Tecnología HaloPlex by Genycell Biotech España

Transcripción

1 Paneles de genes custom-made Tecnología HaloPlex by Genycell Biotech España

2 SERVICIO NGS CLÍNICA HALO: OVERVIEW 1. DISEÑO DEL PANEL DE GENES Y DEL KIT DE CAPTURA

3 2. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA EN EL LABORATORIO GENYCELL BIOTECH, Encuentra S.L. la información Garrido Atienza más completa nº2, Par. 2 en Polígono Industrial Dos de Octubre Pide presupuestos y SANTA realiza FE pedidos GRANADA en sales@genycell.com SPAIN El soporte técnico Tel. lo 902 encontrarás / Fax. en mara@genycell.com

4 Una vez finalizado el protocolo de captura, se lleva a cabo un BioAnalyzer con un chip High-Sensitivity DNA para comprobar que el perfil de cada muestra se parece a esto: Además de verificar que la mayoría de los fragmentos se encuentran entre 22bp5 y 575bp, se hará una cuantificación integrada de cada muestra entre 175bp y 625bp. Si se observa presencia de picos de pequeño tamaño (80bp y/o 130bp) se deberá realizar una segunda ronda de purificación con beads magnéticas. El valor de la cuantificación integrada del BioA en nm se usará para diluir cada muestra a2nm en un total de100ul. Ci Vi = Cf Vf Ci = Concentración integrada del BioA en nm; Cf = 2nM; Vf = 100ul Vi = Cf Vf / Ci Vi = 200 / Ci = ul habrá que pipetear de cada muestra y completar hasta 100ul con agua. Juntar en unpool todas las diluciones. Genycell Biotech comprobará la viabilidad de cada muestra y librería y una vez se tenga la certeza de que todo está bien, se procederá a hacer el pool. Genycell Biotech declina toda responsabilidad sobre los resultados si se comprueba que la preparación del pool no se hizo según los pasos establecidos en este documento.

5 3. SECUENCIACIÓN

6 4. ANÁLISIS DE DATOS 1 AÑO DE ALMACENAMIENTO GENYCELL BIOTECH, Encuentra S.L. la información Garrido Atienza más completa nº2, Par. 2 en Polígono Industrial Dos de Octubre Pide presupuestos y SANTA realiza FE pedidos GRANADA en sales@genycell.com SPAIN El soporte técnico Tel. lo 902 encontrarás / Fax. en mara@genycell.com

7 ANTES DE EMPEZAR 1. REACTIVOS NECESARIOS

8 El kit HaloPlex incluye:

9 2. APARATAJE Y EQUIPAMIENTO NECESARIOS GBio recomienda: Referencia GENYCELL BIOTECH, Encuentra S.L. la información Garrido Atienza más completa nº2, Par. 2 en Polígono Industrial Dos de Octubre Pide presupuestos y SANTA realiza FE pedidos GRANADA en sales@genycell.com SPAIN El soporte técnico Tel. lo 902 encontrarás / Fax. en mara@genycell.com

10 3. REACTIVOS Y EQUIPAMIENTO NECESARIOS PARA LAS VALIDACIONES GBio recomienda:

11 4. REQUERIMIENTOS DEL gdna Estar disuelto en agua. Ratio 260/280 entre 1.8 y 2.0. Ratio 260/230 a partir de 1.8. Comprobación de la integridad de la muestra mediante gel de agarosa. Cuantificación por fluorometría (Qubit o PicoGreen). Evitar cualquier presencia de inhibidores como EDTA.. 5. PUNTOS CRÍTICOS DIGESTIÓN: Mezclar bien las enzimas entre sí y en el orden indicado. HIBRIDACIÓN: No mezclar todas las digestiones sino ir añadiéndolas de una en una al tubo recolector que contiene la solución de inactivación. Se desaconseja profundamente dejar que la hibridación dure más del tiempo establecido en el protocolo. CAPTURA con NaOH: Dejar las muestras en contacto con la NaOH más tiempo del indicado en el protocolo puede tener consecuencias desastrosas. PCR: El número de ciclos de la PCR viene indicado en el CoA el cual está en el BOX 1 de reactivos del kit. PURIFICACIÓN de productos de PCR: Si tras la purificación con las beads magnéticas se observan picos a 80bp y 130bp de mucha intensidad, hacer un segundo round. De hecho, se ha comprobado que hacer directamente dos rondas de purificación con las beads magnéticas mejora visiblemente los resultados. Tres o cuatro lavados con EtOH en vez de dos también son aconsejables, cambiando el strip de posición en el imán para favorecer la interacción de los reactivos.

12 6. CONSEJOS ÚTILES Nombrar cada PCR/incubación y pre-programar el termociclador con cada una de ellas. Pre-calentar la tapa del termociclador a 105ºC. Intentar evitar las rampas de temperatura y favorecer el choque térmico. Para los cálculos de volúmenes de NaOH y Ácido Acético, tener en cuenta que en ambos casos MOLARIDAD = NORMALIDAD ya que en ambos el Nº de Equivalentes = 1. A la hora de trabajar con 12 muestras, es más cómodo hacerlo con 2 strips de 8 tubos y cortarle a cada uno dos pocillos. Marcarlos bien con rotuladores indelebles para saber cuál es el pocillo 1 y cuál el 12. OJO! Porque al añadir EtOH puede que dichas marcas se borren. En el paso 6 (Elución del DNA capturado) es CRÍTICO usar 50mM NaOH preparada a partir de, al menos, 10M NaOH. Dejar atemperar siempre las beads magnéticas antes de utilizarlas. No se podrá seguir adelante con el proyecto (Secuenciación) si las muestras NO CUMPLEN los parámetros de calidad del paso 9 (Validación y cuantificación del DNA target). Para hacer el pool habrá que calcular los ul necesarios para obtener 100ul de solución 2nM de CADA UNA DE LAS MUESTRAS y luego juntar todos esos 100ul en un único eppendorf. Eso será el pool final a secuenciar. GENYCELL BIOTECH, Encuentra S.L. la información Garrido Atienza más completa nº2, Par. 2 en Polígono Industrial Dos de Octubre Pide presupuestos y SANTA realiza FE pedidos GRANADA en sales@genycell.com SPAIN El soporte técnico Tel. lo 902 encontrarás / Fax. en mara@genycell.com