AQUAGESTION. ISAv: Un acercamiento actualizado en la detección de sus variantes en la región. Departamento de Desarrollo y Laboratorio Diagnóstico.

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1 AQUAGESTION ISAv: Un acercamiento actualizado en la detección de sus variantes en la región. Departamento de Desarrollo y Laboratorio Diagnóstico. Noviembre 2011

2 ACTUALIDAD Este año Sernapesca confirma y oficializa la presencia de virus ISA, en su a la variante HPR2. La presencia de positividad del virus ISA se detectó en tres de las 16 jaulas del centro de cultivo, según los resultados de las correspondientes muestras de laboratorio dispuestas por el Sernapesca. De acuerdo a lo establecido en el Programa Sanitario Específico de Vigilancia y Control de ISA, Sernapesca determinó la eliminación de los peces de las jaulas positivas, activando así sus medidas preventivas en casos como estos. El HPR2, de acuerdo a Sernapesca, es una de las variantes del virus ISA que produce baja mortalidad y menor signología en salmón del atlántico, cuya especie es la más susceptible de contraer esta enfermedad. PROCEDIMIENTO PLAN DE CONTINGENCIA ISAv De acuerdo a la normativa actual el procedimiento para el programa de contingencia ISAv, funciona de la siguiente forma: 2 Figura 1. Procedimiento plan de contingencia.

3 TECNICA DE DETECCIÓN PCR Tiempo Real (Snow et al., 2006), segmento 8 La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se basa en la amplificación exponencial de un fragmento específico de ADN, utilizado como molde para generar millones de copias. El PCR en tiempo real se diferencia del PCR convencional en que permite monitorear en cada ciclo la aparición del ADN producto de la reacción mediante el uso de fluoróforos. Cada vez que se realiza una copia del ADN molde se libera fluorescencia, por lo que ésta es proporcional a la cantidad de ADN generado. Además, el sistema de PCR a tiempo real proporciona mayor sensibilidad y robustez, con la posibilidad añadida de cuantificar la cantidad inicial de ADN target presente en la muestra. En el caso de los virus de RNA, se realiza previo al PCR, una trascripción reversa o RT. 3 Figura 2. Esquema de pasos para la realización de PCR Tiempo real Grafico 1. Efectos durante el PCR Tiempo real De acuerdo al tiempo y la temperatura El resultado de un PCR a tiempo real se visualiza en un gráfico de amplificación (Gráfico 2). En él se expresa la fluorescencia leída por el termociclador en el eje de las ordenadas y el número de ciclos de la PCR en el eje de las abscisas. De esta forma, la curva de amplificación consta de una fase inicial donde la producción de fluorescencia (ADN producto) está por debajo del nivel de detección del termociclador, una segunda fase en la que se da un incremento de la fluorescencia, el cual es en forma exponencial en su inicio, y una tercera fase (plateau) donde finaliza la reacción y se estabiliza la fluorescencia.

4 Grafico 2. Amplificación de PCR en tiempo real mostrando las 3 fases de las que consta. El punto de intersección de una curva de amplificación con el umbral se denomina Ct (Threshold Cycle). Este punto indica el ciclo en el que la fluorescencia alcanza el valor umbral. Cuanto más ADN inicial tenga la muestra antes se alcanza este valor, pues será menor el número de ciclos necesarios (Ct menor) para ello (Gráfico 2). Si la eficiencia de la reacción es óptima, cada vez que se diluye una muestra 10 veces el valor de Ct aumenta aproximadamente 3,3 ciclos. 4 VARIANTE DEL VIRUS ISA Los dos linajes principales del ISAv son los genotipos europeos (genotipo I) y el genotipo americano (genotipo II). Existen varias clases dentro de estos genotipos. Para clasificar las cepas en grupos numerados, se puede utilizar una pequeña región altamente polimórfica (highly polymorphic región, HPR) de la hemaglutinina esterasa viral (una glicoproteína superficial codificada por el segmento genómico 6). Ambas regiones le otorgan el grado de virulencia al virus. Figura 3. Estructura de ISAv, con su región HPR

5 TECNICAS DE RECONOCIMIENTO HPR 0 a) RT-PCR Real Time (HPR0) El PCR Real Time (HPR0) tiene el mismo Principio de ISA-Snow, sonda TaqMan. Su fin es determinar si el material genético encontrado corresponde a ISA HPR0 o no. Se utiliza una sonda específica Se utiliza como controles positivos un HPR7 (C+7) y un HPR0 (C+0). En este caso la curva perteneciente a las muestras no se levanta y se mantiene en la base, junto al control positivo (C+7) y al control (C-), lo que indica que no corresponde a HPR0, ya que no presenta el mismo comportamiento que las curvas de los controles positivos (C+0), correspondientes a las líneas naranja y lila (en duplicado). c+7 Muestras C- 5 Gráfico 3. Curva de PCR Tiempo Real para HPR0.

6 b) RT-PCR Convencional (HPR0) Esta técnica tiene por objeto visualizar los productos de PCR. Para ello se realiza una separación electroforetica (en gel de agarosa) donde los productos de PCR se separan de acuerdo a su tamaño y migran a lo largo del gel según su carga. Productos de PCR con menos pares de bases (pb) migran mas abajo que los que tienen mayor número, los cuales van quedando en la parte superior del gel. Muestras Control (+)7 Control (+)0 - HPR 0 (+) Campo eléctrico Migración Figura 4. Electroforesis de RT PCR HPR convencional. La figura corresponde a los resultados del análisis de tres Muestras, cuyos resultados son todos positivos a HPR Muestras Negativas Campo eléctrico Banda bajo C + 0 Si bien, la muestra coincide con C+7 se requiere de confirmación de serotipo a través de secuenciación Figura 5. Electroforesis de RT PCR HPR convencional. Los resultados muestran que 2 de las muestras (carril 1 y 2) son completamente negativas. Sin embargo las muestras 3 y 4 (carril 3 y 4) sí son negativas a HPR0.

7 SECUENCIACION Cada Peak representa una determinada base nitrogenada Perfil Este perfil es entregado por un secuenciador Secuencia El perfil se traduce luego a esta secuencia Alineamiento BlastX en banco de datos de genes NCBI La secuencia es analizada por un software que encontrara la secuencia exacta, que determine a que HPR corresponde 7 Secuencia de 41 aminoácidos para HPR0 Secuencia de menos de 41 aminoácidos para otro serotipo de HPR en este caso HPR2

8 HPR 0 Y HPR2 HPR0 En Chile, en los últimos meses, se observo un aumento en la detección de ISA HPR0, específicamente en la zona de Aysen. La aparición de esta variante en chile, fue de menor impacto que aquel que provoco la aparición de ISA HPR7b, pues a diferencia de este último la variante HPR0 no es mortal ni causa signología clínica en los peces. HPR2 Según un estudio realizado en la Bahía de Fundy, Canadá, por Johnson et al., 2008, la variante HPR2 (que se encuentra localizada en una zona especifica), habita con otro serotipo, el HPR4 De estos dos serotipos, el estudio señala que el HPR2, produce baja mortalidad, menor signología clínica y comparativamente es menos virulento que HPR4. Sin embargo, existen factores pueden aumentar la mortalidad de HPR2, según los manejos que se lleven a cabo en área del cultivo. 8 Figura 6. Mapa de centros positivos en la Región de Aysen. Los puntos azules indican los centros que a la fecha se encuentran positivos a HPR0, considerando sólo los registros de laboratorio de Aquagestión..

9 Las siguientes secuencias aminoacídicas de los serotipos de HPR del gen de la hemaglutinina esterasa, han sido publicadas, y en ellas podemos ver las diferencias existentes entre las variantes HPR2 y HP7b. 9

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