RESOLUCIÓN OIV-OENO

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1 RESOLUCIÓN OIV-OENO MÉTODO DE DETERMINACIÓN DE LAS AMINAS BIÓGENAS EN EL VINO POR CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN CON DETECTOR DE FOTODIODOS LA ASAMBLEA GENERAL, Visto el artículo 2 párrafo 2 iv del Acuerdo del 3 de abril de 2001 por el que se crea la Organización Internacional de la Viña y el Vino, Por propuesta de la Subcomisión Métodos de Análisis, DECIDE introducir en el Compendio de los Métodos Internacionales de Análisis de los Vinos y de los Mostos el método de tipo IV que se expone a continuación: MÉTODO DE DETERMINACIÓN DE LAS AMINAS BIÓGENAS EN EL VINO POR CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN CON DETECTOR DE FOTODIODOS Método de tipo IV 1. Ámbito de aplicación Este método se aplicará al análisis de las aminas biógenas en los vinos: Aminas Histamina Metilamina Etilamina Tiramina Putrescina Cadaverina Fenetilamina (o Feniletilamina) Isoamilamina Ámbito de aplicación 0,500 a 20 mg/ L 0,250 a 20 mg/ L 0,450 a 20 mg/ L 0,235 a 20 mg/ L 0,098 a 20 mg/ L 0,480 a 20 mg/ L 0,096 a 20 mg/ L 0,020 a 20 mg/ L 1

2 2. Definición El término biógeno significa engendrado por la vida. La denominación aminas biógenas se aplicará entonces a todas las aminas procedentes del metabolismo de las células vivas, animales, vegetales o microbianas. En su mayoría, las aminas biógenas del vino son de origen microbiano. Las principales son la histamina, la putrescina, la cadaverina y la tiramina. 3. Principio Las aminas biógenas que se estudian aquí son aminas primarias, secundarias o terciarias, alifáticas o aromáticas. Sin embargo, solo las aminas aromáticas absorben en el UV. De hecho, para la detección de las moléculas por UV será necesaria la presencia de un cromóforo en la molécula, por lo general una secuencia de enlaces dobles conjugados. Para poder utilizar el HPLC/DAD habrá que acoplar entonces un cromóforo a las aminas biógenas. Para ello, se utilizará el 2-(etoximetileno) malonato de dietilo (DEEMM), el cual, a través de una alquilación, también llamada derivatización, permitirá obtener las aminas biógenas visibles por el detector de fotodiodos [1]. Reacción de derivatización Nota: El rendimiento de la derivatización se calculará añadiendo un patrón interno (clorhidrato de 2, 4, 6 - Trimetil fenetilamina o 2, 4, 6 TPA). Cada una de las aminas biógenas se cuantificará frente a una curva de calibrado. 4. Reactivos y productos 4.1. Lista de reactivos Referencias de los productos: Producto CAS Pureza Histamina % Metilamina >99,5% Etilamina % Tiramina % Putrescina (diaminobutano) % 2

3 Producto CAS Pureza Cadaverina (diaminopentano) % Fenetilamina % Isoamilamina % Ácido bórico ,5% Hidróxido de sodio % Azida de sodio ,5% Clorhidrato de 2, 4, 6 Trimetil fenetilamina % DEEMM 2-(etoximetileno) malonato de dietilo % Ácido acético glacial ,7% Metanol HPLC ,9% Acetonitrilo HPLC ,93% Ácido clorhídrico % Agua ultrapura (18 MΩ) 5. Solución de patrón interno Preparación de una solución de 2 g/l: Pesar 20 mg de clorhidrato de 2, 4, 6 Trimetil fenetilamina (4.1.12). Disolver en 10 ml de HCl 0,1 M (5.1) Conservación La solución puede conservarse a temperatura ambiente Solución HCL 0,1 M Preparación de una solución de HCl 0,1 M: Tomar unos 900 ml de agua ultrapura (4.1.18) con una probeta (6.13) Verter unos 500 ml de agua ultrapura (4.1.18) en un matraz aforado de 1 L (6.9) Tomar 100 ml de HCl 1 M (preparada a partir del producto comercial ) con una probeta (6.11) Verter los 100 ml de HCl 1 M (4.1.17) en un matraz aforado (6.9) Completar hasta alcanzar un litro con el agua mili Q restante Conservación La solución puede conservarse a temperatura ambiente. 3

4 5.2. Tampón borato 1 M Para 100 ml de solución: Pesar 6,183 g de ácido bórico (4.1.9) Disolver en un vaso de precipitados (6.2) junto con 80 ml de agua ultrapura (medir con la probeta graduada) (6.11) Ajustar el ph a 9 con una solución de NaOH 4M (preparada a partir del producto comercial ) Enrasar a 100 ml en un matraz aforado (6.7) Observaciones: Para conseguir una solución adecuada, será conveniente que los cristales de ácido bórico se disuelvan con el ph más bajo posible. Para ello, se añadirá el NaOH en pequeñas cantidades (10 gotas de pipeta Pasteur) (6.30) durante unas tres horas. Conservación La solución puede conservarse a temperatura ambiente Fase móvil HPLC Fase móvil A: tampón acetato 25 mm + 0,02% de azida de sodio ph 5.8: Tomar 1,8 L de agua ultrapura en un vaso de precipitados de 2 L (6.3) Añadir 2,86 ml de ácido acético glacial (4.1.14) (aclarar bien la punta en el vaso de precipitados) Después añadir 0,4 g de azida de sodio (4.1.11) Agitar con el agitador magnético (6.24) Ajustar el ph a 5.80 con NaOH 4M añadiéndolo con una pipeta Pasteur (6.30) (unos 6,5 ml) Enrasar a 2000 ml en un matraz aforado de 2000 ml (6.10) Fase móvil B: Acetonitrilo/Metanol (80/20): Para 2 L de fase móvil Tomar 400 ml de metanol (4.1.15) con una probeta graduada y pasarlos a un frasco de 2 L (6.20) y añadir en el mismo frasco 1600 ml de acetronitrilo (4.1.16) medidos con una probeta graduada (6.14). Conservación La solución puede conservarse a temperatura ambiente. 4

5 5.4. Curva de calibrado para aminas biógenas Preparación de las soluciones A: Solución madre A de 500 mg/l Pesar aproximadamente 50 mg (anotar el peso medido) de histamina (4.1.1), metilamina (4.1.2), etilamina (4.1.3), tiramina (4.1.4) y putrescina (4.1.5), y disolverlos dentro del mismo matraz de 100 ml (6.7) con HCl 0,1 M (5.1) Solución de trabajo A de 50 mg/l Tomar 25 ml de la solución A de 500 mg/l y verterlos en un matraz de 250 ml (6.8) Enrasar hasta alcanzar los 250 ml con HCl 0,1 M (5.1) Solución de trabajo A de 40 mg/l Tomar 50 ml de HCl de 0,1 M (5.1) y verterlos en un matraz de 250 ml (6.8) Enrasar hasta alcanzar los 250 ml con la solución de trabajo A de 50 mg/l Preparación de las soluciones B Solución madre B de 500 mg/l Pesar aproximadamente 50 mg (anotar el peso medido) de cadaverina (4.1.6), fenetilamina (4.1.7) e isoamilamina (4.1.8), y disolverlos dentro del mismo matraz de 100 ml (6.7) con HCl 0,1 M (5.1) Solución de trabajo B de 50 mg/l Tomar 25 ml de la solución B de 500 mg/l y verterlos en un matraz de 250 ml (6.8) Enrasar hasta alcanzar los 250 ml con HCl 0,1 M (5.1) Solución de trabajo B de 10 mg/l Tomar 50 ml de la solución de trabajo B de 50 mg/l y verterlos en un matraz de 250 ml (6.8) Enrasar hasta alcanzar los 250 ml con HCl 0,1 M (5.1) Unión de las soluciones A y B Curva de calibrado En un matraz de 100 ml (6.7), añadir 50 ml de la solución A de 40 mg/l medidos con un matraz aforado de 50 ml (6.6) Enrasar hasta alcanzar los 100 ml con la solución B de 10 mg/l: se obtendrá la solución de 20 (A) / 5 (B) mg/l 5

6 La siguiente tabla explica cómo elaborar los puntos de concentración para la curva de calibrado: Concentración de la solución inicial Volumen añadido de solución (ml) Enrasar con una solución de HCl 0,1 M (ml) Concentración de la solución final (mg/l) 20(A) /5 (B) (A) / 2,5 (B) 10(A) / 2,5 (B) (A) / 1,25 (B) 5(A) / 1,25 (B) (A) / 0,25 (B) De este modo, se obtendrán cuatro concentraciones para las aminas biógenas contenidas en la solución A (20, 10, 5 y 1 mg/l) y cuatro concentraciones para las aminas biógenas contenidas en la solución B (5; 2,5; 1,25 y 0,25 mg/l). Conservación Será necesario conservar las soluciones a -20 C. 6. Materiales y equipo Vasos de precipitado de 25 ml Vasos de precipitado de 250 ml Vasos de precipitado de 2000 ml Matraces aforados de 10 ml Matraces aforados de 25 ml Matraces aforados de 50 ml Matraces aforados de 100 ml Matraces aforados de 250 ml Matraces aforados de 1000 ml Matraces aforados de 2000 ml Probetas de 100 ml Probetas de 500 ml Probetas de 1000 ml Probetas de 2000 ml Pipeta automática de 200 µl Pipeta automática de 1 ml Pipeta automática de 5 ml Pipeta automática de 10 ml Puntas para pipetas automáticas de 1 ml, 5 ml y 10 ml Frasco de 2 litros Tubos Pyrex de 10 ml para hidrólisis con tapón de rosca Viales de 2 ml con rosca adaptable al inyector Balanza analítica para pesar entre 0 y 205 g Agitador magnético 6

7 Cromatógrafo de líquidos de alta resolución (HPLC) Software de adquisición de datos Detector DAD (de diodos o UV) Columna de tipo Octadecyl (por ejemplo HP C 18 - HL, 250 mm x 4,6 mm, 5 µm) Baño seco a 70 C Pipeta Pasteur Baño de ultrasonido 7. Muestreo (preparación de las muestras) Para este método no será necesario un muestreo en particular, puesto que se toma y deposita directamente 1 ml de vino en un tubo Pyrex de 10 ml para hidrólisis con tapón de rosca (6.21) (véase procedimiento). Sin embargo, se recomienda llevar a cabo la reacción de derivatización con DEEMM una vez recibida la muestra, ya que la concentración de histamina puede disminuir en el vino con el paso del tiempo. 8. Procedimiento 8.1. Muestra de análisis Será obligatorio realizar la manipulación en campana, debido a la toxicidad de algunos reactivos. Si el tampón borato contiene cristales, habrá que calentarlo a 50 C agitándolo (poco a poco al principio, hasta que la solución se caliente). Para evitar el riesgo de absorción en la punta de las pipetas automáticas, se recomienda utilizarlas de la siguiente manera: - Mojar previamente una vez la punta de la pipeta con la solución a analizar - Añadir la solución al recipiente sin aclarar la punta con el contenido del recipiente, salvo que se indique lo contrario Agitar las soluciones antes de usarlas (sobre todo el vino congelado) En un tubo Pyrex de 10 ml para hidrólisis con tapón de rosca (6.21), introducir con las micropipetas adecuadas: - 1,75 ml de tampón borato (5.2) µl de metanol (4.1.15) - 1 ml de muestra para derivatizar (pipeta automática de 1 ml) (6.16) - 40 µl de patrón interno (2, 4, 6 TPA a 2 g/l) (5) - 30 µl de DEEMM (4.1.13) Cerrar el tubo (cerrarlo fuerte para evitar evaporaciones) y agitar manualmente. Encender el baño seco (6.29) a 70 C. 7

8 Introducir el tubo en el baño de ultrasonidos (6.31) durante 30 minutos (2 veces 15 minutos agitándolo cada 5 minutos). Será obligatorio utilizar una gradilla de plástico apta para el baño de agua ya que la derivatización se realiza mal cuando se utiliza una gradilla metálica. Calentar la mezcla reactiva a 70 C durante 1 hora en el baño seco (6.29) para eliminar el exceso de DEEMM. Apagar el baño seco. Una vez alcanzada la temperatura ambiente, rellenar los viales de 2 ml con la pipeta Pasteur (cambiar de pipeta Pasteur con cada tubo). Agitar los tubos manualmente antes del análisis Condiciones para el procedimiento Las condiciones para el procedimiento aquí expuestas se indican a modo de ejemplo. Fase móvil: - A: tampón acetato 25 mm + 0,02% de azida de sodio ph 5.8: - B: Acetonitrilo/Metanol (80/20): Gradiente de elución siguiente con un flujo de 0,9 ml/min: Temperatura de la columna: 15 C Longitud de la onda de detección: 280 nm Flujo: 0,9 ml/min Volumen inyectado: 50 μl Duración del análisis: 57 minutos Tiempo (min) % A % B Identificación de las aminas biógenas: Las aminas biógenas se identificarán en función de su tiempo de retención. Para ello, se analizará cada una de ellas de manera individual para establecer su tiempo de retención (Tr). 8

9 Aminas Tr medio (min) Histamina HI 25,46 Metilamina ME 33,11 Etilamina ET 39,00 Tiramina TY 41,50 Putrescina PU 46,00 Cadaverina CA 48,00 Fenetilamina PH 48,75 Isoamilamina IS 50,25 Patrón interno 2,4,6 TPA 54,75 9. Cálculos (resultados) Los sesgos ocasionados por la indeterminación con respecto a la derivatización y al volumen de inyección se podrán corregir mediante el uso del patrón interno. Una vez corregido el valor del máximo, la concentración de aminas biógenas se calculará a partir del valor de la pendiente de la curva de calibrado de la amina biógena correspondiente. Para ello, por cada serie de análisis se derivatizará y después inyectará una curva de calibrado. Los resultados se expresarán en mg/l con una cifra significativa tras la coma. 10. Control de calidad Se podrán realizar controles de calidad con los materiales de referencia certificados, con vinos cuyas características proceden de un consenso o vinos en los que se han incluido añadidos de manera dosificada y regular en las series analíticas y siguiendo las tablas de control correspondientes. 11. Características del método: parámetros de validación intralaboratorio Los parámetros de validación se establecerán según [4] Linealidad El enfoque elegido para el estudio de linealidad consiste en comparar las desviaciones estándar residuales de un modelo de regresión lineal y de un modelo de regresión polinomial de segundo grado. Este estudio se llevó a cabo en dos vinos diferentes enriquecidos con aminas biógenas en concentraciones de 0, 1, 5, 10 y 20 mg/l (solución A) y de 0; 0,25; 1,25; 2,5 y 5 mg/l (solución B). 9

10 Resumen de los resultados para las aminas biógenas: Aminas Biógenas S res Lineal S res Orden 2 DS 2 PG F(5%) Conclusión Metilamina 0,766 0,606 3,218 8,757 Lineal Etilamina 0,371 0,371 0,140 1,014 Lineal Tiramina 1,065 1,065 1,135 1,000 Lineal Putrescina 0,524 0,523 0,286 1,043 Lineal Cadaverina 0,276 0,267 0,134 1,881 Lineal 4,75 Fenetilamina 0,251 0,248 0,082 1,328 Lineal Isoamilamina 0,216 0,215 0,055 1,199 Lineal Histamina 0,591 0,589 0,316 1,084 Lineal Especificidad El principio de la medida de la especificidad consiste en estudiar la recta de regresión r = a + bv y comprobar que la pendiente b sea equivalente a 1 (Tobs < Tcritica) y que la ordenada en el origen a sea equivalente a 0 (T obs < Tcritica). Para comprobar las hipótesis se realizará un test de Student asociado a un riesgo de error de un 1%. El valor de Tcritico, bilateral [p-2; 1%] asociado al riesgo de error de 1% por 3 grados de libertad es de 4,541. Resumen de los resultados para las aminas biógenas Aminas Vino A Vino B Vino C Vino D Biógenas T obs T obs T obs T obs T obs T obs T obs T obs Metilamina 4,482 2,321 2,933 0,013 1,563 0,007 5,199 2,864 Etilamina 0,411 0,002 0,081 0,010 0,546 10,556 0,169 2,537 Tiramina 1,834 0,005 0,636 0,005 2,151 4,485 3,420 37,419 Putrescina 7,605 0,041 0,604 0,000 3,257 0,064 2,135 0,011 Cadaverina 5,499 0,033 1,719 1,314 10,929 0,049 8,466 0,026 Fenetilamina 3,348 0,016 1,265 0,001 10,238 0,034 5,925 0,009 Isoamilamina 12,980 0,016 2,297 0,004 12,966 0,020 11,121 0,000 Histamina 4,978 0,250 1,222 0,006 3,128 0,014 1,229 0, Repetibilidad Para el estudio de repetibilidad, se seleccionaron siete vinos tintos diferentes y se hicieron tres repeticiones en cada uno. Las concentraciones oscilaron entre los 0,5 mg/l y los 15 mg/l en función de la amina biógena y del vino. 10

11 Aminas Biógenas S r (mg/l) r (mg/l) Rango de validación (mg/l) Metilamina 0,335 0, Etilamina 0,173 0, Tiramina 0,276 0, Putrescina 0,500 1, Cadaverina 0,025 0,069 0,2 0,8 Fenetilamina 0,028 0,079 0,3 1,1 Isoamilamina 0,017 0,048 0,1 0,8 Histamina 0,108 0, Reproducibilidad Para el estudio de reproducibilidad, se seleccionaron tres vinos tintos diferentes y se realizaron dos repeticiones diferentes para cada uno de ellos. Aminas Biógenas S R (mg/l) R (mg/l) Rango de validación (mg/l) Metilamina 0,533 1, Etilamina 0,884 2, Tiramina 0,341 0, Putrescina 0,419 1, Cadaverina 0,172 0,482 0,2 0,8 Fenetilamina 0,053 0,150 0,3 1,1 Isoamilamina 0,056 0,157 0,1 0,8 Histamina 1,333 3, Límites de detección (LOD) y de cuantificación (LOQ) Según un estudio intralaboratorio que utilizó el método de las diluciones sucesivas con una solución de 0,5 mg/l, que se diluyó en serie hasta alcanzar los 0,01 mg/l: Aminas LOD (mg/l) LOQ (mg/l) Histamina HI 0,167 0,500 Metilamina ME 0,083 0,250 Etilamina ET 0,150 0,450 Tiramina TY 0,078 0,235 Putrescina PU 0,033 0,098 Cadaverina CA 0,160 0,480 Fenetilamina PH 0,032 0,096 Isoamilamina IS 0,007 0,020 11

12 12. Bibliografía [1] Gómez-Alonzo S., Hermosín-Gutiérrez I., García-Romero E., Simultaneous HPLC analysis of biogenic amines, amino acids, and ammonium Ion as Aminoenone derivatives in wine and beer samples. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 55, [2] Tricard C., Cazabeil J.-M., Salagoïti M.H. (1991): dosage des amines biogènes dans les vins par HPLC, Analusis, 19, M53-M55. [3] COMPENDIO DE LOS MÉTODOS INTERNACIONALES DE ANÁLISIS OIV, Aminas biógenas por HPLC, Método OIV-MA-AS315-18, Análisis de las aminas biógenas de mostos y vinos mediante CLAR (Resolución OIV-Oeno ). [4] Guía práctica para la validación, el control de calidad y la estimación de la incertidumbre de un método de análisis enológico alternativo. Resolución Oeno 10/2005. OIV. Octubre