EFECTO SOLVENTE. Los espectros de emisión de algunos fluoróforos son muy sensibles al ambiente circundante, incluyendo al solvente

Transcripción

1 EFECTO SOLVENTE

2 EFECTO SOLVENTE Los espectros de emisión de algunos fluoróforos son muy sensibles al ambiente circundante, incluyendo al solvente A partir de los espectros de emisión de estos fluoróforos unidos a proteínas y membranas se puede inferir la naturaleza del sitio de unión

3 EFECTO SOLVENTE La emisión de un fluoróforo en solución ocurre a λ más largas que la λ de absorción CORRIMIENTO DE STOKES Disipación de energía vibracional Redistribución electrónica en las moléculas de solvente que rodean al fluoróforo en estado excitado Interacciones específicas entre fluoróforo y solvente (enlace de hidrógeno, complejos de transferencia de carga, etc) EG EE

4 EFECTO SOLVENTE Efecto general Se produce por la influencia colectiva del juego entero de moléculas de solvente sobre el fluoróforo. Está relacionado con el índice de refracción (n) y constante dieléctrica (ε) del solvente Efecto específico Interacción específica entre pocas moléculas de solvente y el fluoróforo

5 EFECTOS GENERALES DEL SOLVENTE Diagrama parcial de energía relajación vibracional ( s) S 1 hνα (10-15 s) hνf relajación por solvente (10-11 s) solvente poco polar solvente más polar hν F ( s) S 1 relajado

6 F EFECTOS GENERALES DEL SOLVENTE Los efectos generales del solvente producen corrimientos al rojo a medida que aumenta la polaridad del solvente, pero los espectros son semejantes ÁCIDO 2-ANILINO-6- NAFTALEN SULFÓNICO en: acetonitrilo etilenglicol agua λ

7 EFECTOS GENERALES DEL SOLVENTE Ecuación de Lippert (1960): predice los desplazamientos de Stokes de un fluoróforo en medios de distinta polaridad Se debe verificar: 1) ausencia de efectos específicos 2) que la relajación por solvente sea más rápida que la emisión fluorescente momento dipolar del fluoróforo en estado fundamental y excitado constante dieléctrica ν a ν f = 2 (µ* - µ) 2 ε 1 n 2-1 hc a 3 2ε + 1 2n cte pérdida por relajación vibracional n o de onda de luz absorbida y fluorescente radio de la cavidad donde está el fluoróforo índice de refracción

8 EFECTOS GENERALES DEL SOLVENTE ε 1 n 2-1 2ε + 1 2n f polarizabilidad polarizabilidad electrónica o de alta frecuencia: se relaciona con la redistribución electrónica del solvente al interaccionar con el momento dipolar del fluoróforo en estado excitado (µ*) polarizabilidad molecular o de baja frecuencia: se relaciona con la reorientación entre sí de las moléculas de solvente

9 EFECTOS GENERALES DEL SOLVENTE Interpretación de la ecuación de Lippert Se considera al fluoróforo como un dipolo en un medio continuo de constante dieléctrica homogénea Un dipolo puntual produce un campo eléctrico inducido (R) en el solvente de igual dirección y de sentido contrario al dipolo Este campo eléctrico es distinto en estado fundamental y excitado, y se distingue si debe a factores electrónicos o a la reorientación del solvente.

10 EFECTOS GENERALES DEL SOLVENTE CAMPOS ELÉCTRICOS El campo eléctrico es distinto en estado fundamental (R) y excitado (R*), y se distingue si debe a factores electrónicos (R e y R e* ) o a la reorientación del solvente (R r y R r* ). R = (2 µ/a 3 ) f R e = (2 µ/a 3 ) f(n) R r = (2 µ/a 3 ) f R* = (2 µ /a 3 ) f R* e = (2 µ /a 3 ) f(n) R* r = (2 µ /a 3 ) f

11 EFECTOS GENERALES DEL SOLVENTE Estos campos son fáciles de describir con la siguiente figura: E R* e Redistribución de electrones del fluoróforo, pero no de sus núcleos (Franck Condon) R µ* r µ* R* e hν R* r R e R r µ µ R e R* r El solvente se perturba al cambiar el momento dipolar del analito: primero modificando la posición de sus electrones y después la posición de sus moléculas

12 EFECTOS GENERALES DEL SOLVENTE

13 EFECTOS GENERALES DEL SOLVENTE

14 Las energías implicadas en cada posición del diagrama se calculan de la siguiente manera: Recordar que: E = µr E = hcν Energía en estado vapor (no considera el solvente) Componente de orientación Componente electrónico R* e R r µ* µ* R* e R* r absorción R e R r µ µ emisión R e R* r E abs E abs = E v µr r µr e E* abs = E* v µ R r µ R* e E abs E em = hc (ν a - ν f ) = E em E* em = E* v µ*r* r µ*r* e = hc (ν a(v) - ν f(v) ) (µ*-µ)r r + (µ*-µ)r* r E em = E v µr* r µr e k ν a -ν f = k/hc + (µ*-µ) (R* r -R r )/hc k

15 EFECTOS GENERALES DEL SOLVENTE ν a -ν f = k/hc + (µ*-µ) (R* r -R r )/hc k Expresando los campos de reorientación R r en función de la polarizabilidad Recordar que R r = (2 µ/a 3 ) f ν a -ν b = k + (µ*-µ)/hc (2µ* f/a 3 2µ f/a 3 ) = 2 (µ*-µ) 2 f/hca 3

16 EFECTOS GENERALES DEL SOLVENTE Desplazamiento esperado por efecto general del solvente 2-anilinonaftaleno (2-AN) en hexano y en cloroformo irradiado a 350 nm µ*-µ = 20 D a = 4 A Solvente ε n f ν a -ν f λ em (calcul.) hexano cm nm cloroformo cm nm Sin embargo, la emisión del 2-AN en hexano se detecta a 370 nm Relajación vibracional

17 APLICACIÓN DE LA ECUACIÓN DE LIPPERT Indicadores de polaridad de sitios de unión Se determina la polaridad de un sitio de unión comparando la fluorescencia de una sonda unida a dicho sitio con la fluorescencia de la sonda en solventes de polaridad conocida. (ν a -ν f ) Se prepara una curva de calibración 2/hca 3 (µ*-µ) 2 f A mayor (µ*-µ) de un fluoróforo, mayor pendiente, mayor sensibilidad a cambios de polaridad. Ej: los sulfonatos de N-arilaminonaftaleno son indicadores de polaridad de sitios biológicos

18 EFECTOS GENERALES DEL SOLVENTE Gráficos de Lippert para dos derivados naftilamínicos en mezclas etanol-agua La constante dieléctrica y el índice de refracción del sistema depende de la constante dieléctrica y del índice de refracción de cada solvente y de su respectivo % en la mezcla (promedio ponderado)

19 Desplazamientos de Stokes en distintos solventes (ν a -ν f ) NH 2 solventes apróticos solventes próticos 2-anilinonaftaleno (ν a -ν f ) f - O C OR f + 9-metil antroato

20 Interacción química entre fluoróforo y unas pocas moléculas vecinas de solvente durante el tiempo de vida del estado excitado 2-anilinonaftaleno en ciclohexano, y en ciclohexano con cantidades crecientes de etanol F EFECTOS ESPECÍFICOS DEL SOLVENTE 0 % etanol 0.2 % etanol 0.4 % etanol 1.7 % etanol 100 % etanol λ Efecto general

21 Otro ejemplo: O HO CH 3 C CH3 2-acetilantraceno Fluorescencia de 2-acetilantraceno en hexano-dioxano Al aumentar el % de dioxano (hasta 100 %) el máximo de emisión se corre paulatinamente efecto general Fluorescencia de 2-acetilantraceno en hexano-metanol 1-2 % de metanol (% pequeño para modificar ε y N) producen un corrimiento brusco del máximo de emisión efecto específico Se produce enlace de hidrógeno entre metanol y grupo carbonilo del fluoróforo durante el tiempo de vida del estado excitado (el espectro de absorción no se modifica)

22 Espectros de 2-acetilantraceno en mezclas hexano-metanol Metanol 0.34 M 0.2 M 0.12 M M 0.05 M 0.03 M 0 M

23 DOS: Trans-4- dimetilamino- 4 -(1-oxobutil)- estilbeno Espectros de emisión de DOS en ciclohexano (CH), tolueno (T), acetato de etilo (EA) y butanol (B). La línea punteada muestra el espectro de emisión del DOS en vesículas de DPPC (dipalmitoil fosfatidil colina)

24 Otro ejemplo de efecto solvente DNS: 4-dimetilamino-4 - nitroestilbeno hexano ciclohexano tolueno acetato de etilo butanol

25 EJERCICIOS 1) Calcular el desplazamiento de Stokes de 2-aminonaftaleno (2-AN) en hexano y en cloroformo cuando se irradia a 350 nm. El valor (µ*-µ) para 2-AN es 20 D y el a = 4 Å Recordar 1debye (D) = 3.34x10-30 c x m Constante de Plank (h) = 6.63x10-34 J x s Velocidad de la luz (c) = 3 x 10 8 m x s -1 Factor de la ley de Coulomb (k) = 9x10 9 J x m/c 2

26 2) Usar los siguientes datos de corrimientos de Stokes de PRODAN en distintos solventes para calcular el cambio de su momento dipolar al pasar al estado excitado. Analizar si existen efectos específicos de solvente. Buscar en tabla los valores de índices de refracción y constantes dieléctricas. Considerar: a = 4.2 Å H 3 C H 3 C N O C CH 2 CH 3 PRODAN 6-propionil-2-(dimetilamino)naftaleno Solvente Máx. absorción (nm) Máx. emisión (nm) ciclohexano trietilamina clorobenceno cloroformo acetona ,3-propilen glicol metanol agua