after first use, and is stable until the expiration date described on the label if it is kept in the indicated temperature (2-8 C). SPECIMENS Use serum specimens not hemolysed, lipemic or contaminated. The sample can be stored covered in refrigerator at 2-8 C for 48 hours. For long-term storage, serum or plasma must be kept in the freezer at 20ºC. Frozen specimens must be carefully homogenized before testing. Avoid making foam. Avoid repeated freeze and thawing as this may lead to false results. MATERIAL REQUIRED BUT NOT PROVIDED Micropipette of 5 μl and 1000 µl and tips. Deionized water for dilution of the wash buffer Microplate shaker. Incubator at 37 C. Microplate reader with 450nm filter. Microplate washer. Absorbent paper. Container for material disposal PROCEDURE IMPORTANT: Bichromatic absorbance measurements using reference filter with wavelength of 630 nm is recommended when available. In this condition, the use of "blank" should be disregarded, since it should be used only when using a 450 nm single filter. 1. In accordance with the established plan of distribution on the plate, use 1 well for the Tg-calibrator (7), bottle D, if the desired result is qualitative, or 5 wells, bottles A to E, if the desired result is semiquantitative, 1 well for the negative serum control (8) and 1 well for the positive serum control (9). Use 1 well for the "blank", which will contain only 100 µl of the sample diluent (5). 2. Prepare dilution of samples to be tested at 1:101 (5 µl of sample µl of the sample diluent (5)). 3. Pipette 100µl of the Tg calibrator (7), serum negative control (8), serum positive control (9) and samples (1:101) in the wells of the microtitre plate. Use a well for the "blank" if the reading is monochromatic, dispensing 100µl of the sample diluent (5).Use individual tips for each sample, to avoid contamination. 4. Gently homogenize the samples, by holding the plate on the edges and shaking it for 30 seconds or use a microtiter plate shaker. 5. Cover the plate with adhesive foil and incubate at room temperature for 30 minutes. 6. Discard the contents of the plate into a container with disinfecting solution carefully, to avoid contamination between the cavities. 7. Wash the plate 4 times with the Wash Solution (2) (see Preparation and Stability of Reagents). Aspirate the contents of the plate, dispense 350µl of the Wash Solution (2) in each well, wait 30 seconds, and empty the contents of the wells. Repeat this procedure 3 times (total of 4 cycles). We recommend using a microplate washer (manual or automatic). WARNING: The correct washing procedure is essential for good performance of the test. 8. After the last wash, turn the plate over and tap it dry on absorbent paper to remove any residual liquid. 9. Pipete 100µl of the conjugate (3) in all the cavity wells, except on the blank. 10. Cover the plate with adhesive foil and incubate at room temperature for 30 minutes. 11. Repeat the steps 6 to Pipete 100µl of the chromogen substrate (TMB) (4) into each of the cavity wells, except on the blank. Gently homogenize the samples, by holding the plate on the edges and shaking it or use a microtiter plate shaker for 30 seconds. 13. Incubate at 37 C for 30 minutes,protecting from light. 14. Block the reaction by dispensing 100µl of the Stop Solution (6) in each well of the microplate, including the blank. Gently homogenize the samples, by holding the plate on the edges and shaking it or use a microtiter plate shaker for 30 seconds. 15. Read the abosrbance (O.D.) in a microplate reader with 450 nm filter, against the blank within 30 minutes.

12 11 NOTE: it is recommended to use a dual wavelength using a reference filter of 630 nm when available. IMPORTANT: The wash procedure is critical for the performance of the test. Insufficient washing will result in inaccurate readings or falsely elevated absorbance. Performing the tests in duplicate, though not required, is recommended. The pipetting time for the specimens and controls should not exceed 30 minutes. SUMMARY OF THE PROCEDURE 1. Pipette 100 µl of the Tg calibrator (7), negative control (8), positive control (9), samples (1:101) and "blank" (monochrome reading) in their respecitve cavities. 2.Mix for 30 seconds and incubate at room temperature for 30 minutes. 3.Discard the contents of the microplate within a container containing disinfectant solution and wash 4 times with wash solution (2). 4.Completely discard the contents of the last wash, removing any residual liquid. 5.Pipette 100µl of enzyme conjugate (3) in each well of the plate, except blank. 6.Mix for 30 seconds and incubate at room temperature for 30 minutes. 7.Repeat the steps 3 and 4. 8.Pipete 100µl of the chromogen substrate (4) into each of the cavity wells, except on the blank. Change in reaction color will occur wherever peroxidase is found. 9.Mix for 30 seconds and incubated at room temperature for 30 minutes. Protected from light 10.Pipette 100µl of the Stop Solution (6) in each well of the microplate. 11.Mix for 30 seconds. 12.Read the OD in a microplate reader with a 450 nm filter against the blank, or in a double wavelength (450/630 nm), within 30 minutes. A B C D E F G H EXAMPLE OF THE DISTRIBUTION DIAGRAM OF MICROPLATE QUALITATIVE DETERMINATION 1 Blank Neg. Control Pos. Control Calibrator D A1 A2 A3 A4 2 A5 A6 A7 A8 A9 A EXAMPLE OF THE DISTRIBUTION DIAGRAM OF MICROPLATE SEMI - QUANTITATIVE DE TERMINATION A Blank A1 A9 B Neg. Control A2 A10 C Pos. Control A3 A11 D Calibrator A A4 A12 E Calibrator B A5 F Calibrator C A6 G Calibrator D A7 H Calibrator E A8

13 12 CALCULATION OF RESULTS Determine the optical density (OD) for each test and control serum. whose the final value is obtained by subtracting the blank from the OD. If double wavelength is used, the blank is ommited, therefore, the the O.D readings are used without subtracting. If more than one microplate is used they should be considered separately for calculation and interpretation of results. The determination of the concentration of the samples can be determined by one of the following methods: 1.Qualitative Determination O.D of the Sample x IU/mL of Calibrator D = IU/mL of the Sample O.D. of the Calibrator D Warning: It is recommended that the qualitative results are reported as "REACTIVE" or "NOT REACTIVE". The samples with results greater or equal to the D calibrator are considered Reactive. O.D 2,5 2 1,5 1 0,5 0-0, IU/mL IMPORTANT: Alternatively, you can use a 4 point calibration curve, discarding the E Tg calibrator. The semi-quantitative results are reported in IU/mL, and the "borderline" ( IU/mL) should be re-tested. Samples with elevated values, greater than the A Tg calibrator, should be diluted and re-tested, whose final result in IU/ml is obtained after multiply by the dilution factor. TEST VALIDATION: The test is valid if: The O.D of the blank,which contains only the sample diluent, mus be less than 0.3 at 450 nm. The value of O.D. of the A Tg-Calibrator must be equal to or greater than 1.0, otherwise the test must be repeated. The concentration of negative control must be less than 40 IU/mL. When the qualitative determination in performed, the O.D. of the Tg D Calibrator must be greater than the O.D. of the negative control and lower the O.D. of the positive control. For the semi-quantitative determinations, the positive control must have values in the range indicated on the label of the bottle. INTERPRETATION OF THE RESULTS For the interpretation of the results, it's recommended the following reference range: Anti-TG Antibody Values < 80 IU/ml IU/ml > 100 IU/ml Interpretation Negative Result Borderline Result Positive Result

14 13 IMPORTANT: 1. The above values are provided only as guidance for the interpretation of results. It is recommended that each laboratory establish its own reference range. EXPECTED VALUES The values expected in a normal population is negative. However, 5-10% of apparently healthy and asymptomatic patients can show positive results for auto-antibodies against the thyroid gland. The incidence of these auto-antibodies increases with age. The table below shows the incidence of auto-antibodies against the thyroid gland in normal individuals and in several autoimmune diseases. Condition Number of Patientes Number of Positives % of Positives Graves' disease % Hashimoto's thyroiditis % Suspicion of Thyroid Diseases % Autoimmune Hearing Loss % Rheumatoid arthritis % Systemic Lupus Erythematosus % Normal Healthy Individuals % The anti-thyroglobulin antibodies occur mainly in Grave's disease and Hashimoto's thyroiditis. This auto-antibody can also occur in toxic nodular goiter and in association with other autoimmune disorders, such as the SLE. SENSITIVITY AND SPECIFICITY OF THE TEST In a study conducted with 121 samples of serum obtained from a reference laboratory, of which 57 were positive and 64 negative, the sensitivity and specificity were determined for the Imuno-ELISA Anti- TG from WAMA in comparison to the commercial Kit. Sensitivity = True Positive / (True Positive + False Negative) x 100 Specificity = True Negative / (True Negative + False Positive ) x 100 True Positives False Positives True Negatives False Negatives Sensitivity (%) Especificity (%) RESULTS Cross-reactivity was also studied in individuals carrier of other autoimmune diseases or reactive to auto-antibodier, whose results are shown in the table below: Condition Number of Patients Number of Reagents Autoimmune Hearing Loss 10 0 Rheumatoid arthritis 18 1 Systemic Lupus Erythematosus 2 0 TOTAL 30 1 (3.3%) PRECISION OF THE TEST: a.intra-assay Precision The intra-assay precision was determined by assaying 2 samples of sera, one reactive and one nonreactive, in 20 replicates.

15 14 Specimens Number of times. Average IU/ml Deviation Standard CV (%) Reagent % Non-Reactive % b. Inter-Assay Precision The inter-assay precision was determined by assaying 2 serum samples, one reactive and another not reactive, in 20 replications, being 10 replicas for each lot and by different operators. Specimens Number of times. Average IU/ml Deviation Standard CV (%) Reagent % Non-Reactive % LINEARITY The linearity of the Imuno-ELISA Anti-TG is IU/mL. It is recommended for samples with values greater than the concentration of the A Tg calibrator be diluted and retested. The final result is determined by multiplying the value obtained by the dilution factor. DETECTION LIMIT The detection limit for the test was determined as of 12.6 IU/mL based on 60 replicates of blank and 10 replicates for each one of six samples with low levels of antibodies. ANALYTICAL SPECIFICITY It was not demonstrated significant interference for the following substances at the indicated concentrations: Hemoglobin (up to 2g/L), bilirubin (up to 342 µmol/l) and Rheumatoid Factor (up to 100 EU/mL), cholesterol (up to 13 mmol/l) and trygliceryde (up to 37 mmol/l). LIMITATIONS OF USE The test Imuno- ELISA Anti-TG from WAMA was developed to obtain the highest sensitivity and specificity. However, due to the possibility of false results reagents and interference with other diseases, results repeatedly reactive should always be interpreted with clinical information from the patient and with the results of other laboratory tests. Reactive samples that become non-reactive when retested must be considered not reactive. Due to the high sensitivity of the ELISA tests, false reactive results may occur due to various reasons, many of which are related, but not limited to, improper washing step. The prevalence of the disease in the evaluated population will affect the predictive value of the test. PRECAUTIONS AND WARNINGS 1. The reagents should be kept between 2-8 ºC. 2. The expiry date refers to the last day of the month indicated on the labels of the vial and of the kit box. 3. Avoid exposing the reagents to high temperatures and direct sunlight. 4. Do not freeze the reagent, as this may cause irreversible damage. 5. The Imuno-ELISA Anti-TG contains materials of human origin, which have been tested, with negative results for anti-hiv I and II antibodies, anti-hcv and Hepatitis B surface antigen virus (HBsAg). However, as no diagnostic method offers complete safety, in the absence of these and other infectious agents, it is recommended to treat all the reagents as potentially infectious materials, as well as having the same care when disposing these materials. 6. Do not use reagents or microplates fof different batches. 7. Allow the reagents to reach the room temperature (20-25ºC) before starting the test. 8. The reagents should be homogenized gently by inversion and capped immediately after use. 9. Do not let the wells of microtiter plates dry during the test. 10. Avoid repeated pipetting the reagents,because this could cause contamination. 11. The samples to be tested and the serum controls should be used at the same time to maintain the

16 15 same test conditions. 12. Do not use the reagent after the expiration date. 13. Do not it reuse any one of the reagents. 14. Discard the material following local regulations. 15. Use the Good Laboratory Practices (GLPs) in storage, handling and disposal of materials. WARRANTY WAMA Diagnóstica guarantees the exchange of the diagnostic kit, provided it is within the expiration date and is proven by its technical support that there were no technical mistakes in the execution, handling and storage of this product. WAMA and its distributors are not liable for failures on the performance of the kits under these conditions ESPAÑOL IMPORTANCIA CLÍNICA Lo espectro clínico de las enfermedades autoinmunes de la tiroides es vasto, donde el paciente afectado puede ser hiper, hipo o incluso eutiroideos. Existen dos formas principales de trastornos autoinmunes de la tiroides, la enfermedad de Graves y la tiroiditis de Hashimoto. Las reacciones autoinmunes también puede ocurrir en otras modificaciones, como bocio esporádico y la endémica, la enfermedad de Plummer y la oftalmopatía endocrina. Los pacientes que sufren estos trastornos con frequencia se asocia con la presencia de autoanticuerpos contra la tiroglobulina (Tg) y peroxidasa tiroidea (TPO). La Tg es una glicoproteína homodimérica, 660 kd, que actúa como pro-hormona de la glándula tiroides. La TPO es una enzima, de 105 kd, vinculado a la membrana, que cataliza la biosíntesis de las hormonas tiroideas. La tiroxina y triyodotironina se producen a través de la iodación catalizada por la TPO y vinculado a tirosina homogenica especifica. La determinación de autoanticuerpos contra la Tg y TPO es importante en el diagnóstico de las enfermedades autoinmunes de la tiroides. Estos anticuerpos pueden ser medidos por diversos métodos, tales como la inmunofluorescencia indirecta, la hemaglutinación pasiva, la quimioluminiscencia y el ELISA. La Imuno-ELISA Anti-TG de WAMA es un inmunoensayo enzimático para la determinación cualitativa o semi-cuantitativa de anticuerpos anti-tiroglobulina en el suero humano para el diagnóstico de enfermedades autoinmunes de la tiroides. PRINCIPIO DEL MÉTODO Los pocillos de la placa de microtitulación se recubren con antígeno purificado de Tg (fase sólida). Cuando anticuerpos especificos anti-tg están presentes en la muestra de suero, se ligan a las proteínas de la fase sólida. El material no ligado se elimina mediante lavado. Un conjugando anti-igg humana de cabra marcado con peroxidasa se liga a los anticuerpos anti-tg. Un sustrato (TMB) es adicionado, el cual detecta la presencia de anticuerpos a través del cambio de color en la reacción. Una solución stop para bloquear la reacción enzimática es adicionada y se mide la absorbancia de la reacción a 450 nm). La concentración de anticuerpos es directamente proporcional a la intensidad de la reacción. Los resultados se expresan en unidades internacionales por mililitro (UI/mL). PRESENTACIÓN DEL KIT R E F E - 96 determinaciones 1. Microplacas con pocillos recubiertos con antígenos TG purificados (12 tiras extraíbles con 8 pocillos cada uno) 2. Solución de lavado: en polvo (2 botellas) 3. Conjugado anti-igg humana de cabra marcada con peroxidasa (1 x 15 ml) 4. Sustrato Cromógeno (TMB) (1 x 15 ml) 5. Diluyente de Muestra (1 x 60 ml) 6. Solución Stop (1 x 15 ml) 7. Calibrador Tg: A. 1 botella, líquido, que contiene 640 UI/mL de anti-tg (1 x 1,75 ml),

17 16 B. 1 botella, líquido, que contiene 320 UI/mL de anti-tg (1 x 1,75 ml), C. 1 botella, líquido, que contiene 160 UI/mL de anti-tg (1 x 1,75 ml), D. 1 botella, líquido, que contiene 80 UI/mL de anti-tg (1 x 1,75 ml), E. 1 botella, líquido, que contiene 1 UI/mL de anti-tg (1 x 1,75 ml), 8. Suero control negativo (1 x 1,75 ml) 9. Suero control positivo (1 x 1,75 ml) 10. Instrucciones de uso R E F E determinaciones 1. Microplacas con pocillos recubiertos con antígenos Tg purificados (24 tiras extraíbles con 8 pocillos cada uno) 2. Solución de lavado: en polvo (4 botellas) 3. Conjugado anti-igg humana de cabra marcada con peroxidasa (2 x 15 ml) 4. Sustrato Cromógeno (TMB) (2 x 15 ml) 5. Diluyente de Muestra (2 x 60 ml) 6. Solución Stop (2 x 15 ml) 7. Calibrador Tg: A. 2 botella, líquido, que contiene 640 UI/mL de anti-tg (2 x 1,75 ml), B. 2 botella, líquido, que contiene 320 UI/mL de anti-tg (2 x 1,75 ml), C. 2 botella, líquido, que contiene 160 UI/mL de anti-tg (2 x 1,75 ml), D. 2 botella, líquido, que contiene 80 UI/mL de anti-tg (2 x 1,75 ml), E. 2 botella, líquido, que contiene 1 UI/mL de anti-tg (2 x 1,75 ml), 8. Suero control negativo (2 x 1,75 ml) 9. Suero control positivo (2 x 1,75 ml) 10. Instrucciones de uso PREPARACIÓN DE REACTIVOS Y ESTABILIDAD MICRO PLACA (1): Retirar de la sobre la cantidad de tiras que se utilizarán, y dejar que alcancen a temperatura ambiente (20-25 C). Las tiras que no se utilicen deben regresar al sobre laminado, con desecante, y se mantendrá a 2-8 C. SOLUCIÓN DE LAVADO (2): Disolver el contenido (en polvo) de 1 botella en 1000 ml de agua destilada o desionizada. Durante cada ciclo de lavado, cada pocillo debe completarse con, aproximadamente 350 μl. Conservar entre 2 y 8 C. Dejar que alcance la temperatura ambiente (20-25 C) antes de usar. ANTI-IgG HUMANA DE CABRA MARCADA CON PEROXIDASA (3): listo para usar. Estable entre 2-8 C hasta la fecha de vencimiento impresa en el envase. No congelar. Dejar que alcance la temperatura ambiente (20-25 C) antes de usar. SUSTRATO CROMÓGENO (TMB) (4): Solución estabilizada con tetrametilbencidina. Listo para usar. Estable a 2-8 C hasta que fecha de vencimiento impresa en el envase. No congelar. Dejar que alcance la temperatura ambiente (20-25 C) antes de usar. Lo TMB no es mutagénico ni carcinogénico. DILUYENTE DE MUESTRA (5): listo para usar. Estable entre 2-8 C hasta la fecha de vencimiento impresa en el envase. SOLUCIÓN STOP (6): Listo para usar. Contiene ácido sulfúrico (H2SO4). Manejar con cuidado. Corrosivo. En caso de contacto con la piel, lavar abundantemente en agua corriente. Dejar que alcance la temperatura ambiente (20-25 C) antes de usar. Estable C hasta la fecha de vencimiento impresa en el frasco. CALIBRADORES Tg (7): Listo para usar. Producido de sueros humanos que contiene anti-tg. La concentración en UI/mL y de la fecha de vencimiento se imprimen en la etiqueta de cada botella. Contiene conservante. Estable entre 2 y 8 C. Lo uso de Calibrador Tg es para determinar resultados semi-cuantitativos y los valores en unidades internacionales. El Calibrador Tg deben utilizarse siempre en cada prueba realizada. SUERO DE CONTROL NEGATIVO (8): listo para usar. Suero humano negativo para anti-tg. Usar puro, en otras palabras, no diluido. Estable entre 2-8 C hasta la fecha de vencimiento impresa en el envase. Contiene conservante. SUERO DE CONTROL POSITIVO (9): Listo para usar. Suero humano positivo para anti-tg. Usar puro, en otras palabras, no diluido. La concentración en UI/mL y de la fecha de vencimiento se imprimen en la etiqueta de cada botella. Contiene conservante. Estable entre 2-8 C.

18 17 Nota: El kit mantiene el mismo rendimiento después de la primera utilización, y es estable hasta la fecha de vencimiento descripta en la etiqueta, siempre que se mantenga a la temperatura indicada (2-8ºC). ESPECÍMENES Usar muestras de suero libres de hemólisis, lipemia y contaminación. Las muestras se pueden conservar en refrigerador, entre 2-8 ºC, por 48 horas. Para un período mayor, deben guardarse en freezer a -20 ºC. Las muestras congeladas deberán homogeneizarse antes del test. Evite la formación de espuma. Evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación, ya que esto puede producir resultados falsos. MATERIAL NECESARIO, PERO NO SUMINISTRADO Micropipeta de 5μl y 100μl y puntas de pipeta. Agua destilada o desionizada, para dilución de tampón de lavado. Agitador de microplaca. Incubadora con una temperatura de 37 º C Lector de micro placa con filtro de 450 nm. Lavador de microplaca. Papel absorbente. Recipiente para descarte de material. Recipiente para descarte de material. PROCEDIMIENTO IMPORTANTE: Mediciones de absorbancia bicromático utilizando un filtro de referencia con longitud de onda de 630 nm filtro se recomienda cuando disponible. En esta condición, el uso de "blanco" debe ser descartado, ya que solo se utilizan cuando se utiliza un solo filtro de 450 nm. 1. De acuerdo con el plan establecido de distribución en la placa, use 1 pocillo para el Calibrador Tg (7), botella D, si el resultado esperado es cualitativa, o 5 pocillos, botellas A a E, si el resultado deseado es semi-cuantitativo, 1 pocillo para el suero control negativo (8) y 1 pocillo para el suero control positivo (9). Usar 1 pocillo para el blank, el cual contendrá solamente 100μl de diluyente de muestra (5). 2. Preparar dilución de muestras a ser testeadas a 1:101 (5 µl de muestra µl de la muestra diluyente (5). 3. Dispensar 100 µl de lo calibrador Tg (7), suero control negativo (8), suero control positivo (9) y muestras (1:101 ) en los pocillos de la placa de microtitulación. Usar 1 pocillo para el blank, si la lectura es monocromático, dispensando 100μl de diluyente de muestra (5). Usar puntas de pipeta individuales para cada pipeteo, evitando la contaminación. 4. Homogeneizar suavemente, tamborileando con los dedos sobre los bordes de la placa o por vibración mecánica (agitador de placa) por 30 segundos. 5. Cubrir la placa con papel adhesivo e incubar a temperatura ambiente por 30 minutos. 6. Descartar el contenido de la placa en un recipiente con solución desinfectante, teniendo cuidado de evitar la contaminación entre pocillos. 7. Lavar la placa 4 vezes con la solución de lavado (2) (ver Preparación y Estabilidad de los Reactivos). Aspirar el contenido de la microplaca, dispensar 350μl de solución de lavado (2) en cada pocillo, esperar 30 segundos y vaciar el contenido de los pocillos. Repetir 3 veces este procedimiento (total de 4 ciclos). Se recomienda el uso de una lavadora de microplacas, automática o manual. ADVERTENCIA: Es fundamental, para un buen desempeño del ensayo, que los procedimientos de lavado sean adecuados. 8. Después del último lavado, invertir la placa y golpearla sobre papel absorbente para eliminar cualquier residuo líquido. 9. Dispensar 100μl del conjugado (3) en todos los pocillos, excepto el blank. 10. Cubrir la placa con papel adhesivo e incubar a temperatura ambiente por 30 minutos. 11. Repetir los pasos 6 al Dispensar 100μl del sustrato cromógeno (TMB) (4) en cada pocillo de la microplaca, excepto el blank. Homogeneizar suavemente, tamborileando con los dedos sobre los bordes de la placa o por vibración mecánica (agitador de placa) por 30 segundos. 13. Incubar a 37 C durante 30 minutos, protegerlo de la luz. 14. Bloquear la reacción dispensando 100μl?de la solución Stop (7) en cada pocillo de la microplaca,