Estandarización del laboratorio para la creación de una unidad de control del tratamiento con anticoagulantes orales

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1 ORIGINAL Estandarización del laboratorio para la creación de una unidad de control del tratamiento con anticoagulantes orales Laboratory standardization for the creation of a control unit of oral anticoagulants treatment Olga Pantaleón Bernal I ; María Eugenia Triana Mantilla II ; Alfredo Aldama Figueroa III ; María Josefa Garrido Reyes IV ; Mireya Alonso Ríos V ; Teresa Sánchez de León V I Especialista de I grado en Bioquímica Clínica. Investigadora Auxiliar. Instituto Nacional de Angiología y Cirugía Vascular. Ciudad de La Habana, Cuba. II Licenciada en Bioquímica. Investigadora Titular. Instituto Nacional de Angiología y Cirugía Vascular. Ciudad de La Habana, Cuba. III Especialista de II grado en Fisiología Normal y Patológica. Doctor en Ciencias Médicas. Instituto Nacional de Angiología y Cirugía Vascular.Ciudad de La Habana, Cuba. IV Técnica de Laboratorio Clínico. Instituto Nacional de Angiología y Cirugía Vascular. Ciudad de La Habana, Cuba. V Técnico de Laboratorio Clínico. Instituto Nacional de Angiología y Cirugía Vascular. Ciudad de La Habana, Cuba. RESUMEN OBJETIVO: Desarrollar las bases para garantizar la estandarización del laboratorio con el fin de obtener calidad técnica en la fase analítica del control del tratamiento con anticoagulantes orales. MÉTODOS: Los tiempos de protrombina se realizaron mediante el método manual y el automatizado, con el uso de dos coagulómetros y del reactivo Thrombotest. El control de calidad se realizó con el empleo de plasma anticoagulado comercial AK y plasma anticoagulado obtenido en el laboratorio. Se realizaron pruebas de repetibilidad y reproducibilidad y se determinó el valor de referencia de la Razón Internacional Normalizada, así como el porcentaje de actividad de coagulación. Se calibró localmente el reactivo Thrombotest, con el uso de plasmas liofilizados con los coagulómetros. Se confeccionaron las curvas de referencia y se calculó de forma gráfica su sensibilidad. RESULTADOS: Los tiempos de protrombina fueron expresados en términos de Razón Internacional Normalizada. Se demostró precisión y exactitud en las 34

2 determinaciones. La calibración del reactivo Thrombotest demostró su elevada sensibilidad calculada localmente. CONCLUSIONES: Se introdujo la forma correcta de expresión de los resultados del tiempo de protrombina, así como se estandarizó el uso de un reactivo de alta sensibilidad, necesario para el control del tratamiento con cumarínicos. Se introdujo un sistema adecuado de control de calidad interno. Palabras clave: control del tratamiento anticoagulante oral, tiempo de protrombina, control de calidad. ABSTRACT OBJECTIVE: To develop the bases for to guarantee the laboratory standardization to obtain the technique quality in the analytical phase of oral anticoagulants treatment control. METHODS: The prothrombin times were performed by manual and automated method using two coagulometers and the reactant Thrombotest. The quality control was performed using the commercial AK anticoagulation plasma and the anticoagulation plasma obtained in laboratory. Tests of reproducibility and repeatability were carried out and the reference value of the Standardization International Ratio, as well as the coagulation activity percentage. The reactant Thrombotest was locally calibrated using the lyophilization plasmas using the coagulometers. The reference curves were plotted and its sensitivity was graphically estimated. RESULTS: The prothrombin times were expressed in terms of the Standardized International Ratio. The accuracy and precision were demonstrated in the determinations. The calibration of reactant Thrombotest showed its locally estimated high sensitivity. CONCLUSIONS: The correct way of prothrombin time results expression was introduced, and the standardization of use of a high sensitivity reactant needed for treatment control of coumarin anticoagulants, as well as a appropriate system of internal quality control. Key words: Oral anticoagulant treatment control, prothrombin time, quality control. INTRODUCCIÓN Para evitar la aparición de episodios tromboembólicos se utilizan los anticoagulantes orales (ACO) o derivados cumarínicos, los cuales llevan implícito en su uso un elevado riesgo hemorrágico, o por el contrario, problemas que derivan del fracaso de la terapéutica. Esto es debido al estrecho margen que existe entre dosis que son insuficientes, las adecuadas y las que resultan excesivas, y además a la variabilidad individual en la respuesta al medicamento. Es por esta razón que se hace necesaria una vigilancia estrecha y periódica del paciente anticoagulado. 1 El control del tratamiento con anticoagulantes orales consta de tres partes vinculadas estrechamente entre sí: el control de laboratorio, el control terapéutico y 35

3 la educación del paciente. Este vínculo se logra solamente cuando se trabaja con un sistema organizado en el que participa un personal especializado que asegure la calidad del servicio brindado. Esta estructura se traduce funcionalmente en el desarrollo de unidades para el control de este tratamiento, las cuales se caracterizan por ofrecer calidad tanto en el control de laboratorio como en la atención desde el punto de vista clínico-terapéutico al paciente. 1-3 El presente trabajo tiene como objetivo establecer las bases que garanticen una adecuada estandarización del laboratorio para ofrecer calidad técnica en la fase de la analítica como parte del proceso de creación de una unidad de control de tratamiento con anticoagulantes orales. MÉTODOS Se realizó un estudio descriptivo, de laboratorio y longitudinal en el laboratorio de Bioquímica, del Instituto Nacional de Angiología y Cirugía Vascular. Se trabajó con los pacientes que asistían a la consulta de control de la terapia con anticoagulantes orales. Para realizar la estandarización del laboratorio se tuvieron en cuenta dos aspectos fundamentales: la fase preanalítica y la analítica. I. Fase preanalítica 1. Calidad de las extracciones sanguíneas Las extracciones de sangre fueron realizadas en el horario de la mañana, por un mismo técnico, y sin traumatismos. Las muestras fueron tomadas con jeringuillas plásticas desechables, de una vena del antebrazo y colectada en tubos de centrífugas plásticos que contenían, como anticoagulante, citrato trisódico al 0,129 mol/l, en una proporción sangre: anticoagulante de 1: Precisión en la reconstitución de los reactivos Los reactivos fueron reconstituidos con exactitud, mediante el uso de pipetas de precisión automáticas. Se respetó las instrucciones de utilización aportadas por el fabricante. 3. Tiempo de procesamiento de las muestras La sangre de los pacientes bajo tratamiento con ACO fue procesada inmediatamente después de haberse realizado la extracción. 4. Temperatura de trabajo La temperatura de trabajo se mantuvo a 37ºC, tanto para los coagulómetros como para el baño termostatado, mientras que el área del laboratorio se mantuvo a 18ºC. II. Fase analítica 36

4 Los tiempos de protrombina (TP) se realizaron mediante el método manual y con el uso de dos coagulómetros electromecánicos: 1) el KC4 Amelung GMBH y 2) el Trombotrack de un canal NYCOMED, SA. El reactivo de tromboplastina (TPL) empleado fue el Thrombotest NYCOMED, SA, cuyo índice de sensibilidad internacional (ISI) era menor de 1,2. El tiempo de protrombina normal medio (TPNM), para determinar la Razón Internacional Normalizada (INR), se halló calculando la media geométrica de los TP realizados por duplicado a las muestras provenientes de 20 donantes supuestamente sanos. Los resultados fueron expresados en INR. El control de calidad de los TP se realizó con el uso de plasma control AK NYCOMED, SA con un rango de INR conocido, previo al procesamiento de las muestras de los pacientes. En ambos casos se efectuó el mismo procedimiento de laboratorio. Se determinó la media de los INR del plasma control mensualmente durante dos años y se confeccionaron los gráficos de control de calidad. Se hizo una mezcla con los plasmas obtenidos de los pacientes anticoagulados (N=20), bajo las condiciones del laboratorio. Se realizaron las pruebas de repetibilidad y reproducibilidad. Se determinó el valor de referencia de INR y el porcentaje de actividad de coagulación. Para la automatización de las determinaciones del TP se calibró el reactivo Thrombotest manualmente y con los dos coagulómetros. Se utilizaron los plasmas liofilizados del juego de reactivos AK-Calibrant INR Calibration Set (Immuno AG). Se confeccionaron las curvas de referencia de INR y se calculó de forma gráfica (según recomendación del fabricante) el ISI local de la TPL. El TP de plasma normal del laboratorio equivalente al TPNM se calculó mediante el mismo juego de reactivos. RESULTADOS La figura 1 muestra el comportamiento del control de la calidad de las determinaciones del TP realizadas con el plasma control comercial AK. Se puede observar que durante los dos años, los valores promedios mensuales de INR se encontraban dentro de los límites establecidos por el fabricante (2,6 y 3,1). 37

5 La tabla 1 recoge los valores de referencia de INR, el porcentaje de actividad de coagulación y el coeficiente de variación de la mezcla de plasma de pacientes anticoagulados, así como las cifras ofertadas por el fabricante del plasma AK. Se encontró, en el caso de Thrombotest/ mezcla de plasma anticoagulado preparado en el laboratorio, que los valores del rango recomendado para el INR fueron similares a los obtenidos con Thrombotest/plasma comercial. En ambos casos el coeficiente de variación fue menor de 5,0 %. La figura 2 muestra cómo se comportó mensualmente el control de la calidad durante un año. Se encontró que cada mes los valores promedio de INR obtenidos con el plasma anticoagulado preparado bajo las condiciones del laboratorio se encontraban entre 2,7 y 3,0, rango similar al establecido por fabricante del plasma comercial (2,6 y 3,1) utilizado. Se puede observar que los valores de INR del plasma preparado tuvieron una tendencia de aproximadamente 2,85. 38

6 La tabla 2 recoge los valores de ISI local obtenidos gráficamente al utilizar el método manual y los coagulómetros Trombotrack, así como el KC4, además del valor del TP del plasma normal específico del laboratorio (TPNM). Para ambos parámetros se muestran los valores reportados por el productor del reactivo TPL para el lote utilizado. Al comparar los métodos entre sí se encontró que el valor de ISI fue similar al reportado por el fabricante; sin embargo, se apreció un ligero aumento de la cifra del TPNM en todos los casos, que osciló entre 38 y 46,3. Este valor extremo fue obtenido cuando se utilizó el coagulómetro KC4. DISCUSIÓN Es conocido que la respuesta individual del paciente al uso de los ACO es muy variada, y el hecho de existir un elevado riesgo de morbi-mortalidad asociado a las complicaciones que generan su uso hace necesario realizar un control de laboratorio, de este tratamiento, mediante la determinación del TP, de forma periódica y sistemática. Los resultados de este control deben estar siempre avalados por el control de calidad, tanto interno como externo, de estas determinaciones, ya que ambos procedimientos son complementarios. En estos momentos Cuba no cuenta con los 39

7 recursos suficientes para instaurar un sistema de control de calidad externo adecuado; sin embargo, como parte de la estandarización de los laboratorios que se dedican a esta función, se debe realizar al menos el control de calidad interno, que abarque tanto la fase pre-analítica como la analítica, para aspirar a resultados confiables. El control de calidad interno incluye el control de la precisión y también de la exactitud de los TP. La exactitud debe ser determinada con el uso de plasma normal y plasma anticoagulado con diferentes rangos, o sea, con valores conocidos de INR bajos y altos. 4-6 En el presente trabajo se utilizó plasma control anticoagulado AK comercial con valores de INR conocidos (entre 2,6 y 3,1). Las determinaciones realizadas con dicho plasma se mantuvieron dentro de los límites establecidos por el fabricante, y el coeficiente de variación de los INR fue de 2,9 %, lo cual indica una buena exactitud y precisión de la metodología, lo que garantiza la confiabilidad de los resultados para este tipo de prueba en el laboratorio. 7 Las determinaciones realizadas con la mezcla de plasma anticoagulado obtenido en el laboratorio se mantuvo siempre dentro del rango establecido para esta preparación, el cual fue similar al señalado por el fabricante del plasma comercial AK. El coeficiente de variación menor de 5,0 % indica la precisión de las determinaciones del TP. La mezcla de plasma se comportó de forma estable, lo cual permitió su uso posterior en el control de calidad. Para automatizar las determinaciones del TP mediante el uso de coagulómetros se hace necesario recalcular el ISI del reactivo TPL. La determinación del ISI con el uso del protocolo convencional indicado por la OMS 8 para cada coagulómetro es impracticable como rutina en los laboratorios, debido a que implica la toma de muestras de sangre a un número elevado de pacientes y de donantes sanos, además del costo y la dificultad para obtener la TPL de referencia de la especie requerida. Ante esto, se estableció como alternativa utilizar plasmas calibradores liofilizados. 9,10 En 1996 se inició un estudio a cargo del European Concerted Action on Anticoaulation (ECAA) que confirmó su uso en la calibración de los sistemas locales o específicos de los laboratorios. 11 En este estudio con el uso de plasmas calibradores se encontró que el valor de ISI fue similar al reportado por el fabricante en todos los casos, lo que indica que el reactivo Thrombotest mantuvo su elevada sensibilidad localmente, a pesar de que la literatura reporta que de forma general el uso de coagulómetros reduce su valor Sin embargo, el valor más elevado de TPNM obtenido cuando se utilizó el coagulómetro KC4 sí es un elemento a tenerse en cuenta al aplicar las fórmulas: R= Tiempo de protrombina del paciente TPNM INR= Antilog (log R x ISI) El cálculo del INR podría resultar con cambios de su valor y la consecuente variación de la dosificación del anticoagulante. CONCLUSIONES La introducción de la Razón Internacional Normalizada (INR) constituye una forma correcta de expresión de los resultados del tiempo de protrombina para el control del tratamiento con anticoagulantes orales. En este caso es importante estandarizar localmente el uso de reactivo tromboplastina de alta sensibilidad, lo cual resulta necesario para el control de este tratamiento, tanto por el método manual como mediante el uso de coagulómetros. También se debe introducir un sistema 40

8 adecuado de control de calidad interno. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Fernández MA. Control de laboratorio. Fase preanalítica: punción venosa y punción capilar. Fase analítica: tromboplastinas, cálculo del ISI. El INR. Coagulómetros. Estandarización. Control de calidad. En: Fernández MA ed. Anticoagulantes orales. Valencia: Toni Burguera; 2005.pp: Martínez Brotóns F. Gestión de una unidad de control de terapéutica anticoagulante oral. En: Fernández MA ed. Simposium internacional sobre la utilización de los anticoagulantes orales en Europa. Barcelona: Instituto de Hemoderivados Immuno; 1994.pp: López Fernández MD, Puime Montero P, Galego Feal P. Aproximación al tratamiento anticoagulante oral y nuevas posibilidades de seguimiento. Rev Galega Actual Sanit. 2002;1(5): Preston FE. Quality control and oral anticoagulation. Thromb Haemost. 1995; 74(1): Jackson CM. Monitoring oral anticoagulant therapy-inr values for the prothrombin time. Thromb Haemost. 2004;91: Ansell J, Hirsh J, Hylek E, Jacobson A, Crowther M, Palareti G. Pharmacology and Management of the Vitamin K Antagonists. Chest. 2008;133;160S-198S. 7. Thielmann K. Principios de metodología en Bioquímica Clínica. Organismos ed. Instituto cubano del libro; 1973.p WHO Expert Commitee on Biological Standardization 46 th Technical Report. Geneva, World Health Organization Requierements for thromboplastins and plasmas used to control oral anticoagulant therapy. WHO Tech. Rep Serie 873: Clarke K, Taberner DA, Thomson JM. An assessment of value of calibrated lyophilised plasmas to determine the international sensitivity index for coagulometer systems. J Clin Pathol. 1992;45: Moritz B, Lang H. AK calibrants. A step forward in the standardization of the INR. Ann Hematol. 1995;70:A Poller L, Barrowclifrfe TW, van den Besselaar AMHP, Jespersen J, Tripodi A, Houghton D. European Concerted Action on Anticoagulation. Evaluation of a set of lyophilized normal plasmas to establish the normal prothrombin time for coagulometer systems. Thromb Haemost. 1998;79: Poller L, Triplett DA, Hirsh J, Carroll J, Clarke K. The value of plasma calibrants in correcting coagulometer effects on international normalized ratios. Am J Pathol. 1995;103: Poller L. International Normalized Ratio (INR): the first 20 years. J. Thromb Haemost. 2004;2:

9 14. Poller L, Houghton D, Carroll J, Clarke K. The reliability of the mean normal prothrombin time of fresh plasmas and of the normal value from lyophilized normal plasma in prothrombin ratio determination. Br J Haematol. 1999;88: Recibido: 4 de octubre de Aprobado: 20 de noviembre de Dra. Olga S. Pantaleón Bernal. Departamento de Bioquímica. Instituto Nacional de Angiología y Cirugía Vascular (INACV). Calzada del Cerro 1551 esquina a Domínguez. Cerro. CP: Ciudad de La Habana. Cuba. Teléfono: Correo electrónico: opantal@infomed.sld.cu 42

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