VALIDACIÓN DE UN MÉTODO DE DIGESTIÓN DE HIERRO IN VITRO PARA LA EVALUACIÓN DE LA BIODISPONIBILIDAD DE HIERRO EN ALIMENTOS

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1 VALIDACIÓN DE UN MÉTODO DE DIGESTIÓN DE HIERRO IN VITRO PARA LA EVALUACIÓN DE LA BIODISPONIBILIDAD DE HIERRO EN ALIMENTOS INGRID JOHANNA ARAGÓN GALLEGO Proyecto de trabajo de grado presentado como requisito parcial para optar al título de Química Directora HELENA PACHÓN Nutricionista, Ph.D. Co-director NORBERTO BENITEZ Químico, Ph.D UNIVERSIDAD DEL VALLE FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y EXACTAS PROGRAMA ACADÉMICO DE QUÍMICA SANTIAGO DE CALI 2009

2 RESUMEN Con el presente proyecto se buscó validar el método de dializabilidad de hierro in vitro planteado por Miller et al (1981) y modificado por Argyri et al (2009), para evaluar la biodisponibilidad (BD) de hierro (Fe) en alimentos. Para ello, en primer lugar se validó la técnica colorimétrica de ferrozina para cuantificar Fe y en segundo lugar, se procedió a replicar 2 recetas elaboradas en estudios in vivo; los estudios de Cook y Monsen (1977) y Davidsson et al (2002). Se evaluó la dializabilidad de Fe por el método in vitro y se compararon los resultados obtenidos con los datos publicados del porcentaje absorción de Fe en los estudios in vivo en humanos. De la validación del método de ferrozina se obtuvo que para un rango de concentraciones de 0,5-100 ppm de Fe se encuentra un rango lineal con un coeficiente de correlación r=0,996 (P=0,05). La curva de calibración para el rango de concentraciones comprendidas entre 0,5-5,5 ppm Fe con ecuación Y=0,0341 (+0,0813)X + 0,0035 (+0,633) tiene un 99,8% de correlación. Los límites de detección y cuantificación según el método de Miller (2002) son de 0,115 y 0,382 ppm de Fe, respectivamente y según el método de bajas concentraciones (EAFI, 2001) son de 0,025 y 0,137 ppm de Fe. La precisión dada como la repetibilidad instrumental con un CV=0,106% está dentro del 5% de variabilidad para los CV en la repetibilidad instrumental en técnicas espectrofotométricas. La repetibilidad del método para el ensayo A 1 (evaluando la fase de cuantificación y digestión in vitro de Fe), CV=12,95% y ensayo A 2 (evaluando sólo la fase de cuantificación de Fe), CV=8,34% son menores al CV=14,24% dentro del 15% de variabilidad aceptada en coeficientes de variación. La precisión intermedia para el ensayo A 1, CV=12,072% y ensayo A 2, CV=12,236% son menores al doble del CV aceptado en repetibilidad método para un 15% de variabilidad. En la evaluación de la exactitud por adición de un patrón se demostró que no hay efectos de matriz en las muestras de fríjol analizadas y el porcentaje de recuperación R=93,97% no es significativamente diferente de 100% con un 95% de confianza. Finalmente, de la robustez evaluada por el método de Youden-Steiner, se obtiene que el método es robusto de acuerdo al ensayo A 1, pues las diferencias de los factores evaluados son menores al estimado de Youden de 1,329, sin embargo para el ensayo A 2 se obtiene que los factores solución RPPS y V

3 el ph del buffer HEPES son influyentes en el método de ferrozina, ya que las diferencias de estos factores son mayores en valores absolutos al estimado de Youden de 0,082. En la validación del método de digestión de Fe in vitro se encontró que éste presenta un comportamiento similar a los métodos in vivo. Para el primer estudio (de la receta de Cook y Monsen, 1977), el método in vitro muestra una relación directamente proporcional entre los niveles de ácido ascórbico y el hierro dializado (hierro considerado como biodisponible) tal como se manifiesta en el estudio in vivo. Al correlacionar los resultados obtenidos por el método in vitro con los datos in vivo, se encuentra una alta correlación entre los métodos (r=0,977, P=0,0008). En cuanto al segundo estudio (de la receta de Davidsson et al, 2001), el método in vitro igualmente manifiesta el mismo patrón de respuesta que se da en el estudio in vivo, demostrándose el efecto mejorador del EDTA en la absorción de Fe. Además, se confirma que el compuesto NaFeEDTA tiene una mejor absorción con respecto al tradicional FeSO 4, utilizado en la fortificación y suplementación de Fe en personas con deficiencia de éste mineral. Concluyéndose, que el método in vitro es idóneo para el screening de grandes líneas de material de análisis en centros de investigación como el CIAT, siendo una herramienta que permite realizar análisis comparativos entre variadas matrices alimenticias. A futuro plazo, luego de su valoración en otras matrices alimenticias con diferentes promotores e inhibidores de la absorción de Fe, puede ser una herramienta eficiente para estimar en los alimentos directamente la absorción de Fe en humanos. Áreas de la Química en este trabajo: Química Analítica e Instrumental, Bioquímica (Química Aplicada). VI

4 ABSTRACT The general objective of this project was to validate the in vitro iron dializability method developed by Miller et al (1981) and modified by Argyri et al (2009) to evaluate the bioavailability of iron (Fe) in food. To accomplish this, two activities were carried out. First the ferrozine colorimetry technique to quantify iron was validated and second, two recipes developed in human (in vivo) studies (Cook and Monsen (1977) and Davidsson et al (2002)) were evaluated for iron dializability using the in vitro method and compared with the iron absorption results obtained in the human studies. As part of the ferrozine-method validation, it was established that there is a linear relationship in the iron-concentration range of 0,5-100 ppm, with a correlation coefficient r=0,996 (P=0,05). The calibration curve for the concentration between 0,5-5,5 ppm Fe, with equation Y=0,0341 (±0,0813) X + 0,0035 (±0,633), had a 99,8% correlation. The limits of detection (LD) and quantification (LQ) using the Miller (2002) method were 0,115 and 0,382 ppm Fe, respectively, and according to the method of low concentrations (EAFI, 2001) were 0,025 and 0,137 ppm Fe, respectively. Precision given as instrumental repeatability had a CV=0,106%, which is within 5% of the variability in CV for instrumental repeatability in spectrophotometric techniques. The repeatability of the method for test A-1 (which evaluated iron quantification and in vitro digestion), CV=12,95%, and test A-2 (which evaluated iron quantification only), CV=8,34%, were less than CV=14,24% which is within the accepted 15% variability in coefficients of variation. The intermediate precision for test A-1, CV=12,072%, and test A-2, CV=12,236%, were less than twice the CV of the repeatability method and hence within the accepted 15% variability. The evaluation of accuracy by adding a pattern with known iron quantity showed with 95% conficent no effect of the bean matrix. Further, the 93,97% recovery was not significantly different from 100%. Finally, the Youden- Steiner robustness method was applied. For test A-1, the method is robust since the absolute value of differences of the factors evaluated are less than the Youden estimate VII

5 of 1,329. However, in test A-2 two factors (RPPS solution and the ph of the HEPES buffer) emerged as influential in the ferrozine method, since the absolute value of differences of the factors evaluated were greater than the Youden estimate of 0,082. From the validation of the in vitro Fe-digestion method, it was clear that this method yields results qualitatively similar to in vivo methods. For the first study (the recipe of Cook and Monsen, 1977), the in vitro method showed a directly proportional relationship between the levels of dialyzate Fe (a proxy for bioavailable iron) and ascorbic acid; this was the same trend observed in the in vivo study. Further, there was a high correlation (r=0,977, P=0,0008) in the results obtained by the in vitro method with in vivo data. In the second study (the recipe of Davidssone et al, 2001), the in vitro method also revealed the same pattern of response that occurs in the in vivo study, reflecting the enhancing effect of EDTA on Fe absorption and confirming that the NaFeEDTA compound has a better absorption than FeSO 4 which is traditionally used in the fortification and supplementation of Fe in people deficient in this mineral. In conclusion, the in vitro method is suitable for the screening of a large number of crop breeding lines that are evaluated in research centers such as CIAT, and for comparing iron dialyzability among different foods. After its validation in other food matrices and with different Fe absorption enhancers and inhibitors, the in vitro iron dializability method may be able to predict human Fe absorption from different foods. VIII