Tema 8 LA BIOTECNOLOGÍA EN PLANTAS GM. Prof. Gloria Morcillo Ortega

Transcripción

1 8 LA BIOTECNOLOGÍA EN LA AGRICULTURA: PLANTAS GM Prof. Gloria Morcillo Ortega 1

2 Introducción 8.1 Importancia de las plantas para la alimentación 8.2 Unas bases de Botánica 8.3 La modificación genética de las plantas 8.4 Un poco de Historia 8.5 Estrategias para la modificación genética de plantas Cultivos de células vegetales Transformación de las células vegetales Diseño de la construcciones génicas 8.6 Transferencia de genes con vectores específicos de plantas El plásmido Ti El plásmido Ri Vectores víricos 8.7 Trasferencia directa de genes 8.8 Expresión de genes exógenos en células vegetales Regiones reguladoras Genes marcadores 8.9 Algunas aplicaciones de la ingeniería genética en plantas 8.10 Mejora de las propiedades de los cultivos Aumento de la eficiencia del metabolismo Aumento del valor nutritivo Maduración controlada de frutos y flores Resistencia a condiciones ambientales extremas 2

3 8.11 Mejora del rendimiento.cultivos resistentes a plagas, enfermedades y herbicidas Resistencia a plagas de insectos Resistencia a enfermedades víricas Resistencia a hongos y bacterias Resistencia a herbicidas 8.12 Las plantas como factorías Producción de fármacos Producción de plásticos biodegradables 8.13 Descontaminación ambiental Bibliografía Direcciones en Internet ANEXO I y II 3

4 Los vegetales constituyen el componente nutricional más importante para la humanidad y son la fuente de multitud de materias primas. Por este motivo la investigación en el campo de la ingeniería genética de plantas recibe una gran atención en los organismos públicos, pero también, debido a su enorme interés comercial, ha recibido un fuerte impulso por parte de las grandes multinacionales del sector agroalimentario. Esto, unido a la menor dificultad que presenta la modificación genética de las plantas con respecto a los animales, ha hecho que en tan solo dos décadas se haya avanzado de una forma espectacular en este campo. Hoy día, se cultivan una gran variedad de especies vegetales de interés agrícola y comercial modificadas genéticamente (plantas GM llamadas también plantas transgénicas) y la extensión de estos cultivos en el mundo crece de forma exponencial. Actualmente se encuentran en el mercado una gran variedad de productos alimentarios procedentes de estos cultivos. En este tema se analizan las estrategias y las técnicas que se utilizan, así como los problemas específicos que se plantean a la hora de lograr la modificación genética de plantas. Se presentan, someramente, las diversas aplicaciones que las plantas GM pueden proporcionar, y se analizan con algo más de detalle algunos ejemplos de plantas modificadas genéticamente relacionadas con el campo de la alimentación. 4

5 8.1. Importancia de las plantas para la alimentación Las plantas han estado muy vinculadas con el desarrollo de la civilización humana. Desde tiempos prehistóricos, los seres humanos consumieron frutos y semillas como alimento, y pronto comenzaron a cultivar y recolectar aquellas que tenian mayor interés. Las semillas desde el punto de vista nutritivo son un almacen muy concentrado de proteínas, aceites, carbohidratos y vitaminas, ya que estos compuestos son necesarios para la germinación y el desarrollo de la planta. Asimismo, tienen una gran ventaja sobre otro tipo de alimentos que, generalmente, resultan muy perecederos, sin embargo, las semillas son fáciles de almacenar y, además, pueden conservarse durante largos periodos de tiempo si se las mantiene secas, de tal modo que son de los pocos alimentos que pueden ser guardados en tiempos de abundancia para aprovecharlos en épocas de escasez. Pocos alimentos tienen esta doble ventaja. Pero tampoco en esto los seres humanos hemos sido muy originales. Todos los seres vivos del planeta dependen para su alimentación de las plantas. Las únicas formas de vida en la Tierra que no dependen de las plantas para su existencia son algunas pocas especies de procariotas y protistas autótrofos. Para el resto de los seres vivos las plantas son indispensables ya que la energía de la luz solar entra a la biosfera a través de los cloroplastos de las plantas, y el carbono y otros elementos fundamentales para la vida como el nitrógeno y el azufre se incorporan a los ecosistemas como moléculas orgánicas gracias a que son asimilados por las plantas. Los seres vivos que no comen plantas se alimentan de otros que si las comieron. Las plantas están en la base de las cadenas alimentarias. 5

6 La domesticación de algunas plantas para su uso como alimento, que puede considerarse la biotecnología más antigua, constituye un largo y paciente proceso, que se inició hace miles de años y continúa en la actualidad. Durante este largo periodo siempre se ha buscado lo mismo: mejorar, desde el punto de vista humano, las propiedades de estas plantas; lograr que tengan buenas y agradables condiciones nutritivas, que tengan un mayor rendimiento, y que tengan características que favorezcan su cultivo y faciliten su recolección. El resultado de este proceso de domesticación, con profundas consecuencias evolutivas, es la creación de diversas variedades cuyo único objetivo es servir a las necesidades humanas, y cuya supervivencia está prácticamente limitada a su cultivo y su mantenimiento seria imposible sin los cuidados del hombre. No obstante, las cosechas a su vez han dependido de multitud de factores externos a las propias plantas domesticadas cuyas condiciones la humanidad no ha podido controlar, como la climatología y las plagas que han arruinado, y siguen haciéndolo todavía en porcentajes muy importantes, los rendimientos de los cultivos. Se estima que alrededor de una especies de plantas son comestibles, de las cuales los humanos únicamente cultivamos 300, aunque sólo 12 de ellas podemos considerar que son esenciales para la alimentación de la humanidad, y tan sólo 3, arroz, maíz y trigo, pueden ser consideradas como la base de la alimentación mundial. Además de su importancia alimenticia, las plantas han representado para la humanidad una fuente fundamental para la obtención de muchos otros compuestos: fibras vegetales para el vestido y la construcción, compuestos para la salud, tintes, cosméticos, etc. 6

7 8.2 Unas bases de Botánica La mayor parte de las plantas que el ser humano cultiva y explota, así como las semillas y frutos que consume proceden de las plantas que los botánicos denominan ANGIOSPERMAS, que son las plantas con flores, aunque también son comestibles las semillas de algunas GIMNOSPERMAS o plantas sin flores, como es el caso de los piñones del pino. Las plantas con flores son fundamentales para nuestra supervivencia como especie. Todos los cultivos importantes que nos proporcionan alimento como los cereales: trigo, arroz, maíz y cebada; las plantas leñosas, de las cuales obtenemos madera, como el roble, castaño, cerezo; las que nos proporcionan fibras como el algodón y el lino; y otros muchos productos como el caucho, el tabaco, el café, el chocolate, los aceites aromáticos para los perfumes, y los miles de medicamentos como el digital y la codeína, por poner solamente algunos ejemplos, son obtenidos de plantas que pertenecen al grupo de las Angiospermas. Las Angiospermas son actualmente las plantas con más éxito y sus más de especies dominan el planeta, aunque no siempre en la historia de la Tierra fue así ya que su aparición es muy reciente, unos 180 millones de años según el registro paleontológico. Comenzaron a ser muy abundantes hace unos 120 millones de años, coincidiendo con el declive de los dinosaurios. Se han adaptado a todos los ambientes y presentan una amplia variedad de formas y tamaños, desde las pequeñas plantas herbaceas de los pastos y praderas con diminutas flores, a las plantas con grandes y llamativas flores hasta los gigantescos árboles de los bosques. 7

8 Las Angiospermas son plantas vasculares que se reproducen de manera sexual, mediante un proceso de doble fecundación único entre los seres vivos, formando flores y frutos que las distinguen de todas las otras plantas. El fruto protege la semilla en desarrollo y a menudo ayuda a su dispersión. La flor y el fruto representan mecanismos por los cuales los animales son atraídos para participar en la estrategia reproductora de este tipo de plantas, y probablemente evolucionaron como un pago a los animales por los servicios prestados en el transporte de las semillas. Dentro de las Angiospermas se distinguen dos clases: las monocotiledóneas, que son generalmente plantas herbaceas con hojas largas y estrechas, con nerviaciones paralelas, entre las que se incluyen los pastos, los lirios, la cebolla, las palmeras, y los cereales cuyas semillas son fundamentales para el alimento de la humanidad como son el trigo, arroz y maíz; y las dicotiledóneas que son más diversas e incluyen muchas más especies (al menos ), entre las que podemos citar, por ejemplo, el roble, los girasoles, los cactus, los arándanos, el tomate La modificación genética de las plantas La manipulación genética de las plantas no es, estrictamente hablando, una novedad. El hombre ha modificado durante miles y miles de años el contenido genético de multitud de plantas de interés agrícola, en un proceso de domesticación largo y acumulativo, basado en cruces, incluso entre especies diferentes, y en la selección posterior de semillas, con unas prácticas que con el tiempo se fueron haciendo cada vez más sofisticadas. A pesar de que estos métodos eran lentos e inciertos, 8

9 jugando el azar un papel bastante importante, se han logrado obtener especies vegetales que en poco se parecen a las originarias silvestres de las cuales derivaron tras siglos de paciente labor agrícola. Las nuevas tecnologías de ingeniería genética no han hecho sino acelerar la velocidad de este proceso y, sobre todo, afinar en la selección de caracteres, ya que permiten elegir genes en vez de mezclar genomas completos, pero tienen esencialmente el mismo fundamento y objetivo. Sin embargo, una diferencia sustancial es que los métodos de mejora clásica de plantas estaban limitados por la variabilidad genética, que podía ser suministrada únicamente por especies que se cruzaran entre sí, es decir, por especies próximas. El gran potencial, y a la vez el riesgo, de la ingeniería genética reside en que se han roto estos límites, desapareciendo las barreras para elegir y transferir genes entre especies e incluso entre taxones, lo que proporciona un amplio rango de posibilidades para suministrar el fenotipo deseado a un organismo. La ingeniería genética de plantas tienen un enorme potencial de aplicaciones y, al menos, tres factores importantes confluyen para explicar los impresionantes avances alcanzados en este campo: Enormes intereses económicos y, por tanto, una elevada financiación destinada a la investigación para la mejora en la producción de frutos y semillas de interés para la alimentación humana y ganadera, con mejores cualidades y mayor rendimiento. Además del interés que tiene la obtención de nuevas variedades destinadas a condiciones ambientales adversas (salinidad, temperaturas elevadas) o para su cultivo en terrenos hasta ahora considerados no fértiles. 9

10 Por otra parte, la creación de nuevas variedades de flores y plantas de interés ornamental es también un campo de enorme futuro comercial. A nivel industrial, las plantas son también una importante fuente de materias primas. Productos como el almidón y el azúcar tienen gran importancia para las industrias relacionadas con la alimentación, pero también con la energía. El etanol, obtenido por fermentación de la caña de azúcar se utiliza en mezcla con petroleo como combustible en los coches en Brasil. Productos como el algodón, el lino, etc., son la base de la industria textil. Así mismo, las plantas son la fuente de multitud de compuestos químicos para la industria farmacéutica, cosmética, de aditivos alimentarios, etc. Menor dificultad para obtener plantas transgénicas. La producción de plantas transgénicas es, al menos en teoría, mucho más sencilla que la de animales transgénicos. Las plantas tienen una gran capacidad regenerativa. En muchos casos, una sola célula manipulada genéticamente puede dar origen a la producción de una nueva variedad. Muchas células vegetales son totipotentes, esto es, capaces de multiplicarse, diferenciarse y acabar formando plantas completas y fértiles. Esto representa una gran ventaja con respecto a la obtención de animales transgénicos, ya que se pueden obtener plantas genotípicamente alteradas a partir de una única célula transformada. Además, la larga historia de la agricultura ha proporcionado un profundo conocimiento de la genética de las plantas cultivadas y se dispone de una enorme variedad de líneas portadoras de mutaciones que hoy pueden ser explotadas a nivel molecular. La capacidad de autofecundación de muchas plantas y la producción de una numerosa progenie hace que sea más fácil encontrar mutaciones y recombinaciones poco frecuentes y obtener homocigotos. 10

11 Menor rechazo social que la manipulación genética en animales. Los experimentos de manipulación genética en plantas despiertan, en general, un menor rechazo y tienen una mayor flexibilidad legislativa que los realizados en animales en todos los paises del mundo. Sin embargo, hay que resaltar el importante rechazo social que se ha generado en los países de la Comunidad Europea a los cultivos agrícolas con semillas modificadas genéticamente. En la UE inicialmente se aprobaron 18 OGM, la mayoría de los cuales correspondian a cultivos de plantas relacionadas con la alimentación, pero desde 1998 existe una moratoria para los mismos en todos los países de Europa, aunque con la nueva normativa probablemente pronto se comercialicen 13 nuevos productos pendientes de aprobación que ya han recibido el informe positivo de la Comisión Científica. En contrapartida a estas ventajas, algunos sistemas vegetales presentan también una serie de inconvenientes que están frenando el desarrollo de su manipulación genética: Muchas plantas presentan un genoma muy grande, con frecuencia debido a su poliploidía, lo que dificulta mucho la experimentación genética A pesar de que muchas plantas se pueden regenerar a partir de una única célula manipulada genéticamente y se espera que sean un clon de esta célula, sin embargo, a menudo se producen células heterogeneas debido a una variación somatoclonal, frecuente en plantas, lo que crea graves problemas para esta experimentación. Finalmente, hay que decir que las plantas monocotiledones, precisamente las que tienen un mayor interés desde el punto de vista de la alimentación, resultan muy difíciles de transformar, aunque el desarrollo 11

12 de los métodos de biobalística para introducir los genes exógenos está consiguiendo bastantes éxitos. 8.4 Un poco de historia El asentamiento de los pueblos nómadas permitió que los primeros labradores de la tierra comenzaran a elegir y cultivar ciertas plantas para alimentarse y supuso el inicio de la civilización humana. Desde entonces los agricultores han sido profundos conocedores de la genética empírica y acumulando conocimientos prácticos que han transmitido durante generaciones han sido capaces de crear multitud de especies nuevas para uso y consumo de la humanidad. A lo largo del siglo XX se produjo un cambio drástico en la agricultura pasando de la artesanía genética, practicado durante milenios, a la ingeniería genética. Algunas fechas importantes que marcan hitos importantes en este siglo revolucionario también para la agricultura son las siguientes: 1910 Los botánicos europeos comienzan a aplicar las leyes de Mendel para la mejora de plantas agrícolas; es el comienzo de la selección y mejora clásicas con base científica Se obtiene la primera generación de plantas procedentes de un cultivo in vitro 1968 Se inicia la Revolución Verde, se introducen las semillas híbridas en los países del Tercer Mundo. Comienza la comercialización de las semillas, y la introducción de productos industriales en la agricultura: herbicidas, pesticidas, abonos químicos. En pocos años se logra un incremento 12

13 drástico en la producción agrícola y en el rendimiento de las cosechas, imprescindible para alimentar a la creciente población humana Primer OGM. Los investigadores logran aislar genes e introducirlos en un genoma ajeno, se obtiene la primera bacteria Escherichia coli transgénica que representa el inicio de la Ingeniería Genética Primera planta GM. Se obtiene la primera planta transgénica, una planta de tabaco con el gen de la resistencia al antibiótico kanamicina, lograda por un equipo de científicos de la multinacional agroalimentaria Monsanto Primer OGM en el campo. Se emplea Frostban un spray que contenía bacterias modificadas genéticamente, a las que se les había introducido un gen que produce resistencia a las heladas. Se pulverizan sobre cultivos de fresas para protegerlos del daño provocado por las heladas en los campos de Brentwood (California) Primer OGM en el mercado. Se pone a la venta en USA el tomate FLAVR SAVR, modificado genéticamente de forma que tiene una maduración retardada, producido por la empresa Calgene. 8.5 Estrategias para la modificación genética de plantas En términos generales, la modificación del genoma de una planta se puede plantear desde dos estrategias alternativas: Adicción génica. Cuando se pretende que la planta adquiera una nueva característica o propiedad para lo cual hay que añadir nuevos 13

14 genes. Puede tratarse de añadir un gen, o más de uno, y puede proceder de otra variedad de la misma planta cultivada, de otra especie de planta silvestre o cultivada que tenga la característica que se quiere incorporar, o incluso el gen puede proceder de especies muy alejadas filogenéticamente como bacterias, levaduras o animales. Supresión génica. Se trata de eliminar alguna característica o propiedad no deseada, para lo cual hay que eliminar la acción del gen o los genes de la propia planta responsables de la misma. En este caso no se trata de quitar físicamente el gen del genoma de la planta, ya que esto no es factible actualmente, sino que la modificación genética persigue inactivar el producto del gen para impedir, retardar o ralentizar su acción. Aunque hay distintas estrategias la que ha dado mejores resultados es la de introducir en el genoma de la planta un gen que sea el inverso complementario, lo que se ha demominado un gen antisentido, de tal forma que cuando se transcriben sus RNAs al tener la misma secuencia pero ser complementarias hibridarian y se inactivan. De hecho esta tecnología se empleó en el tomate de maduración retardada, el primer alimento GM que fue aprobado para su comercialización. Aunque las dos estrategias estan siendo utilizadas, está claro que la segunda tiene unas apliacciones más limitadas, las características no deseables que se tratan de eliminar son siempre limitadas, mientras que las nuevas caracteristicas que se pueden incorporar a una planta solo tienen el límite teórico de los genes disponibles para ellas. Las células vegetales son totipotentes esto significa que, si se proporcionan las condiciones físicas y nutricionales adecuadas, cualquier célula vegetal puede regenerar el fenotipo del organismo completo y diferenciado del cuál derivó originariamente. Por este motivo, y a diferencia de lo que ocurre con los animales, resulta relativamente sencillo 14

15 modificar las células vegetales aisladas introduciendo el gen o los genes de interés que van a conferir la nueva característica o eliminar la no deseable, y luego a partir de estas células se puede regenerar la planta GM completa. En cualquiera de las dos estrategias comentadas, los pasos fundamentales que hay que tener en cuenta a la hora de plantear la modificación genética de una determinada especie vegetal son: Disponer de células en cultivo de la especie para transformar Diseñar y obtener la construcción génica que se va a utilizar Disponer de un método adecuado para transferir la construcción génica al interior del núcleo de la célula, una vez allí es necesario que se integre y que se exprese, de forma que que sea estable Cultivar posteriormente las células transformadas y lograr regenerar la planta completa Cultivos de células vegetales Para obtener buenos cultivos de células vegetales se debe partir de pequeñas piezas de tejido denominados explantes capaces de una rápida proliferación, como por ejemplo del ápice de raíz, de yemas o bien de semillas en germinación, todas estas regiones contienen células que se encuentran continuamente en ciclo de división. El explante se lava con un desinfectante, agua oxigenada o hipoclorito, para eliminar microorganismos, y se deja crecer en un medio nutritivo, donde dependiendo de la especie puede llegar a formar una masa indifrenciada 15

16 de células denominada callo, que puede propagarse indefinidamente por divisiones en un medio nutricional adecuado suplementado con fitohormonas. El medio de cultivo suele contener sacarosa como fuente de carbo; una fuente de nitrógeno orgánico, por ejemplo aminoácidos, o inorgánico, como nitratos; sales inorgánicas, metales (Cu, Zn, Co y otros), vitaminas y hormonas vegetales (auxinas, giberelinas, citoqinas) reguladoras del crecimiento. Si una pieza de callo joven se transfiere a un medio de cultivo líquido y se agita, la masa celular se disgrega y se produce una suspensión de células que puede cultivarse indefinidamente, o bién puede sembrarse en un medio sólido en el que las células crecen se dividen y forman callos de forma análoga a las colonias de bacterias. Esta forma de cultivo in vitro de tejidos es muy frecuente para conservar ciertas variedades de vegetales en los llamados bancos de germoplasma. En un momento dado, el estado de indiferenciación de estas células en cultivo puede alterarse, modificando el tipo y la concentración de fitohormonas en el medio, e inducir la diferenciación de raíces, tallos, etc., que permitirán regenerar una planta completa. Este proceso se denomina organogénesis y requiere unas condiciones específicas para cada especie. La capacidad con que una especie superara este proceso es clave par el desarrollo de plantas GM, y es una etapa bastante complicada experimentalmente en el casos de los cereales, a excepción del arroz y de algunas variedades de maíz Transformación de las células vegetales Las células vegetales tienen por fuera de la membrana plasmática una fuerte pared de celulosa, que supone un verdadero obstáculo físico para la entrada de genes. Para salvar este problema se pueden seguir dos estrategias, o bien liberar a la célula de esta barrera física, o bien 16

17 diseñar sistemas que dirijan el DNA al interior de la célula incluso en presencia de la pared. Estos últimos son los métodos denominados de biobalística, que se comentaran en el apartado 8.7. Para la transformación se suelen utilizar protoplastos, que son células vegetales a las que se les ha eliminado la pared celular por medio de tratamiento enzimático con celulasa y pectinasa. Se suelen emplear células de hoja, que son fáciles de dispersar y regeneran muy bien la planta completa. También son muy utilizados los protoplastos haploides de polen, ya que pueden regenerar plantas haploides que resultan de gran utilidad para analizar mutantes. La facilidad y las condiciones con que los protoplastos regeneran la planta completa es muy variable y depende de las especies. Los protoplastos al estar desprovistos de la pared externa facilitan la penetración de moléculas de DNA y por tanto son células más fáciles de transformar. Posteriormente, el protoplasto puede regenerara la pared celular en un medio sólido con los nutrientes y señales adecuadas, en un proceso que dura entre cinco y diez dias, tras lo cual la célual comienza a dividirse y puede formar callos e incluso regenerar la planta completa. Otro sistema alternativo muy utilizado es la transformación de discos de hoja. Se recortan pequeños discos, de algunos milímeros de diametro, de una hoja. Las células de su borde pueden ser facilmente transfectadas por el plásmido de la bacteria Agrobacterium que hace de vector de genes, como veremos más adelante, y además, estas células tienen una gran capacidad regenerativa, si se trasnfieren a medios que estimulan la capaciadd la diferenciación celular, son capaces de regenerar la planta completa, en un proceso que dura en total de 4 7 semanas. Resulta más rápida que la regenaración a partir de protoplastos y es un sistema muy utilizado actualmente especialmente con las dicotiledoneas. 17

18 Diseño de las construcciones génicas En cualquier caso, bien se trabaje con células en cultivo o con protoplastos, para modificar genéticamente una planta se requiere introducir genes exógenos en el interior del núcleo de una célula vegetal y para ello hay que recurrir a vectores que transporten el gen o los genes, o bien utilizar técnicas que permitan la introducción directa del transgen. Y, previamente, es necesario diseñar la construcción de DNA adecuada que contenga el gen o genes de interés, pero también algunos elementos necesarios para asegurar su correcta expresión. Estos son las regiones reguladoras y el promotor del gen que permitirán que el gen sea activo y que lo sea en el momento y en el lugar correcto, es decir, que la proteína o proteínas se sinteticen en las células del tejido donde debe hacerlo. Además, suele ser muy útil introducir en la construcción otros genes que llamaremos marcadores de selección, que también se suelen denominar reporteros, que permitiran confirmar que se ha producido la integración. Generalmente se trata de algún gen de resistencia a antibióticos, que permitirá seleccionar fácilmente las células transformadas por su supervivencia en un medio de cultivo que contenga el antibiótico. La presencia de genes de resistencia a antibióticos en las plantas transgénicas representa uno de los puntos más criticados por los detractores de los cultivos con semillas transgénicas. Actualmente se investiga con gran interés en este campo y hay importantes avances que permiten trabajar con otro tipo de marcadores e incluso se diseñan construcciones con marcadores que tras una primera etapa que permiten la detección y selección son posteriormente eliminados. Estas cuestiones se taratran con alho más de detalle en el apartado

19 8.6 Transferencia de genes con vectores específicos de plantas El plásmido Ti Uno de los métodos más utilizados para transformar células de plantas consiste en utilizar como vector para los genes foraneos el plásmido Ti (tumor-inducing) de la bacteria Agrobacterium tumefaciens. Ésta es una bacteria gram negativa del suelo, muy abundante y que es capaz de infectar de forma natural a una gran variedad de especies diferentes del grupo de las dicotiledóneas, provocando la aparición de tumores llamados de agalla en corona. La bacteria penetra, a través de cualquier herida reciente en la epidermis de la planta, y se adhiere a la pared externa de una célula. Desde aquí, es capaz de transferir fragmentos del plásmido Ti, que se encuentra normalmente en el interior de estas bacterias, hasta el núcleo de la célula vegetal. La célula vegetal que ha adquirido el plásmido se convierte en una célula tumoral, creciendo de manera independiente y no regulada, y se dedica a sintetizar unos amoniácidos especiales, las opinas, y otros compuestos única y exclusivamente para alimentar a la bacteria. El plásmido Ti tiene un tamaño muy grande, es un DNA circular de unas 200Kb. Sin embargo, al interior de la célula vegetal solo penetra un fragmento de este plásmido, llamado T-DNA (DNA transferido), que tiene un tamaño de entre 12 y 24 Kb, dependiendo de la cepa bacteriana. Esta región tiene una serie de características muy interesantes: - Una vez en el interior de la célula, el T-DNA no permanece como un plásmido independiente sino que se integra en uno de los cromosomas de la planta. Ésta es una característica muy interesante ya que gracias a ello todas las células descendientes, formadas por división 19

20 de ésa célula, portarán el plásmido debido a que se transmite con los propios cromosomas, produciendose una transformación estable e irreversible de las células de la planta afectada. - Este T-DNA resulta por tanto un vector natural idóneo ya que en él se pueden introducir genes foráneos de interés y utilizar este sistema para la manipulación genética de las plantas dicotiledóneas, que son las que de forma natural son infectadas por la bacteria. - El T-DNA lleva una serie de genes, algunos de los cuales codifican para enzimas que intervienen en la síntesis de opinas. Éstas son unas moléculas derivadas de aminoácidos, que son sintetizadas por acción de las enzimas que la bacteria introduce en la planta utilizando los propios aminoácidos y otras moléculas de la planta, y que, sin embargo, son utilizados como nutrientes por la bacteria. Es decir, la infección de las células con el plásmido de la bacteria hace que estas células se pongan a trabajar para la bacteria de forma que suministran nutrientes para las propias bacterias. Conviene reconocer que la humilde bacteria del suelo Agrobacterium ha logrado desarrollar todo un sistema de ingeniería genética de plantas para ponerlas a producir sustancias en su propio beneficio, algunos millones de años antes que el Homo sapiens fuera capaz de hacerlo. Además, como hemos dicho la infección provoca una proliferación desordenada de las células de la planta, debido a que el T-DNA lleva también un grupo de genes que codifican enzimas para la síntesis de hormonas vegetales, cuya superproducción induce una proliferación desordenada produciéndose un tumor, conocido como agalla de la corona. 20

21 Hoy día se explota este sistema para introducir genes nuevos en plantas, pero para ello previamente es necesario realizar una serie de manipulaciones para modificar el propio plásmido Ti y hacerlo más adecuado. En la versión comercial que se utiliza se han eliminado los genes oncogénicos responsables del crecimiento tumoral de las células de la planta, y también se han eliminado los genes responsables de la producción de opinas. Sin embargo, se suele dejar la región del promotor de estos genes de opinas junto a la cuál se añade el gen de interés, de este modo se asegura la expresión del gen foráneo introducido a la planta. También es necesario incorporar genes marcadores para identificar y seleccionar las células vegetales transformadas. El promotor de las opinas es útil para expresar genes de forma constitutiva, es decir, genes que van a estar permanentemente activos produciendo su producto. Sin embargo, en la práctica a veces se requiere que los genes que se introducen se expresen únicamente en determinadas células de la planta, por ejemplo en semillas, o en determinados momentos del desarrollo. Esto complica bastante las cosas y hace necesario el uso de promotores específicos de la planta o al menos promotores que se puedan controlar por factores específicos y así lograr regular la expresión del gen El plásmido Ri Otro vector específico es el plásmido Ri (root inducing) de la bacteria Agrobacterium ryzobium, cuya utilización sigue básicamente el mismo proceso que acabamos de comentar para el Ti. Este plásmido cuando infecta una planta produce raíz de cabello, o aparición de 21

22 múltiples raíces por una proliferación desordenada de las células de la raíz Vectores víricos También algunos virus de plantas pueden ser utilizados como vectores de genes foráneos. Si son adecuadamente manipulados son capaces de transportar un DNA como pasagero al interior de la célula vegetal. Los mayorse avances se han logrado con geminivirus y caulimoviruse, dentro de estos últimos, especialmente utilizado ha sido el virus del mosaico de la coliflor. También los virus con genoma de RNA que son muy abundantes en el mundo vegetal están siendo utilizados como vectorers de genes, los más frecuentes son los del mosaico de la cebada y el virus del mosaico del tabaco. 8.7 Transferencia directa de genes Debido a que el sistema de Agrobacterium no es eficaz en la plantas monocotiledones, precisamente las de mayor interés agrícola como los cereales, se han tratado de desarrollar alternativas para introducir DNA en las células vegetales basadas en métodos físicos. Algunas células vegetales pueden ser transformadas directamente, por transfección de fragmentos de DNA añadidos al medio de cultivo, aunque, en general, la eficiencia de la transformación directa es bastante baja. Hoy día se trata de mejorarla utilizando diversas técnicas que favorecen la penetración del DNA foráneo. Algunas de estas técnicas son: 22

23 Permeabilización de membranas - La electroporación, que consiste en la apertura de poros en la membrana por tratamiento con impulsos eléctricos controlados. Utilizando campos de entre 200 y 600 V/cm se consigue transferir DNA extraño a células de arroz y de maíz con rendimientos bastante buenos. - La permeabilización química, por ejemplo con etilen glicol. - La permeabilización con ultrasonidos. - También se utilizan liposomas para transportar DNA al interior de las células. Biobalística Otras técnicas más sofisticadas son las conocidas como biobalística que incluyen el uso de pistolas génicas. Estas técnicas se basan en la utilización de microesferas de metales, como oro o tungsteno, de 0,4 a 4 µm de diametro, recubiertas del DNA que se desea introducir que es precipitado sobre ellas con cloruro cálcico, y que se disparan sobre las células, o bien el uso de microproyectiles que llevan dentro gotitas del DNA a transfectar en solución. El mecanismo de disparo se basa en una pistola especial que lanza las partículas a más de 400m/s sobre las células de forma que penetran sin destruir la membrana, todo el sisitema funciona en un vacío moderado para evitar el rozamiento con el aire, condiciones que las células vegetales soportan durante uno o dos minutos. Tras el bombardeo, las células son colocadas en condiciones adecuadas para crecer y regenerar la planta. 23

24 8.8 Expresión de genes exógenos en celulas vegetales Regiones reguladoras Las cosas no son generalmente tan sencillas y, con frecuencia, los genes introducidos en las plantas, sea cual sea el procedimiento que empleemos para ello, plantean problemas de expresión y de mantenimiento en las células, resultando que su presencia y actividad es sólo transitoria. Otras dificultades adicionales surgen cuando el producto del gen foráneo introducido, es decir la proteína, es rápidamente degradada por los sistemas enzimáticos de la planta, o bien, por el contrario, cuando el compuesto que interesa no puede ser correctamente producido al faltar enzimas o proteínas adecuadas para su procesamiento, empaquetamiento final, etc. Está claro que los problemas de la ingeniería genética para obtener plantas modificadas genéticamente no finalizan al encontrar un vector o un sistema adecuado para introducir un gen foráneo más bien, por el contrario, se puede decir que es cuando verdaderamente comienzan. En este punto los avances en el conocimiento de la genética molecular básica de las plantas, la regulación de la expresión de los genes y el desarrollo, son los cimientos sobre los que crece y puede progresar la ingeniería genética aplicada de plantas. La expresión constitutiva o continuada de los genes incorporados a plantas se consigue cuando se colocan en los vectores 24

25 junto a regiones reguladoras como por ejemplo los promotores de opinas, de los que hablamos anteriormente. Pero muchas veces pede resultar más interesante que el gen o los genes exógenos insertados no se expresen hasta que sean activados específicamente, para lo cual se colocan frente a promotores regulables no constitutivos, que por ejemplo se activen únicamente en determinado momento del desarrollo o únicamente en cierto tejido. Para ello se utilizan promotores como por ejemplo el de la subunidad pequeña de la enzima rubisco (del ciclo de Calvin) que se activa solamente en los tejidos fotosintéticos, como las hojas; o bien promotores que se activan únicamente en las flores o en la raíz. También son muy interesantes los promotores que se activan en determinadas situaciones de estrés, como los de las proteínas HS o los de las proteínas PR. El uso de estas señales permite controlar con mayor o menor precisión la expresión de los genes foráneos incorporados. La búsqueda de promotores específicos de tejidos tiene una enorme importancia para el desarrollo de plantas transgénicas más específicas y seguras. Por ejemplo, plantas que expresen solo un insecticida que lleven incorporado en aquellos tejidos de la planta que son atacados por el insecto o el patógeno, permaneciendo sin expresarse en aquellos que son comercializados como alimento, por ejemplo frutos y semillas. Muchas veces el gen o los genes incorporados no son activos a pesar de haber diseñado una construcción con los reguladores adecuados. Y es que las plantas disponen de mecanismos protectores contra la invasión de DNA ajeno. Uno de estos es la metilación del DNA extraño integrado en el cromosoma, lo cual impide su transcripción y por tanto su expresión. Otras veces, se produce una inactivación de toda la cromatina alrededor de la región donde se encuentra el gen intruso lo que provoca el mismo resultado. Algunas plantas disponen de un mecanismo más sofisticado conocido como cosupresión, que consisite en que se 25

26 bloquean secuencias que sean de algún modo semejantes o otras endógenas. Todo esto hace que lograr el éxito en este tipo de experimentación sea bastante más difícil y complejo de lo que a primera vista podría parecer. El estudio y el conocimiento básico de la genética de plantas es fundamental para avanzar con nuevas estrategias Genes marcadores La identificación de las células vegetales que han incorporado un determinado gen exógeno, es decir que han sido efectivamente transformadas, es factible mediante el uso simultáneo de algún otro gen que codifique para alguna actividad facilmente detectable y que se inserta junto con el de interés actuando de testigo por lo que se suele llamar gen marcador o reportero. Uno de los más empleados en vegetales es el gen GUS, procedente de la bacteria E. Coli que codifica para la glucuronidasa. Esta actividad enzimática sobre un compuesto coloreado se puede valorar histoquímicamente. Otro gen marcador muy utilizado es el de la luciferasa una enzima que en presencia de ATP degrada la luciferina emitiendo luz y que por tanto puede valorarse con ayuda de un luminómetro o de una placa o película fotográfica sensible a la luz. Quizá los marcadores más ampliamente utilizados son los genes de resistencia a antibioticos procedentes de bacterias, que permiten no solo identificar a las células transformadas sino tambien seleccionarlas separandolos del resto de células que no han incorporado DNA exógeno en un medio con el antibiotico, ya que solo estas sobreviviran. La mayoria de los vectores que se utilizan llevan una copia del gen bacteriano de resistencia a la kanamicina, denominado kan R o nptii. 26

27 A pesar de que, hasta el momento, ninguna de las proteínas de los genes utilizados como marcadores ha demostrado ser nociva para la salud humana o animal, los genes marcadores han sido el blanco de muchas de las críticas a las plantas transgénicas Se argumenta que podrían tener efectos tóxicos, alergógenos, o provocar un aumento de la resistencia a antibioticos o transferir esta resistencia a otras especies. Actualmente se emplean distintos métodos para obtener plantas transgénicas libres de genes marcadores. La idea es utilizar el marcador solamente en las primeras etapas para identificar y seleccionar las células transformadas, y posteriormente eliminarlo antes de obtener la planta transgénica. Para ello la estrategia es que el gen que se desea clonar en la planta y el gen marcador se localicen en sitios diferentes del genoma de la planta receptora, en cromosomas distintos, para que tras unos cuantos cruces iniciales dirigidos se pueda perder el marcador por segregación cromosómia. Otra estrategia es que el marcador vaya incluido en el interior de una secuencia transponible móvil, que favorece su eliminación posterior. En esta línea se está utilizando el gen cre procedente del bacteriofago P1, que codifica para una enzima que cataliza la excisión de fragmentos de DNA flanqueados por una secuencia de reconocimiento de 35bp. La estrategia consiste en utilizar el gen marcador de resistenca flanqueado por estas secuencias de reconocimiento de 35bp, e incluir también el gen cre. Una vez en el interior de la célula vegetal transformada, el producto del gen cre cataliza la excisión del gen de resistencia a antibiótico. También se puede lograr la eliminación posterior del propio gen cre, si se ha clonado en un vector distinto y por tanto se ha intengrado en otro cromosoma distinto del gen de interés, por cruzamientos dirigidos. En definitiva, hoy día existen estrategias cada vez más sofisticadas que permiten evitar la presencia de secuencias distintas a la del gen de interés que se desea clonar en la planta. 27

28 Aunque en las plantas transgénicas de primera generación que fueron comercializadas se utilizaron marcadores de resistencia a antibióticos, actualmente se dispone de protocolos muy adecuados de forma que es posible evitar la presencia de genes marcadores no deseables en las plantas transgénicas, eliminando de este modo uno de los argumentos importantes en contra de las mismas. Como Anexo I se incluye un documento más extenso sobre este tema. 8.9 Algunas aplicaciones de la ingeniería genética en plantas El principal objetivo de la modificación genética de las plantas comestibles es el de lograr un material biológico capaz de dar respuesta a los problemas tradicionales de la agricultura, como la pérdida de cosechas por agentes patógenos, plagas y malas hierbas al dotar a las propias plantas cultivadas con genes de defensa frente a estos enemigos naturales que actualmente son combatidos por el agricultor con armas químicas. Pero también es interesante destacar que por medio de la ingeniería genética se pueden abordar aspectos totalmente nuevos, como la mejora de las propiedades nutritivas y se pueden plantear utilidades no ensayadas hasta ahora en la explotación por el hombre de las plantas cultivadas. Así, junto a la mejora de las resistencias, la calidad del producto y de sus características agronómicas, aspectos que se venían aplicando por los métodos tradicionales, aparecen nuevas posibilidades de difícil o imposible abordaje por las técnicas de mejora convencional o incluso totalmente inéditas, como la producción de vacunas, anticuerpos y otros fármacos en las frutas y semillas comestibles, la obtención de 28

29 productos de interés industrial, como por ejemplo plásticos, y la recuperación por las plantas de cultivo de suelos contaminados Mejora de las propiedades de los cultivos Aumento de la eficiencia del metabolismo de las plantas La fotosíntesis es uno de los procesos realizados por las plantas de mayor transcendencia para el conjunto de la vida en el planeta. Es el paso fundamental para la obtención de materia orgánica a partir del CO 2 atmosférico y de producción de O 2, de los cuales depende el resto de los seres vivos del planeta. Uno de los objetivos primordiales es, por tanto, conseguir por ingeniería genética plantas aún más eficientes en la realización de este proceso. La fijación del nitrógeno es otro proceso crucial para el metabolismo de las planats. La mayoría de las plantas cultivadas requieren grandes cantidades de nitrógeno para su crecimiento, que es aportado por los fertilizantes químicos que se añaden al terreno. Solamente algunas plantas de la familia de las leguminosas son capaces de convertir el nitrógeno atmosférico en compuestos nitrogenados. En este proceso interviene la bacteria Rhizobium, que infecta las raíces, formando nódulos donde se aloja, y gracias a un complejo proceso en el cual intervienen al menos 17 genes de la bacteria (genes nif ) se produce la fijación del nitrógeno. Uno de los objetivos prioritarios en este campo es convertir por ingeniería genética plantas no leguminosas en fijadoras de nitrógeno. 29

30 Aumento del valor nutritivo Otro de los objetivos que se persigue en la actualidad es elevar el valor nutritivo, o bien modificar el contenido en determinados elementos, como por ejemplo aminoácidos esenciales o bien de vitaminas, en algunas plantas cuyas semillas, frutos o raíces son utilizadas para la alimentación humana o animal. Las proteínas que se almacenan en las semillas con frecuencia tienen un valor nutritivo deficiente debido a la carencia de alguno de los aminoácidos esenciales para el organismo humano. Una importante mejora es la incorporación de algunos de estos aminoácidos esenciales en la proteína, y así se ha ensayado con el gen de la faseolina, la proteína que se acumula en las habas. La modificación de la secuencia codificadora de esta proteína ha permitido la síntesis de nuevas variedades a las que se la ha incorporado algunos aminoacidos esenciales en la región C-terminal, sin que afecte a la localización y a la funcionalifdad de esta proteína. Otra alternativa es aumentar el contenido de aminoácidos esenciales en forma libre en la semilla. Se ha conseguido en semillas de soja a las que se les ha modificado una enzima de la ruta biosintética del aminoácido lisina. Esta enzima es regulada negativamente por el producto final, pero ha sido sustituida por el gen que codifica la misma enzima en la bacteria E. Coli, de tal forma que esta enzima bacteriana escapa a la regulación y sigue funcionando a pesar de que se se acumule la lisina, lograndose una producción de este aminoácido 100 superior a la normal en las semillas de colza transgénica. La colza se usa para harinas de alimentacional animal a las que tradicionalmente se les suplementa con lisina y otros nutrientes. 30

31 Los ácidos grasos son el componente mayoritario de los aceites vegetales, aproximadamente un 75% procede de las semillas de soja, palma, colza y girasol, y la gran mayoría se dedican al consumo humano. Uno de los objetivos es modificar el grado de insaturación de estos aceites para hacerlos mas saludables. En el caso de la colza se dispone actualmente de distintas variedades modificadas genéticamente, productoras de semillas con diferente composición de ácidos grasos, que ya estan siendo cultivadas en el campo. Las vitaminas representan una de las carencias nutricionales más graves en los paises subdesarrollados. Un ejemplo muy reciente, y muy aireado en los medios de comunicación, ha sido la obtención del arroz dorado (golden rice) que expresa β caroteno, un precursor de la vitamina A que se acumula en el endospermo del grano. Esta variedad transgénica puede contribur a paliar de forma notable las enfermedades relacionadas con la carencia de vitamina A en los países donde este problema es endémico debido a la dieta pobre y poco variada Maduración controlada de frutos y flores La maduración del fruto es un proceso natural que froma parte del envejecimiento del vegetal, pero supone un problema bastante grave desde el punto de vista comercial ya que el proceso de maduración puede ser bastante rápido comparado con los largos plazos de la comercialización agrícola actual y además el fruto maduro sufre importanes deterioros en su manipulación, lo que acarrea importantes pérdidas y hace que actualmente se recolecte mucho antes de los que seria el punto óptimo para su consumo, pero esto provoca que no desarrollen todo su sabor y aroma. 31

32 Durante la maduración se activan ciertos genes como los que codifican a las enzimas celulasa y poligalacturonasa, que degradan las paredes de las células y provocan el ablandamiento del fruto. La inhibición de estos genes puede producir un retraso en la maduración. Esta fue la estrategia que se siguió para la obtención de la primera planta GM que se comercializó. La compañía Calgene, utilizó la tecnología denominada antisentido, que ya hemos comentado para inactivar el gen de la poligalacturonasa lo que resultaba en una reducción del 90% en la actividad de esta enzima y un retraso considerable en la maduración, que permite recolectar la fruta de la planta con todo su aroma, color y sabor, y es posible todavia su comercialización sin que se estropee es este periodo. Se han aislado otros genes que relacionados con el proceso de maduración, que se activan por un aumento de la producción de etileno, verdadera hormona de la maduración, y de la actividad respiratoria de las células. Uno de estos genes es la enzima ACCS (aminociclopropano,1- carboxi sintetasa) fundamental en la síntesis de etileno. Una de las estrategias que se han utilizado ha sido clonar un gen bacteriano que produce una enzima que degrada la ACCS. Este procedimiento se ha utilizado para la obtención de tomates transgénicos que tienen una inhibición del 90% en la producción de etileno y cuya maduración se retrasa hasta tres meses. De este modo los tomates se recogen de la planta y se maduran por tratamiento externo con etileno, conservando el mismo color, textura, aroma y sabor que los madurados en la propia mata. Del mismo modo, hoy día se trata de obtener flores ornamentales que tarden en marchitarse. Se ha ensayado con claveles modificados genéticamente, portadores de un gen antisentido para bloquear la síntesis de etileno. 32

33 Tolerancia a condiciones ambientales extremas Las plantas están sometidas a cambios drásticos de temperatura, de niveles de agua y de salinidad en el suelo. Debido a su inmovilidad las plantas no pueden escapar de estas situaciones de estrés que provocan la pérdida de importantes cosechas. Para resistir a estas condiciones extremas, determinadas plantas han desarrollado diferentes mecanismos que pueden ser aprovechados para la mejora de plantas agrícolas. Hoy día, se han caracterizado algunos genes implicados en la tolerancia de determinadas plantas a situaciones extremas de temperatura, aridez, salinidad etc., y se pretende su utilización para modificar cultivos de interés agrícola. La salinización de los suelos es uno de los principales factores limitantes de la producción agrícola a nivel mundial, y es un problema derivado fundamentalmente de la práctica del regadio. Se calcula que una superficie de más de 80 millones de hectáreas está afectada por severos problemas de salinidad, y que cada año se añaden 5 millones de hectáreas más. Algunas de estas tierras han quedado fuera del uso agrícola o solo pueden utilizarse para el cultivo de especies tolerantes. Algunas plantas viven en ambientes sometidos a periodos de largas sequias y alta salinidad. Para sobrevivir estas plantas sintetizan unas moléculas denominadas genéricamente osmoprotectores, que facilitan la retención de agua y protegen y estabilizan a las macromoléculas celulares frente a concentraciones iónicas elevadas. Estos osmoprotectores son pequeñas moléculas de determinados azúcares, alcohóles, y sales de amonio cuaternario como la betaína. La betaína es sintetizada por las plantas y tambien por algunas bacterias. El gen beta de Escherichia coli ha sido utilizado para obtener plantas 33