CUESTIONES. 1. Por qué la PCR convencional no es cuantitativa?

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1 2º BIOQUÍMICA

2 CUESTIONES 1. Por qué la PCR convencional no es cuantitativa? En la PCR convencional, la cuantificación del ADN de la muestra es complicada debido a que la eficacia de amplificación va disminuyendo con el tiempo, hasta que la reacción llega a una fase de saturación en la que ya no se produce incremento de ADN. Además, la cantidad de ADN amplificado se detecta al final de la PCR cuando la mayoría de reacciones han alcanzado ya la fase de saturación y por tanto, la cantidad de ADN obtenido no guarda mucha relación con la concentración inicial de ADN en la muestra. La PCR a tempo real en cambio, si es cuantitativa ya que permite saber la cantidad de ADN tras cada ciclo de amplificación, debido a que dicho ADN está marcado con fluorescencia. 2. Componentes de la PCR. En la PCR podemos diferenciar los siguientes componentes: - Tampón: buffer de amplificación. Los más utilizados contienen KCl, Tris y MgCl 2. Éste último es esencial para la actividad de la Taq polimerasa ya que el Mg 2+ actúa como cofactor de ésta. No obstante, hay que tener cuidado con las cantidades de Mg ya que un exceso de este dará lugar a productos inespecíficos y a una cantidad insuficiente. - Primers o cebadores: deben ser complementarios a cada uno de los extremos 3' de la región que queremos amplificar y son necesarios para la actividad de la polimerasa. - Desoxinucleótidos trifosfatos (dntps): son necesarios para que la polimerasa los use como sustrato y pueda llevar a cabo la reacción de amplificación. Se añaden los cuatro tipos de dntps que componen el ADN en una mezcla equimolar. - Taq-polimerasa: polimerasa resistente a las altas temperaturas a las que vamos a someter nuestro tubo de reacción. Es una polimerasa aislada de la bacteria termoresistente, Thermus aquaticus. - ADN muestra: ADN que queremos amplificar. 2

3 3. Por que son necesarios tres tipos de cebadores en la RT-PCR?, para qué sirven cada uno de ellos? - Random primers pd (N) 6: son cebadores cortos (10 KB) que se utilizan para secuenciar al azar cuando el ADN es desconocido. El cebador se unirá al ADN patrón en secuencias complementarias de ubicación desconocida, por lo tanto no se conocerá la naturaleza de los productos obtenidos. - Oligo (dt): se unen a las colas de poli (A) presentes en los mrnas. Se utilizan para secuenciar RNAm. - Cebadores específicos: se utilizan para secuenciar ADN conocido. Tienen una secuencia complementaria a dicho ADN. 4.- Fundamentos para la cuantificación de RNA por PCR a tiempo real Permite cuantificar, la cantidad de ADN o ARN amplificado en cada momento mediante el marcaje con fluorocromos y detectar la fluorescencia emitida cuando se genera el fragmento específico durante la amplificación. Existen diversos formatos de detección: - Uso de moléculas fluorescentes que se intercalan en el ADN de cadena doble. Ej. SYBR-GREEN: - Doble sonda marcada o sondas de hibridación (sondas "LightCycler"). En este caso se emplean dos sondas marcadas con moléculas fluorescentes en posición 5' (sonda A) y 3' (sonda B) y que hibridan en regiones adyacentes del DNA diana. Cuando se produce la hibridación, la primera sonda emite fluorescencia que excita al colorante de la segunda sonda, produciendo una señal detectable 3

4 - Cebadores fluorescentes ("Molecular Beacons"). En estos tipos, la molécula fluorescente y la molécula que absorbe la fluorescencia se mantienen próximas mediante la formación de una horquilla de hibridación. Esta horquilla se abre durante la amplificación, aumentando la emisión de fluorescencia. - Sondas Taqman. Diseñadas por Applied Biosystems, hacen uso de la actividad 5' exonucleasa de la Taq (Thermus aquaticus) DNA polimerasa. Estas sondas tienen un marcador fluorescente en el extremo 5' y una molécula que absorbe ("quencher") la fluorescencia emitida por el marcador en el otro extremo. La sonda hibrida con el fragmento específico (si está presente) y, a medida que se sintetiza la hebra complementaria al fragmento, la sonda se va degradando por la acción exonucleasa, liberando el marcador que ahora sí emite fluorescencia. -Fundamentos para la cuantificación de RNA por PCR a tiempo real En la RT-PCR el molde inicial es ARN y mediante la retrotranscriptasa se obtiene el ADNc (ADN complementario). Este ADNc es posteriormente amplificado. De esta forma, se puede medir la expresión génica mediante una técnica alternativa al Northern blot o Dot Blot, ensayos de protección de RNasa, hibridación in situ, y ensayos de nucleasa S1. 5. Universal ProbeLibrary. Ejercicio con cebadores. Cebador Sncaα: Izquierdo: 5 TGGCAGTGAGGCTTATGAAA3 Sí funciona en el ratón ya que se une desde el primer hasta el último nucleótido. No funciona en la rata porque no se une en todos los nucleótidos. Derecho: 5 GCTTCAGGCTCATAGTCTTGG3 Funciona tanto en rata como en ratón ya que en ambos casos se une desde el primer hasta el último nucleótido. Este cebador sólo funciona en ratón. Cebador DCX: UP: 5 GCATTACTTGTGAGGCATTTTGGAG3 Sí funciona en el ratón ya que se une desde el primer hasta el último nucleótido. No funciona en la rata porque no se une en todos los nucleótidos. 4

5 DOWN: 5 GGGAGATTAACGGTCACAGGAGAT3 Sí funciona en el ratón ya que se une desde el primer hasta el último nucleótido. No funciona en la rata porque no se une en todos los nucleótidos. Este cebador sólo funciona en ratón. RESULTADOS Aislamiento de ARN Para ver si hemos aislado con éxito ARN de los centros de cerebro de rata se llevó a cabo una PCR. Los resultados son los siguientes: Nosotros cargamos en el pocillo 7 en el que no se observa ARN pero esto puede ser debido a contaminación por ARNasas. Pocillo 7 RT-PCR con β-actina Para comprobar si en el aislamiento de ARN anterior, no aparecía nada porque ha sido degradado por contaminación con ARNasas o porque verdaderamente no hemos aislado ARN, se realizó una RT-PCR en la que se empleó β-actina como housekeeper. Pocillos 9 y 10 5

6 En nuestros pocillo 9 y 10 se observan dos bandas de igual tamaño aproximadamente, lo que indica que hemos partido de la misma concentración inicial de cdna. Además esto indica que sí habíamos aislado ARN anteriormente por lo que su ausencia se debe a una degradación por RNAasas. PCR Inespecífica Bandas específicas En la fotografía se aprecian bandas inespecíficas y bandas específicas. Las bandas inespecíficas se observan a bajas temperaturas de Annealing ya que los cebadores se unen inespecíficamente. PRC convencional de TH Esta PCR ha salido mal en general. A 28 ciclos debería haber salido, el problema puede haber sido una contaminación por estándar interno que es una molécula muy volátil. 6

7 PCR competitiva (muestra 1) En esta PCR lo que se ha hecho es añadir a la muestra un estándar interno a diferentes concentraciones: 70, 700 y 7000 fentogramos/??. El tubo al que añadimos el estándar menos concentrado dará lugar a una banda grande de ADN de la muestra y a una pequeña del estándar interno mientras que el tubo al que añadimos el estándar más concentrado dará lugar a una banda grande de estándar interno y auna pequeña de ADN de la muestra, ya que compite más el estándar interno. Los resultados se recogen en la siguiente fotografía, donde la banda superior es ADNc y la banda inferior es el estándar interno: A continuación medimos la DO del ADNc y la del estándar interno de manera que la relación DO de estándar interno/ DO del ADNc será mayor mientras más estándar interno haya y al representar gráficamente dicha relación frente a la concentración de estándar interno obtenemos una recta: 7

8 y = mx + b En el punto en que DO estándar interno / DO ADN c = 1: m= 0.766; b= -2.4 log (DO estándar interno / DO ADN c) = log Estándar interno log (1) = log Estándar interno = log Estándar interno log Estándar interno = 2.4 / = Estándar interno = fentogramos PCR competitiva (muestra 2) 8

9 Procediendo de la misma manera que en el caso anterior obtenemos: y = mx + b En el punto en que DO estándar interno / DO ADN c = 1: m= 0.65; b= log (DO estándar interno / DO ADN c) = log Estándar interno log (1) = 0.65 log Estándar interno = log Estándar interno log Estándar interno = 1.82 / 0.65 = 2.8 Estándar interno = fentogramos / = 1.99 veces mayor la expresión de TH en la muestra 1 que en la muestra 2. 9

10 PCR a tiempo real Nuestro SYBR-GREEN de Roche estaba en mal estado y por tanto la RT-PCR no ha salido bien. Para el SYBR-GREEN de BR el experimento sí ha tenido éxito. Unos de los datos obtenidos en con éste SYBR-GREEN son los siguientes: M o / R o = 2 - C = 2 (C t muestra C t referencia) C t referencia = 6.44 C t muestra 1 = C t muestra 2 = M 1 / R o = - 2 ( ) = M 1 M 2 / R o = - 2 ( ) = = 7.55 M 2 La muestra 1 tiene 7.55 veces más que la muestra 2. 10

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