PRACTICA Núm. 19 DETERMINACION DE ESTREPTOCOCOS FECALES EN AGUA

Transcripción

1 PRACTICA Núm. 19 DETERMINACION DE ESTREPTOCOCOS FECALES EN AGUA I. OBJETIVO Investigar la presencia de Estreptococos fecales en una muestra de agua mediante la técnica del Número Más Probable (NMP) usando tubos múltiples. II. INTRODUCCION Se denominan Estreptococos Fecales aquellas bacterias de forma cocacea Gram positivas, aerobias o anaerobias facultativas, catalasa negativas que fermenten la glucosa con producción de ácido a 37 C en un período máximo de 48 h. En la denominación general de Estreptococos Fecales se encuentran aquellos estreptococos poseedores de la sustancia antigénica característica del grupo D de Lancefield, comprenden, desde el punto de vista taxonómico las especies: Streptococcus faecalis (y sus variedades), Streptococcus faecium, Streptococcus durans, Streptococcus boris y Streptococcus equinus. Grupo de Enterococos. Los enterococos son un subgrupo de estreptococos fecales, formado por S. faecalis, S. faecium, S. gallinarum y S. avium. Los enterococos se diferencian del resto de los estreptococos por su capacidad para crecer en Cloruro de Sodio al 6.5% a un ph de 9.6 y a 10 C y 45 C. La porción de enterococos que integra al grupo de estreptococos fecales es un valioso indicador bacteriano, útil para determinar la amplitud de la contaminación fecal de las aguas recreativas. La técnica del tubo múltiple se aplica sobre todo a las aguas residuales y sedimentos no tratados y clorados y también en aguas dulces y marinas. En la determinación de Estreptococos Fecales, la prueba presuntiva consiste en poner de manifiesto en los tubos correspondientes la aparición de turbidez y/o sedimento. Se podrán confirmar los tubos positivos por resiembra en un caldo más selectivo para poner nuevamente de manifiesto la aparición de turbidez y/o sedimento 129

2 típicos y realizar, a continuación, su valoración. III. MATERIAL Y SUBSTANCIAS Muestras de agua de diferente origen, de un volumen mínimo de 100 ml. 5 Tubos de 20 x 180 mm conteniendo 20 ml de caldo de glucosa-fosfato-azida (Rothe) estéril de doble concentración. (Apéndice A) 10 Tubos de 18 x 150 mm conteniendo 10 ml de caldo de Rothe estéril de concentración sencilla. 1 Pipeta de 10 ml graduada en décimas, estéril. 2 Pipetas de 1 ml graduadas en décimas, estériles. 10 Tubos de 18 x 150 mm conteniendo 10 ml de caldo de glucosa-fosfato azida-etil-violeta, EVA, (Litsky) estéril de concentración sencilla. (Apéndice A) Mechero Bunsen. Cerillos ó encendedor. Asa bacteriológica. Gradillas para tubos de 18 x 150 y de 20 x 180 mm. Agitador de tubos Vortex. Incubadora a 37 C. IV. TECNICA PRUEBA PRESUNTIVA: Todas las operaciones deberán efectuarse en absolutas condiciones de asepsia. 1. Preparar tres series sucesivas de 5 tubos con caldo Rothe, una de doble concentración y las otras dos de concentración sencilla. 2. Etiquetar las series con 10, 1 y 0.1 ml, respectivamente. 3. Agitar vigorosamente la muestra por lo menos 20 veces antes de tomar el volumen que se va a inocular, a efecto de homogeneizar. 4. Antes y después de realizar las inoculaciones, la boca del frasco de la muestra deberá ser flameada con objeto de evitar contaminación. 5. Inocular con una pipeta de 10 ml este volumen de muestra en la serie de tubos con caldo de doble concentración, con otra pipeta de 1 ml para 1 ml de muestra en la segunda serie de tubos con caldo de concentración simple. 130

3 6. Igualmente con la misma pipeta podrá inocularse la tercera serie de tubos con 0.1 ml de muestra. NOTA: Normalmente, siempre que no se sospecha que el agua contenga elevada carga bacteriana, solo se inoculan estas tres primeras series de tubos. En caso contrario, será necesario inocular otras series y por lo tanto, realizar diluciones de la muestra original. 7. Incubar todos los tubos a una temperatura de 37 C (± 1 C) durante h. 8. Después de 24 h de incubación, hacer una primera lectura. La reacción positiva de algún tubo se pone de manifiesto por la aparición de turbidez y/o sedimento en el fondo del mismo. Con los tubos que en este momento resulten positivos se puede empezar a la realización de la prueba confirmativa. 9. En caso de no apreciarse crecimiento se llevan a incubación por 24 horas más, es decir un total de 48 horas (± 3h) después de las cuales se efectúa la lectura final. 10. Si pasado el período de 48 h no ha habido crecimiento (turbidez y/o sedimento) en ninguno de los tubos se consideran definitivamente como negativos. INTERPRETACION: Si el total de tubos son NEGATIVOS: El examen se da por terminado, reportando la AUSENCIA ESTREPTOCOCOS FECALES en la muestra analizada. Todos aquellos tubos POSITIVOS se anotarán convenientemente por orden de mayor a menor dilución y se procederá a realizar la PRUEBA CONFIRMATORIA para ESTREPTOCOCOS FECALES. (Fig. 19.1) PRUEBA CONFIRMATORIA PARA ESTREPTOCOCOS FECALES: 1. Se preparan tanto tubos de caldo glucosa-fosfato azida-etil-violeta, EVA, (Litsky), como tubos hayan resultado positivos en la lectura de la prueba presuntiva, rotulando los tubos adecuadamente para evitar errores en la lectura. 131

4 2. A partir de cada uno de los tubos que han resultado positivos en la prueba presuntiva, agitándolos previamente para homogeneizar, inocular con tres asadas, tubos conteniendo caldo de Litsky. 3. Incubar a 37 C (± 1 C) durante 48 horas (± 3h). Se puede hacer una primera lectura a las 24 horas. NOTA: Se consideran tubos positivos aquellos que presenten turbidez y/o sedimento típico de color violeta. 4. Finalizando el período de incubación (48 h) se hará la lectura final. INTERPRETACION: Si se observa turbidez y/o sedimento: La prueba se considera POSITIVA, debiendo anotar el número de tubos positivos para posteriormente hacer el cálculo del NMP. Si en ninguno de los tubos se observa turbidez y/o sedimento: Se consideran negativos, estableciéndose el código 0,0,0 para el cálculo correspondiente. ELABORACION Y PRESENTACION DE RESULTADOS. La valoración por medio de la tabla del número más probable se realiza a partir del recuento del los tubos de cada serie que han resultado positivos después de la prueba de confirmación de la manera como se hace para coliformes totales y fecales. Si únicamente se han inoculado las primeras series de 10 ml, 1 ml y 0.1 ml el resultado leído en la tabla correspondiente será el NMP en 100 ml de muestra. En cambio si se han efectuado diluciones se leerá en la tabla el valor del NMP y se dividirá por el volumen real de muestra inoculada en los tubos de las serie central del triplete elegido (dilución promedio). El resultado obtenido se presentará de la siguiente manera: 132

5 NMP de estreptococos fecales: /100 ml EJEMPLO: Los resultados obtenidos en la determinación de estreptococos fecales mediante el método de las diluciones sucesivas es el que se especifica en la siguiente tabla: Volumen de muestra inoculada (ml) Denominación de la serie de 5 tubos. 1-EF 2-EF 3-EF Tubos positivos en la prueba presuntiva Tubos positivos en la prueba confirmativa Se procede a la lectura en la tabla del NMP del código 4,1,0 que corresponde al valor de 17 el cual deberá dividirse por el volumen real de muestra inoculado en la serie central del triplete escogido, es decir, el correspondiente a la dilución promedio que es (dilución 1/1000). Por tanto se tiene: 17 / = 17 x 1000 = 17,000 El resultado se expresará: NMP de estreptococos fecales: 17,000/100 ml. V. CUESTIONARIO 1. Por qué se considera a Streptococcus faecalis un indicador de contaminación fecal? 2. En qué tipos de aguas es importante determinar la presencia de Enterococos? 3. Dibujar la morfología y agrupación que presenta Streptococcus faecalis. 4. Investigar el valor máximo permisible de Enterococos en aguas dulces recreativas y en aguas marinas. 5. Qué otro microorganismo no coliforme, es importante investigar en un agua de piscina? 133

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